专利名称：乳酸杆菌菌种及其分离选育方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于动物营养学和微生态学领域，特别涉及4种在仔猪消化道内具有互作效应的乳酸杆菌菌种及其分离选育方法和用途，含该乳酸杆菌菌种的复合制剂可应用于断奶仔猪的饲料添加剂，起到仔猪防病促生长效果。
背景技术：
饲料添加剂是饲料的核心问题，药物饲料添加剂是随着上个世纪40年代初抗菌素问世后逐渐被广泛使用的。随着抗菌素品种的增多和生产水平的提高，抗菌药物的价格下降，在养殖业集约化程度日益提高的情况下，饲料中添加抗菌药物已成为提高养殖效益的一种有效手段。但是抗菌药物的耐药性和药物在动物性产品中的残留对人类具有潜在危害性。疯牛病、口蹄疫、盐酸克伦特罗中毒和“二恶英”事件等使消费者对食品安全，尤其是动物食品的安全更加重视。从上个世纪90年代以来，欧盟开始禁用和限用抗菌素作为畜禽生长促进剂的法规，2000年，欧盟做出了要在今后若干年内全面禁止抗菌素作为饲料添加剂使用的规定。我国由于饲养环境较差，对抗菌素的依赖更大，在日粮中大量使用抗菌素是限制我国畜牧业发展的重要因素和限制了我国动物产品的出口。断奶仔猪腹泻和生长受抑制是世界性的问题，由于抗菌素的不合理应用产生的耐药性问题，使治疗动物和人类疾病遇到很大困难，研究与开发抗菌素替代品是当前畜牧业和饲料工业的一个热点，益生素是公认的作为抗菌素替代品的一种制剂。但目前市场上的益生素产品作用效果不稳定是影响益生素在养殖业中广泛应用的一个重要原因，产品不稳定的原因主要有益生素产品的作用对象太广泛和产品质量不稳定变异大。
发明内容
本发明的目的在于针对仔猪消化道的生理特点，分离选育出适合在仔猪胃发挥益生作用的格氏乳酸杆菌，在十二指肠发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌，在空肠发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠发挥益生作用的发酵乳酸杆菌；通过优化上述四种乳酸杆菌的组合，可制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中；
本发明的另一目的在于，提供一种分离选育上述四种乳酸杆菌的分离选育方法；本发明的再一目的在于提供本发明的格氏乳酸杆菌的用途，即与在健康仔猪十二指肠中发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后曰粮中。
本发明的技术方案如下本发明提供的格氏乳酸杆菌，为由仔猪胃粘膜中分离选育的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)，其保藏号为CGMCC No.0840；本发明提供的格氏乳酸杆菌分离选育方法，其分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.4，再用浓盐酸调pH至4.5；并用Hungates管做成无菌厌氧滚管；取健康断奶仔猪胃底部粘膜于无菌容器中，用无菌生理盐水冲洗除去粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，将上述白色针尖大小菌落分别无菌操作转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物；将上述步骤得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤组分包括10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，蒸馏水1000毫升，并用醋酸调节pH至5.4；二、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌再进行以下选育(一)耐酸选育分别将上述乳酸杆菌24小时的培养物分别按1％接种量(乳酸杆菌与肉汤培养基的体积份配比为1∶100)接种在上述肉汤培养基中，选育出接种12-72小时后，在pH3.0的肉汤培养基中可生长的，即使肉汤变浑浊的耐酸乳酸杆菌；所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钟；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至3.0；(二)耐高铜选育将上述选育的耐酸乳酸杆菌分别与1克五水硫酸铜加热溶解后，混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出晾凉后，按1％接种量接种至肉汤培养基中，选育出接种后18-72小时能在该肉汤培养基中生长的同时耐酸和耐高铜的乳酸菌株；所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4；(三)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿；用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直；分别用上述选育出的同时耐酸和耐高铜的乳酸菌18-24小时的培养物将沟填满，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离；选育出大肠杆菌菌落距离小沟边缘最远的同时耐酸、耐高铜和抗大肠杆菌的乳酸杆菌；(四)乳酸浓度为82mg/100ml的乳酸杆菌的选育将上述同时耐酸、耐高铜和抗大肠杆菌的乳酸杆菌培养物按1％接种量接种到肉汤培养基中，培养20小时，离心，取上清液，用超纯水稀释10倍后，在Technicon RA100生化仪上用酶法测定上清液中的乳酸浓度；选育得到一株乳酸浓度为82mg/100ml的乳酸杆菌；经中国科学院微生物研究所鉴定，该乳酸杆菌为格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)；所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，混合后装进Hungates管，每管装适量肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌；中国科学院微生物研究所对该乳酸杆菌为格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)的鉴定结果如下
本发明的格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)的生物学特性为(一)耐酸存活率在pH2.0处理6小时之后的存活率为133％；其耐酸测试步骤如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后先用冰醋酸调pH至5.6，再用浓盐酸将pH调至2.0；
将制备的肉汤培养基置于Hungates管中，每个管放置20mlMRS肉汤培养基，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，凉下来后每管中加1ml的格氏乳酸杆菌培养物，在开始时和第6小时分别取样，进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果；耐酸存活率的计算公式为S酸＝n6/n0S酸为经过pH2.0处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.0处理前涂布的每ml活菌数；n6为pH2.0处理6小时的每ml活菌数，得出在pH2.0处理6小时之后的存活率为133％；(二)耐热存活率本发明的格氏乳酸杆菌的耐热存活率为72％；其耐热存活测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调pH为6.7；将制备的肉汤培养基置于Hungates管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，凉下来后每管中加1ml格氏乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数，同时将Hungates管放置在75℃水浴中加热15分钟，取样进行活菌浓度计数。取样进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果；耐热存活率的计算公式为S热＝n1/n0S热为经过75℃加热处理后的乳酸杆菌存活率；n0为加热处理前每ml的活菌数；n1为加热处理15分钟后每ml的活菌数，得出耐热存活率为72％；(三)耐贮藏存活率为38％；耐贮藏存活率测试方法如下
