专利名称：产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法。
背景技术：
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides, L.M.)是用于生产右旋糖酐最常见的菌种，其分泌的右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase, DSase, EC2.4.1.5)是一种糖基转移酶，可以催化D-吡喃葡萄糖基从蔗糖转移到右旋糖酐链上，从而使产物的分子量不断增力口。在酶法制备右旋糖酐的研究中，高产酶菌株的获得是整个发酵过程的基础与关键。然而，从自然界筛选得到的肠膜明串珠菌(野生菌)往往存在产酶少、酶活力低的缺陷，为获得高产右旋糖酐酶的菌株，需要运用各种技术对原始菌株进行改造，以提高其产酶性能。目前国内几大菌种保藏中心所藏的肠膜明串珠菌在43号液体培养基中产酶活力仅为I 2U/
mLo国内对肠膜明串珠菌的改造或诱变的研究并不多，也有研究者通过基因工程技术构建了产右旋糖酐蔗糖酶的工程菌且其产酶活力得到了大幅提高，但基因工程技术成本较高，对操作人员要求也高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简单的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，以提高肠膜明串珠菌的产酶能力。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，包括以下步骤: (I)肠膜明串珠菌的葡萄糖耐受性培养；(2)肠膜明串珠菌的复壮培养；( 3 )肠膜明串珠菌的产酶培养。葡萄糖耐受性培养是原始肠膜明串珠菌取种，接种于以葡萄糖为唯一碳源的培养基中培养48 60h。葡萄糖耐受性培养的培养基配方为:葡萄糖100 120g/L，KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨1.5 2g/L，酵母膏8 10g/L，琼脂16 20g/L，蒸馏水1L，ρΗ7.0 7.2。复壮培养是选取耐受性培养后茁壮的单菌落接种于43号培养基进行培养24 48h。复壮培养的培养基(43号培养基)配方为:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨 2g/L，琼脂 20g/L，蒸馏水 1L，ρΗ7.0 7.2。产酶培养经历种子培养基培养和产酶培养基培养两个阶段；选取复壮培养后茁壮的单菌落接种于种子培养基，待菌种繁殖至对数期时，以2%ν/ν的接种量接种于产酶培养基，培养21 25h后对培养液以12000r/min、4°C、30min的条件进行离心去除菌体，收集上清液即为右旋糖酐蔗糖酶酶液。种子培养基的配方为:蔗糖50 60g/L，KH2P040.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨2 2.5g/L，酵母膏8 10g/L，蒸馏水1L，pH6.8 7.0 ;产酶培养基的配方为:蔗糖 50 60g/L, KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨 1.5 2g/L，酵母膏8 10g/L，牛肉膏8 10g/L，蒸馏水1L, ρΗ6.8 7.0。上述固体培养基培养菌种的条件为25±3°C ;液体培养基培养菌种的条件为25 ± 3°C、150 土 50r/min，装液量为所盛容器标准容量的20%。针对目前产右旋糖酐蔗糖酶菌种产酶性能、改造成本高等问题，发明人利用微生物与环境“和谐相处”、“趋利避害”的生物性能，建立了本发明优良菌种的选育方法:先对肠膜明串珠菌进行葡萄糖耐受性培养得到葡萄糖耐受菌，选取茁壮单菌落用高含蔗糖的43号培养基进行复壮培养，再经营养更为丰富的种子培养基、发酵培养基的扩大培养，获得高酶活力的右旋糖酐蔗糖酶酶液，其酶活力可达8.4U/mL,比原肠膜明串珠菌所产酶的酶活力高出120%以上，为后续药用右旋糖酐的生产提供了高效的酶催化剂。本发明成本低廉、操作简单，所得菌种的产酶能力可基本满足工业化生产需要。
具体实施例方式以下实施例使用固体培养基(平板或斜面)培养菌种的条件为25±3°C;液体培养基培养菌种的条件为25±3°C、150±50r/min，装液量为所盛容器标准容量的20%。实施例1从斜面保存的原始肠膜明串珠菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号21724，酶活力约在I 2.5U/mL)取种，接种于葡萄糖耐受性培养基平板，置于25°C培养箱中培养60h ;从耐受 性培养基平板上选取耐受性培养后茁壮的单菌落接种于43号培养基平板，置于25°C培养箱中进行复壮培养36h ;选取复壮培养后茁壮的单菌落接种于种子培养基，待菌种繁殖至对数期时(发酵液在600nm处的吸光值为0.4左右)，以2% (v/v)的接种量接种于产酶培养基，培养21h后对培养液以12000r/min、4°C、30min的条件进行离心去除菌体，收集上清液即为右旋糖酐蔗糖酶酶液。酶液经DNS法测其酶活力为8.4U/mL。本例培养基配方如下:葡萄糖耐受性培养的培养基:葡萄糖100g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏10g/L，琼脂20g/L，蒸馏水1L，ρΗ7.0。复壮培养的培养基:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，琼脂20g/L，蒸馏水 lL，pH7.0。种子培养基:蔗糖50g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨 2g/L，酵母膏 8g/L,蒸懼水 1L, pH6.8。