制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调，pH为6.7；将制备的肉汤培养基置于Hungates滚管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，凉下来后每管中加1ml乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数培养。室温下放置30天后，取样进行活菌浓度计数培养。取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150个的平皿计数，以平均值表示结果；耐贮藏存活率的计算公式为S贮＝n1/n0S贮为经过30天贮藏后的乳酸杆菌存活率；n0为贮藏前每ml的活菌数；n1为贮藏30天后每ml的活菌数，得出耐贮藏存活率为38％；(四)本发明的格氏乳酸杆菌在与大肠杆菌混合培养24小时后可使大肠杆菌(K88、K99和987P)下降105个数量级其测试方法如下(五)取5ml格氏乳酸杆菌培养物(108cfu/ml)与15ml无菌普通营养肉汤混合，制成含格氏乳酸杆菌培养物的营养肉汤，接种10％大肠杆菌培养物，大肠杆菌的起始浓度为107cfu/ml，起始培养液中格氏乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N的NaOH调培养液的pH为7.0，置37℃，2.5％CO2培养箱培养24个小时后，取出培养液，培养液经梯度稀释后，取0.3ml稀释液均匀涂布MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基置5％CO237℃培养箱培养18-48小时，取菌落数在30-150个的平皿计数，以平均值表示格氏乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中格氏乳酸杆菌的数量；同样地，在培养24小时后取出培养液稀100倍后，取0.3ml稀释液置于麦康凯琼脂上，均匀涂布，做3个平行样，将麦康凯琼脂平板置37℃，普通培养箱培养18-48个小时，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示，其结果为本发明的格氏乳酸杆菌在与大肠杆菌混合培养24小时后可使大肠杆菌(K88、K99和987P)下降105个数量级(六)本发明的格氏乳酸杆菌在培养后20小时达到的最高生长浓度为1010cfu/ml；其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，在500ml的锥形瓶里装300ml的MRS肉汤，高压灭菌并晾凉；晾凉后的肉汤培养基中接种5％的格氏乳酸杆菌培养物，分别在培养后24小时内每个小时、28、32、36、40、44、48小时取培养液进行梯度稀释后，取0.3ml各梯度稀释液注入装有MRS琼脂(pH6.5)的厌氧Hungates管中，用手轻轻滚匀，培养24-48小时计算滚管中的菌落数，以每管中菌落数在50-150个的管的梯度作为计算用，每个梯度做3个平行，以平均值表示结果，其结果为本发明的格氏乳酸杆菌在培养后20小时达到最高生长浓度为1010cfu/ml。
本发明还从健康断奶仔猪十二指肠粘膜中分离选育出一种罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)，于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》其保藏号为CGMCC No.0841；该罗伊氏乳酸杆菌的分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.0；高压蒸汽灭菌，并用Hungates管做成无菌厌氧滚管；取健康断奶仔猪十二指肠的粘膜于无菌容器中，先用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述含分离培养基的Hungates无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，在生物无菌操作下，将上述白色针尖大小菌落分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤组分10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30无水硫酸镁克，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，蒸馏水1000毫升，并用醋酸调节pH至5.4；将上述步骤得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；二、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌再进行以下选育(一)耐酸选育分别将上述乳酸杆菌24小时培养物按1％接种在肉汤培养基中，在试验开始时和第8小时分别用无菌注射器取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，计算活菌数，计算存活率。
所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先用冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至2.5；存活率的计算公式为S酸＝n8/n0S酸为经过pH2.5处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.5处理前涂布的每ml活菌数；n8为pH2.5处理8小时的每ml活菌数。
选育出在pH2.5处理8小时后存活率大于18％的乳酸杆菌；(二)耐胆盐选育制备斜面厌氧琼脂培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；3克猪胆盐；1000毫升蒸馏水，用冰醋酸调pH至5.2，将上述培养基溶解完后，分装在Hungates管，每管装15ml左右，充1.5％二氧化碳40秒，加盖封口后，高压灭菌，取出后摆成斜面培养基；分别将上述耐酸性强的乳酸杆菌培养物，用无菌生理盐水稀释1000倍后，取0.2ml稀释液接种到斜面厌氧琼脂培养基中，轻轻摇荡使其均匀分散在培养基表面，置37℃培养箱培养18-48小时；选育出能长出菌落的乳酸杆菌；
(三)耐高铜选育制备肉汤培养基10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，将上述成分与1克五水硫酸铜分别加热溶解后，将二者混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出晾凉；按1％接种量将上述能长出菌落的乳酸杆菌培养物接种在上述肉汤培养基中，选育出接种后18-72小时能生长的菌株；(四)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿；用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直；用上述步骤(三)得到的乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离；选育出大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌；(五)将步骤(四)得到的大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养培养24小时后，观察乳酸杆菌与大肠杆菌的数量变化关系，选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌；其选育方法如下分别取5ml大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌培养物(108cfu/ml)与15ml无菌普通营养肉汤混合，制成含乳酸杆菌培养物的营养肉汤，接种10％大肠杆菌培养物，大肠杆菌的起始浓度为107cfu/ml，起始培养液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N的NaOH调培养液的pH为7.0，置37℃，2.5％CO2培养箱培养24个小时后，取出培养液，培养液经梯度稀释后，取0.3ml稀释液均匀涂布在MRS琼脂培养基上，每个梯度作3个平行样，MRS琼脂培养基置5％CO237℃培养箱培养18-48小时，取菌落数在30-150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量；同样地，在培养24小时后取出培养液稀释100倍后，取0.3ml稀释液置于麦康凯琼脂上，均匀涂布，作3个平行样，将麦康凯琼脂平板置37℃普通培养箱培养18-48个小时，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示；最后选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌，该乳酸杆菌经中国科学院微生物研究所鉴定为罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)；其鉴定结果如下表
五、本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri的生物学特性(一)耐酸存活率本发明的罗伊氏乳酸杆菌经过pH2.0处理6小时之后的存活率为34.4％；其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后先用冰醋酸调pH至5.6，再用浓盐酸将pH调至2.0。置于Hungates管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，晾凉；
将本发明的罗伊氏乳酸杆菌培养物放入凉下来的Hungates管中，每管中加1ml罗伊氏乳酸杆菌培养物，在开始时和第6小时分别取样，进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果；耐酸存活率的计算公式为S酸＝n6/n0S酸为经过pH2.0处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.0处理前涂布的每ml活菌数；n8为pH2.0处理6小时的每ml活菌数，得出本发明的罗伊氏乳酸杆菌经过pH2.0处理6小时之后的存活率为34.4％；(二)耐热存活率本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌的耐热存活率为31％；其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调pH为6.7，置于Hungtes管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，晾凉待用；将本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌培养物加入Hungtes管中，每管中加1ml罗伊氏乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数，同时将Hungates管放置在75℃水浴中加热15分钟，取样进行活菌浓度计数。取样进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果；耐热存活率的计算公式为S热＝n0/n1S热为经过75℃加热处理后的乳酸杆菌存活率；n0为加热处理前每ml的活菌数；n1为加热处理15分钟后每ml的活菌数，得出本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌的耐热存活率为31％的结果；(三)耐贮藏存活率本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌的耐贮藏存活率为85％；
其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调，pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，晾凉待用；本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌培养物置入Hungates滚管中，每管中加1ml罗伊氏乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数培养。室温下放置30天后，取样进行活菌浓度计数培养。取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150个的平皿计数，以平均值表示结果；耐贮藏存活率的计算公式为S贮＝n1/n0S贮为经过30天贮藏后的乳酸杆菌存活率；n0为贮藏前每ml的活菌数；n1为贮藏30天后每ml的活菌数，得出本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌的耐贮藏存活率分别为85％的结果；(四)生长量本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌在培养后18小时达到最高生长浓度为109cfu/ml；其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，在500ml的锥形瓶里装300ml的MRS肉汤，高压灭菌，晾凉待用；将本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌培养物按5％接种量接种于肉汤培养基中，分别在培养后24小时内每个小时、28、32、36、40、44、48小时取培养液进行梯度稀释后，取0.3ml各梯度稀释液注入装有MRS琼脂(pH6.5)的厌氧Hungates管中，用手轻轻滚匀，培养24-48小时计算滚管中的菌落数，以每管中菌落数在50-150个的管的梯度作为计算用，每个梯度做3个平行，以平均值表示结果，得出本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌在培养后18小时达到最高生长浓度为109cfu/ml。
本发明还从健康断奶仔猪空肠粘膜中分离选育出一种嗜酸乳酸杆菌Lactobacillusacidophilus，于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》其保藏号为CGMCC No.0842；该嗜酸乳酸杆菌的分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.0；高压蒸汽灭菌，并在Hungates管做成无菌厌氧滚管；分离方法为取健康断奶仔猪空肠粘膜于无菌容器中，先用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述含分离培养基的Hungates无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，在生物无菌操作下，将上述白色针尖大小菌落分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物，将得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的为乳酸杆菌属；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤的组分包括10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，1000毫升蒸馏水，并用醋酸调节pH至5.4；二、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌再进行以下选育(一)耐酸选育制备肉汤培养基，其组分为10克蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先用冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至2.5；