产酶培养基:蔗糖50g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨 2g/L，酵母膏 8g/L，牛肉膏8g/L，蒸馏水lL，pH6.8。实施例2从斜面保存的原始肠膜明串珠菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号21724，酶活力约在I 2.5U/mL)取种，接种于葡萄糖耐受性培养基平板，置于26°C培养箱中培养48h ;从耐受性培养基平板上选取耐受性培养后茁壮的单菌落接种于43号培养基平板，置于25°C培养箱中进行复壮培养38h ;选取复壮培养后茁壮的单菌落接种于种子培养基，待菌种繁殖至对数期时(发酵液在600nm处的吸光值为0.4左右)，以2% (v/v)的接种量接种于产酶培养基，培养21h后对培养液以12000r/min、4°C、30min的条件进行离心去除菌体，收集上清液即为右旋糖酐蔗糖酶酶液。酶液经DNS法测其酶活力为8.0U/mL。本例培养基配方如下:葡萄糖耐受性培养的培养基:葡萄糖120g/L，KH2PO40.35g/L，Na2HPO4L 45g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母膏8g/L，琼脂18g/L，蒸馏水1L，pH7.2。复壮培养的培养基:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，琼脂20g/L，蒸馏水 1L，ρΗ7.2。种子培养基:蔗糖60g/L，KH2PO40.35g/L，Na2HPO4L 5g/L，蛋白胨 2.5g/L，酵母膏10g/L,蒸懼水 1L, pH6.8。产酶培养基:蔗糖60g/L，KH2PO40.35g/L，Na2HPO4L 45g/L，蛋白胨 1.5g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏 10g/L ，蒸馏水 lL，pH7.0。
权利要求
1.一种产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于包括以下步骤: (1)肠膜明串珠菌的葡萄糖耐受性培养； (2)肠膜明串珠菌的复壮培养； (3)肠膜明串珠菌的产酶培养。
2.根据权利要求1所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于:所述葡萄糖耐受性培养是原始肠膜明串珠菌取种，接种于以葡萄糖为唯一碳源的培养基中培养48 60ho
3.根据权利要求2所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于葡萄糖耐受性培养的培养基配方为:葡萄糖100 120g/L, KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨1.5 2g/L，酵母膏8 10g/L，琼脂16 20g/L，蒸馏水lL，pH7.0 7.2。
4.根据权利要求1所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于:所述复壮培养是选取耐受性培养后茁壮的单菌落接种于43号培养基进行培养24 48h。
5.根据权利要求4所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于复壮培养的培养基配方 为:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，琼脂20g/L，蒸馏水1L，pH7.0 7.2。
6.根据权利要求1所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于:所述产酶培养经历种子培养基培养和产酶培养基培养两个阶段；选取复壮培养后茁壮的单菌落接种于种子培养基，待菌种繁殖至对数期时，以2%v/v的接种量接种于产酶培养基，培养21 25h后对培养液以12000r/min、4°C、30min的条件进行离心去除菌体，收集上清液即为右旋糖酐蔗糖酶酶液。
7.根据权利要求6所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于种子培养基的配方为:蔗糖50 60g/L，KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨2 2.5g/L，酵母膏8 10g/L,蒸懼水lL,pH6.8 7.0 ;产酶培养基的配方为:鹿糖50 60g/L, KH2PO40.3 0.35g/L, Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨 1.5 2g/L，酵母膏 8 10g/L，牛肉膏8 10g/L,蒸馏水1L, ρΗ6.8 7.0。
8.根据权利要求1至7任一所述的产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，其特征在于:固体培养基培养菌种的条件为25±3°C ;液体培养基培养菌种的条件为25±3°C、150±50r/min，装液量为所盛容器标准容量的20%。
全文摘要
本发明公开了一种产右旋糖酐蔗糖酶优良菌种的选育方法，先对肠膜明串珠菌进行葡萄糖耐受性培养得到葡萄糖耐受菌，选取茁壮单菌落用高含蔗糖的43号培养基进行复壮培养，再经营养更为丰富的种子培养基、发酵培养基的扩大培养，获得高酶活力的右旋糖酐蔗糖酶酶液，其酶活力可达8.4U/mL，比原肠膜明串珠菌所产酶的酶活力高出120%以上，为后续药用右旋糖酐的生产提供了高效的酶催化剂。本发明成本低廉、操作简单，所得菌种的产酶能力可基本满足工业化生产需要。
文档编号C12N1/20GK103243052SQ201310192348
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月22日 优先权日2013年5月22日
发明者陈山, 浦媛媛, 邹青松, 王晓, 王清, 刘玫, 张义平, 姚晓麦, 黄磊 申请人:广西大学