分别将得到的乳酸杆菌培养物按1％接种量接种于上述肉汤培养基中，在试验开始时和第8小时分别用无菌注射器取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，计算活菌数，计算存活率；存活率的计算公式为S酸＝n8/n0S酸为经过pH2.5处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.5处理前涂布的每ml活菌数；n8为pH2.5处理8小时的每ml活菌数，选育出在pH2.5处理8小时后的存活率大于18％的乳酸杆菌；(二)耐胆盐选育制备斜面厌氧琼脂培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；3克猪胆盐；1000毫升蒸馏水，用冰醋酸调pH至5.2，将上述培养基溶解完后，分装在Hungates管，每管装15ml左右，充1.5％二氧化碳1分钟，加盖封口后，高压灭菌，取出后摆成斜面培养基，冷却后待用；将上述步骤选育出的耐酸性强的乳酸杆菌培养物用无菌生理盐水稀释1000倍后，取0.2ml稀释液接种，轻轻摇荡使乳酸杆菌均匀分散在培养基表面，置37℃培养箱培养18-48小时，选育出能长出菌落的乳酸杆菌；(三)耐高铜选育制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，将上述成分与1克五水硫酸铜分别加热溶解后，将二者混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出晾凉后待用；将步骤(二)选育出的能长出菌落的乳酸杆菌培养物按1％接种量分别接种在上述肉汤培养基中，选育出接种后18-72小时能生长的菌株；(四)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直；
用将上述步骤(三)选育出接种后18-72小时能生长的菌株培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离，选育出大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌；(五)将步骤(四)选育出的大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养24小时后，观察乳酸杆菌与大肠杆菌的数量变化关系，选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌，该乳酸杆菌经中国科学院微生物研究所鉴定为嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)；其具体方法如下分别取5ml乳酸杆菌培养物(108cfu/ml)与15ml无菌普通营养肉汤混合，制成含乳酸杆菌培养物的营养肉汤，接种10％大肠杆菌培养，大肠杆菌的起始浓度为107cfu/ml，起始培养液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N的NaOH调培养液的pH为7.0，置37℃，2.5％CO2培养箱培养24个小时后，取出培养液，培养液经梯度稀释后，取0.3ml稀释液均匀涂布MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基置5％CO237℃培养箱培养18-48小时，取菌落数在30-150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量。同样地，在培养24小时后取出培养液稀100倍后，取0.3ml稀释液置于麦康凯琼脂上，均匀涂布，做3个平行样，将麦康凯琼脂平板置37℃，普通培养箱培养18-48个小时，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示；选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌，该乳酸杆菌经中国科学院微生物研究所鉴定为嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)；其鉴定结果见下表
五、其生物学特性(一)耐酸存活率本发明选育的嗜酸乳酸杆菌经过pH2.0处理6小时之后的存活率为69.5％；其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后先用冰醋酸调pH至5.6，再用浓盐酸将pH调至2.0。置于Hungates管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，晾凉后待用；在晾凉后的Hungates管中，按每管中加1ml嗜酸乳酸杆菌培养物，在开始时和第6小时分别取样，进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果；耐酸存活率的计算公式为S酸＝n6/n0S酸为经过pH2.0处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.0处理前涂布的每ml活菌数；n8为pH2.0处理6小时的每ml活菌数，得出本发明选育的嗜酸乳酸杆菌经过pH2.0处理6小时之后的存活率为69.5％；(二)耐热存活率本发明选育的嗜酸乳酸杆菌的耐热存活率为62％；
其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调pH为6.7，置于Hungates管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，晾凉后待用；在Hungates管中，按每管中加1ml嗜酸乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数，同时将Hungates管放置在75℃水浴中加热15分钟，取样进行活菌浓度计数。取样进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果；耐热存活率的计算公式为S热＝n1/n0S热为经过75℃加热处理后的乳酸杆菌存活率；n0为加热处理前每ml的活菌数；n1为加热处理15分钟后每ml的活菌数，得出本发明选育的嗜酸乳酸杆菌的耐热存活率为62％；(三)耐贮藏存活率本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌的耐贮藏存活率为59％；其测试方法如下制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，晾凉后待用；在Hungates滚管中，按每管中加1ml嗜酸乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数培养。室温下放置30天后，取样进行活菌浓度计数培养。取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150个的平皿计数，以平均值表示结果；耐贮藏存活率的计算公式为
S贮＝n1/n0S贮为经过30天贮藏后的乳酸杆菌存活率；n0为贮藏前每ml的活菌数；n1为贮藏30天后每ml的活菌数，得出本发明选育的罗伊氏乳酸杆菌的耐贮藏存活率为59％；(四)生长量本发明选育的嗜酸乳酸杆菌在培养后18小时达到最高生长浓度为1011cfu/ml；其测试方法如下制备肉汤培养物，其组分为10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，在500ml的锥形瓶里装300ml的MRS肉汤，高压灭菌，晾凉后待用；将嗜酸乳酸杆菌培养物按5％接种量分别接种于锥形瓶中，分别在培养后24小时内每个小时、28、32、36、40、44、48小时取培养液进行梯度稀释后，取0.3ml各梯度稀释液注入装有MRS琼脂(pH6.5)的厌氧Hungates管中，用手轻轻滚匀，培养24-48小时计算滚管中的菌落数，以每管中菌落数在50-150个的管的梯度作为计算用，每个梯度做3个平行，以平均值表示结果，本发明选育的嗜酸乳酸杆菌在培养后18小时达到最高生长浓度为1011cfu/ml。
本发明还从健康断奶仔猪结肠粘膜中分离选育出一种发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)，于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》其保藏号为CGMCC No.0843；该发酵乳酸杆菌的分离选育的步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.0；高压蒸汽灭菌，并在Hungates管做成无菌厌氧滚管；分别取来自健康断奶仔猪结肠的粘膜于无菌容器中，先用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器杯中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述含分离培养基的Hungates无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，在生物无菌操作下，将上述白色针尖大小菌落分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤的组分包括10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，1000毫升蒸馏水，并用醋酸调节pH至5.4；将上述步骤得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；二、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌进行以下选育(一)耐酸选育制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先用冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至2.5；分别将上述乳酸杆菌培养物按1％接种量接种在肉汤培养基中，在试验开始时和第8小时分别用无菌注射器取出培养物进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，计算活菌数，计算存活率，得出在pH2.5处理8小时后的存活率大于18％的乳酸杆菌；存活率的计算公式为S酸＝n8/n0S酸为经过pH2.5处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.5处理前涂布的每ml活菌数；n8为pH2.5处理8小时的每ml活菌数。
选育出在pH2.5处理8小时后的存活率大于18％的乳酸杆菌；(二)耐胆盐选育制备斜面厌氧琼脂培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；3克猪胆盐；1000毫升蒸馏水，用冰醋酸调pH至5.2，将上述培养基溶解完后，分装在Hungates管，每管装15ml左右，充1.5％二氧化碳1分钟，加盖封口后，高压灭菌，取出后摆成斜面培养基，冷却后待用；取上述831株耐酸性强的乳酸杆菌培养物0.1ml，用无菌生理盐水稀释1000倍后，取0.2ml稀释液接种，轻轻摇荡使乳酸杆菌均匀分散在培养基表面，置37℃培养箱培养18-48小时。选择123株能长出菌落的乳酸杆菌。
(三)耐高铜选育肉汤10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，将上述成分与1克五水硫酸铜分别加热溶解后，将二者混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出凉下来后，按1％接种量分别接种上述123株乳酸杆菌培养物在上述肉汤中，选择51株接种后18-72小时能生长的菌株。
(四)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直。用上述51株乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离。选择出现大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的2株乳酸杆菌。
(五)乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养的选育。将上述2株乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养24小时后，观察乳酸杆菌与大肠杆菌的数量变化关系。方法如下分别取5ml乳酸杆菌培养物(108cfu/ml)与15ml无菌普通营养肉汤混合，制成含乳酸杆菌培养物的营养肉汤，接种10％大肠杆菌培养，大肠杆菌的起始浓度为107cfu/ml，起始培养液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N的NaOH调培养液的pH为7.0，置37℃，2.5％CO2培养箱培养24个小时后，取出培养液，培养液经梯度稀释后，取0.3ml稀释液均匀涂布MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基置5％CO237℃培养箱培养18-48小时，取菌落数在30-150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量。同样地，在培养24小时后取出培养液稀100倍后，取0.3ml稀释液置于麦康凯琼脂上，均匀涂布，作3个平行样，将麦康凯琼脂平板置37℃，普通培养箱培养18-48个小时，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示。选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌，该乳酸杆菌经中国科学院微生物研究所鉴定为发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)。
四、鉴定结果
五、生物学特性(一)耐酸存活率。本发明选育出来的发酵乳酸杆菌经过pH2.0处理6小时之后的存活率为80.9％。方法如下肉汤组分10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后先用冰醋酸调pH至5.6，再用浓盐酸将pH调至2.0。置于Hungates管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，凉下来后每管中加1ml发酵乳酸杆菌培养物，在开始时和第6小时分别取样。进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果。
耐酸存活率的计算公式为S酸＝n6/n0S酸为经过pH2.0处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.0处理前每ml活菌数；n8为pH2.0处理6小时的每ml活菌数。
(二)耐热存活率。本发明选育出来的发酵乳酸杆菌的耐热存活率为45％。方法如下肉汤组分10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调pH为6.7，置于Hungtes管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，凉下来后每管中加1ml发酵乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数，同时将Hungates管放置在75℃水浴中加热15分钟，取样进行活菌浓度计数。取样进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150的平皿计数，以平均值表示结果。
耐热存活率的计算公式为S热＝n1/n0S热为经过75℃加热处理后的乳酸杆菌存活率；n0为加热处理前每ml的活菌数；n1为加热处理15分钟后每ml的活菌数。
(三)耐贮藏存活率。本发明选育出来的罗伊氏乳酸杆菌的耐贮藏存活率分别为78％。方法如下肉汤组分10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，溶解后用冰醋酸调pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管放置20mlMRS肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，加塞封口，高压灭菌，凉下来后每管中加1ml发酵乳酸杆菌培养物，放置在37℃培养箱中16小时后，取样进行活菌浓度计数培养。室温下放置30天后，取样进行活菌浓度计数培养。取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度作3个平行样，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，取平皿中的菌落数50-150个的平皿计数，以平均值表示结果。
耐贮藏存活率的计算公式为S贮＝n1/n0S贮为经过30天贮藏后的乳酸杆菌存活率；n0为贮藏前每ml的活菌数；n1为贮藏30天后每ml的活菌数。
(四)生长量。本发明选育的发酵乳酸杆菌在培养后24小时达到最高生长浓度为1011cfu/ml。方法如下肉汤组分10克胰蛋白胨，10克牛肉浸膏，5克酵母浸粉，2克磷酸氢二钾，2克枸椽酸二铵，20克葡萄糖，0.58克七水硫酸镁，0.25克四水硫酸锰，5克乙酸钠，1ml吐温-80，1000毫升蒸馏水，在500ml的锥形瓶里装300ml的MRS肉汤，高压灭菌，凉下来接种5％的发酵乳酸杆菌培养物。分别在培养后24小时内每个小时、28、32、36、40、44、48小时取培养液进行梯度稀释后，取0.3ml各梯度稀释液注入装有MRS琼脂(pH6.5)的厌氧Hungates管中，轻轻滚匀，培养24-48小时计算滚管中的菌落数，以每管中菌落数在50-150个的管的梯度作为计算用，每个梯度做3个平行，以平均值表示结果。
本发明提供的格氏乳酸杆菌的用途为该格氏乳酸杆菌与在仔猪十二指肠发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠中发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
本发明提供的罗伊氏乳酸杆菌的用途为该罗伊氏乳酸杆菌与在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠中发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
本发明提供的嗜酸乳酸杆菌的用途为该嗜酸乳酸杆菌与在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在十二指肠中发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌和在结肠中发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
本发明提供的发酵乳酸杆菌的用途为该发酵乳酸杆菌与在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在十二指肠中发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌和在空肠中中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
本发明提供的含乳酸杆菌的用于断奶仔猪饲料中的复合添加剂，含在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在仔猪十二指肠发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠发挥益生作用的发酵乳酸杆菌；将分离选育出的4种乳酸杆菌按不同的数量比例关系添加到断奶仔猪曰粮中，以生长性能和腹泻发病情况为指标优化4种乳酸杆菌的组合，试验选择4种乳酸杆菌的6个水平，水平分别为2.0×104、4×104、6×104、8×104、1×105、1.2×105。选择均匀设计表中6个水平4因素的设计表安排动物试验。每个处理仔猪饲喂基础日粮加不同组合的乳酸杆菌制剂，发酵培养后离心得到的乳酸杆菌分别用稀释剂稀释后，乳酸杆菌复合制剂以0.1％的比例添加到日粮中。21日龄断奶仔猪的体重在6.0-10kg之间，试验设6个处理，每个处理6个重复，每个重复3头仔猪，试验期21天。记录每周的日增重、曰采食量和腹泻情况。经过均匀设计4.0统计软件统计分析和综合比较得到四株乳酸杆菌在仔猪日粮中的合理比例为格氏乳酸杆菌4.0-5.0×104cfu/g；罗伊氏乳酸杆菌6.0-8.0×104cfu/g；嗜酸乳酸杆菌1.0-1.2×105cfu/g；发酵乳酸杆菌2.0-4.0×104cfu/g，组成优质高效的益生素产品。
具体实施例方式
实施例1选择12头21±2日龄断奶的健康杜长大商品杂交仔猪，体重为7.65±1.10公斤，随机分成2组，在代谢笼上单笼饲养，猪代谢室的室温控制在25-27℃，处理组的6头仔猪每天饮水口服液态益生乳酸杆菌制剂，每毫升饮水中各株乳酸杆菌制剂的浓度分别为格氏乳酸杆菌4.0×104cfu/ml；罗伊氏乳酸杆菌6.0×104cfu/ml；嗜酸乳酸杆菌1.0×105cfu/ml；发酵乳酸杆菌4.0×104cfu/ml。对照组的6头仔猪饮用自来水作为对照，7天后用大肠杆菌K99、K88和987P的混合培养液(108)口服攻毒，一日二次，共一天，测定攻毒后腹泻发病率和腹泻指数，观察益生菌对仔猪的保护作用，试验期14天。结果表明饮用乳酸杆菌复合制剂组的仔猪的腹泻率比对照组下降69.1％，腹泻指数下降66。
实施例2试验选择36头杜长大断奶仔猪，体重为7.64±1.09kg，按体重和性别随机分成2组，每组为一个处理，每组18头，每组小猪随机分成6个小组，每小组3头仔猪一个栏圈，栏圈面积为2.0×2.0米，高层网上饲养，每个栏圈为一个重复，每个处理三圈阉公猪，三圈母猪。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24-27℃。自由采食，自由饮水。基础日粮不含有任何抗生素，仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行。处理1为基础日粮添加0.1％乳酸杆菌复合制剂；乳酸杆菌复合制剂中4种菌的比例格氏乳酸杆菌5.0×104cfu/g；罗伊氏乳酸杆菌8.0×104cfu/g；嗜酸乳酸杆菌1.2×105cfu/g；发酵乳酸杆菌2.0×104cfu/g。处理2为基础日粮添加100mg/kg喹乙醇。试验期21天，在试验开始、7天、14天和21天时称仔猪体重，记录每周的日增重、饲料采食量、腹泻指数以及腹泻发病率。试验结果表明益生乳酸杆菌制剂与喹乙醇相比，试验全期可提高仔猪日增重27.6％，提高日采食量18.2％，腹泻率下降19％，腹泻指数下降60。
实施例3试验选择72头杜长大断奶仔猪，体重为8.42±1.15kg，按体重和性别随机分成3组，每组为一个处理，每组24头，每组小猪随机分成6个小组，每小组4头仔猪一个栏圈，栏圈面积为2.0×2.0米，高层网上饲养，每个栏圈为一个重复，每个处理三圈阉公猪，三圈母猪。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24-27℃。自由采食，自由饮水。基础日粮不含有任何抗生素，仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行。处理1为对照组，仔猪饲喂基础日粮，基础日粮营养水平按照NRC(1998)的推荐量配制。处理2为基础日粮添加0.1％乳酸杆菌复合制剂；乳酸杆菌复合制剂中4种菌的比例格氏乳酸杆菌4.5×104cfu/g；罗伊氏乳酸杆菌7.0×104cfu/g；嗜酸乳酸杆菌1.1×105cfu/g；发酵乳酸杆菌3.0×104cfu/g。处理3为基础日粮添加100mg/kg金霉素。试验期21天，在试验开始、7天、14天和21天时称仔猪体重，记录每周的日增重、饲料采食量、腹泻指数以及腹泻发病率。试验结果表明益生乳酸杆菌制剂与对照组、金霉素相比，分别可提高仔猪日增重20.3％和9％，提高日采食量15.9％和5.2％，腹泻率下降46％和13％，腹泻指数下降69和16。
权利要求
1.一种乳酸杆菌菌种，其特征在于，该乳酸杆菌菌种为由仔猪胃粘膜中分离选育的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的格氏乳酸杆菌Lactobacillus gasseri，其保减号为CGMCC No.0840。
2.按权利要求1所述的乳酸杆菌菌种，其特征在于，所述的格氏乳酸杆菌的生物学特性如下1)在pH2.0处理6小时之后的耐酸存活率为133％；2)耐热存活率为72％；3)耐贮藏存活率为38％；4)该格氏乳酸杆菌在与大肠杆菌混合培养24小时后可使大肠杆菌(K88、K99和987P)下降105个数量级5)该格氏乳酸杆菌在培养后20小时最高生长浓度为1010cfu/ml；
3.一种权利要求1所述的格氏乳酸杆菌的分离选育方法，其分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.4，再用浓盐酸调pH至4.5；并用Hungates管做成无菌厌氧滚管；取健康断奶仔猪胃底部粘膜于无菌容器中，用无菌生理盐水冲洗除去粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，将上述白色针尖大小菌落生物无菌分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物；将上述步骤得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤组分包括10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克醋酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，蒸馏水1000毫升，并用醋酸调节pH至5.4；二、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌再进行以下选育(一)耐酸选育分别将上述乳酸杆菌24小时的培养物分别按1％接种量(乳酸杆菌与肉汤培养基的体积配比为1∶100)接种在上述肉汤培养基中，选育出接种12-72小时后，在pH3.0的肉汤培养基中可生长的，即使肉汤变浑浊的耐酸乳酸杆菌；所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至3.0；(二)耐高铜选育将上述选育的耐酸乳酸杆菌分别与1克五水硫酸铜加热溶解后，混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出晾凉后，按1％接种量接种至肉汤培养基中，选育出接种后18-72小时能在该肉汤培养基中生长的同时耐酸和耐高铜的乳酸菌株；所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4；(三)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿；用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直；分别用上述选育出的同时耐酸和耐高铜的乳酸菌18-24小时的培养物将沟填满，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离；选育出大肠杆菌菌落距离小沟边缘最远的同时耐酸、耐高铜和抗大肠杆菌的乳酸杆菌；(四)乳酸浓度为82mg/100ml的格氏乳酸杆菌的选育将上述同时耐酸、耐高铜和抗大肠杆菌的乳酸杆菌培养物按1％接种量接种到肉汤培养基中，培养20小时，离心，取上清液，用超纯水稀释10倍后，在Technicon RA100生化仪上用酶法测定上清液中的乳酸浓度；选育得到一株乳酸浓度为82mg/100ml格氏乳酸杆菌。所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，混合后装进Hungates管，每管装适量肉汤，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌。
4.一种乳酸杆菌菌种，其特征在于，该乳酸杆菌菌种为由仔猪十二指肠粘膜中分离选育的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri，其保藏号为CGMCC No.0841。
5.按权利要求4所述的乳酸杆菌菌种，其特征在于，所述的罗伊氏乳酸杆菌的生物学特性如下1)在pH2.0处理6小时之后的耐酸存活率为34.4％；2)耐热存活率为31％；3)耐贮藏存活率为85％；4)该格氏乳酸杆菌在培养后20小时最高生长浓度为109cfu/ml。
6.一种权利要求4所述的罗伊氏乳酸杆菌菌种的分离选育方法，其分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.0；高压蒸汽灭菌，并用Hungates管做成无菌厌氧滚管；将取自健康断奶仔猪十二指肠的粘膜于无菌容器中，先用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述含分离培养基的Hungates无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，在生物无菌操作下，将上述白色针尖大小菌落分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤组分10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，蒸馏水1000毫升，并用醋酸调节pH至5.4；将上述步骤得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；二、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌再进行以下选育(一)耐酸选育分别将上述乳酸杆菌24小时培养物按1％接种在肉汤培养基中，在试验开始时和第8小时分别用无菌注射器取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，计算活菌数，计算存活率。所述肉汤培养基组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先用冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至2.5；存活率的计算公式为S酸＝n8/n0S酸为经过pH2.5处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.5处理前每ml活菌数；n8为pH2.5处理8小时的每ml活菌数。选育出在pH2.5处理8小时后存活率大于18％的乳酸杆菌；(二)耐胆盐选育制备斜面厌氧琼脂培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；3克猪胆盐；1000毫升蒸馏水，用冰醋酸调pH至5.2，将上述培养基溶解完后，分装在Hungates管，每管装15ml左右，充1.5％二氧化碳1分钟，加盖封口后，高压灭菌，取出后摆成斜面培养基；分别将上述耐酸性强的乳酸杆菌培养物，用无菌生理盐水稀释1000倍后，取0.2ml稀释液接种到斜面厌氧琼脂培养基中，轻轻摇荡使其均匀分散在培养基表面，置37℃培养箱培养18-48小时；选育出能长出菌落的乳酸杆菌；(三)耐高铜选育制备肉汤培养基10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，将上述成分与1克五水硫酸铜分别加热溶解后，将二者混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出晾凉；按1％接种量将上述能长出菌落的乳酸杆菌培养物接种在上述肉汤培养基中，选育出接种后18-72小时能生长的菌株；(四)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿；用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直；用上述步骤(三)得到的乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离；选育出大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌；(五)将步骤(四)得到的离大肠杆菌菌落小沟边缘最远的乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养培养24小时后，观察乳酸杆菌与大肠杆菌的数量变化关系，选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌；其选育方法如下分别取5ml离大肠杆菌菌落小沟边缘最远的乳酸杆菌培养物(108cfu/ml)与15ml无菌普通营养肉汤混合，制成含乳酸杆菌培养物的营养肉汤，接种10％大肠杆菌培养物，大肠杆菌的起始浓度为107cfu/ml，起始培养液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N的NaOH调培养液的pH为7.0，置37℃，2.5％CO2培养箱培养24个小时后，取出培养液，培养液经梯度稀释后，取0.3ml稀释液均匀涂布MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基置5％CO237℃培养箱培养18-48小时，取菌落数在30-150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量；同样地，在培养24小时后取出培养液稀100倍后，取0.3ml稀释液置于麦康凯琼脂上，均匀涂布，做3个平行样，将麦康凯琼脂平板置37℃，普通培养箱培养18-48个小时，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示；最后选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的乳酸杆菌为罗伊氏乳酸杆菌。
7.一种乳酸杆菌菌种，其特征在于，该乳酸杆菌菌种为由健康断奶仔猪空肠粘膜中分离选育出的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的嗜酸乳酸杆菌Lactobacillus acidophilus，其保藏号为CGMCCNo.0842。
8.按权利要求7所述的乳酸杆菌菌种，其特征在于，所述的嗜酸乳酸杆菌的生物学特性如下1)在pH2.0处理6小时之后的存活率为69.5％；2)耐热存活率为62％；3)耐贮藏存活率为59％；4)在培养后18小时达到最高生长浓度1011cfu/ml。
9.一种按权利要求7所述的嗜酸乳酸杆菌的分离选育方法，其分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.0；高压蒸汽灭菌，并在Hungates管做成无菌厌氧滚管；分离方法为取健康断奶仔猪空肠的粘膜于无菌容器中，先用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器中，摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述含分离培养基的Hungates无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，将上述白色针尖大小菌落生物无菌分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物，将得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤的组分包括10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，1000毫升蒸馏水，并用醋酸调节pH至5.4；一、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌再进行以下选育(一)耐酸选育制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先用冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至2.5；分别将得到的乳酸杆菌培养物按1％接种量接种于上述肉汤培养基汤中，在试验开始时和第8小时分别用无菌注射器取出1ml进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，计算活菌数，计算存活率；存活率的计算公式为S酸＝n8/n0S酸为经过pH2.5处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.5处理前涂布的每ml活菌数；n8为pH2.5处理8小时的每ml活菌数，选育出在pH2.5处理8小时后的存活率大于18％的乳酸杆菌；(二)耐胆盐选育制备斜面厌氧琼脂培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；3克猪胆盐；1000毫升蒸馏水，用冰醋酸调pH至5.2，将上述培养基溶解完后，分装在Hungates管，每管装15ml左右，充1.5％二氧化碳40秒，加盖封口后，高压灭菌，取出后摆成斜面培养基，冷却后待用；将上述步骤选育出的耐酸性强的乳酸杆菌培养物用无菌生理盐水稀释1000倍后，取0.2ml稀释液接种，轻轻摇荡使乳酸杆菌均匀分散在培养基表面，置37℃培养箱培养18-48小时，选育出能长出菌落的乳酸杆菌；(三)耐高铜选育制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，将上述成分与1克五水硫酸铜分别加热溶解后，将二者混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出晾凉后待用；将步骤(二)选育出的能长出菌落的乳酸杆菌培养物按1％接种量分别接种在上述肉汤培养基中，选育出接种后18-72小时能生长的菌株；(四)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直；用将上述步骤(三)选育出接种后18-72小时能生长的菌株培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离，选育出大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的乳酸杆菌；(五)将步骤(四)选育出的离大肠杆菌菌落小沟边缘最远的乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养24小时后，观察乳酸杆菌与大肠杆菌的数量变化关系，选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的嗜酸乳酸杆菌Lactobacillus acidophilus。
10.一种乳酸杆菌菌种，其特征在于，该乳酸杆菌菌种为由健康断奶仔猪结肠粘膜中分离选育出的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的发酵乳酸杆菌Lactobacillus fermentum，其保藏号为CGMCCNo.0843。
11.按权利要求10所述的乳酸杆菌菌种，其特征在于，所述的发酵乳酸杆菌的生物学特性如下1)在pH2.0处理6小时之后的存活率为80.9％；2)耐热存活率为45％；3)耐贮藏存活率分别为78％；4)在培养后24小时达到最高生长浓度为1011cfu/ml。
12.一种权利要求1所述的发酵乳酸杆菌的分离选育方法，其分离选育步骤如下一、分离用Hungates管制备含分离培养基的无菌厌氧滚管分离培养基组分为10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，13克琼脂，1000毫升蒸馏水，用醋酸调节pH至5.0；高压蒸汽灭菌，并在Hungates管做成无菌厌氧滚管；取健康断奶仔猪结肠的粘膜于无菌容器中，先用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mlHEPES缓冲液的容器杯中。摇动5分钟，洗脱粘附在粘膜上的细菌；取其上清液注入装有上述含分离培养基的Hungates无菌厌氧滚管中，轻轻滚动使上清液均匀分布在分离培养基表面；再放入5％-8％CO2培养箱，37℃培养24～72小时，出现白色针尖大小菌落；24-72小时之后，将上述白色针尖大小菌落生物无菌分别转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里，37℃培养24-72小时，分别得到使肉汤变浑浊的菌株培养物；所述的厌氧无菌Rogosa肉汤的组分包括10克胰蛋白胨，5克酵母浸粉，10克葡萄糖，5克阿拉伯糖，5克蔗糖，15克乙酸钠，2克枸椽酸铵，6克磷酸二氢钾，0.30克无水硫酸镁，0.12克硫酸锰，0.03克硫酸亚铁，1克吐温-80，1000毫升蒸馏水，并用醋酸调节pH至5.4；将上述步骤得到的使肉汤变浑浊的菌株培养物分别进行革兰氏染色和接触酶试验，分离出呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌；一、选育将上述步骤得到的呈革兰氏阳性和接触酶试验为阴性的乳酸杆菌进行以下选育(一)耐酸选育制备肉汤培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；先用冰醋酸调pH至5.2，再将pH用浓盐酸调至2.5；分别将上述乳酸杆菌培养物按1％接种量接种在肉汤培养基中，在试验开始时和第8小时分别用无菌注射器取出培养物进行梯度稀释后，每个梯度取0.3ml稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，8.5％CO2浓度的二氧化碳培养箱中，进行培养24-48小时，计算活菌数，计算存活率，得出在pH2.5处理8小时后的存活率大于18％的乳酸杆菌；存活率的计算公式为S酸＝n8/n0S酸为经过pH2.5处理后的乳酸杆菌存活率；n0为pH2.5处理前每ml活菌数；n8为pH2.5处理8小时的每ml活菌数。选育出在pH2.5处理8小时后的存活率大于18％的乳酸杆菌；(二)耐胆盐选育制备斜面厌氧琼脂培养基，其组分为10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；3克猪胆盐；1000毫升蒸馏水，用冰醋酸调pH至5.2，将上述培养基溶解完后，分装在Hungates管，每管装15ml左右，充1.5％二氧化碳1分钟，加盖封口后，高压灭菌，取出后摆成斜面培养基，冷却后待用；取上述831株耐酸性强的乳酸杆菌培养物0.1ml，用无菌生理盐水稀释1000倍后，取0.2ml稀释液接种，轻轻摇荡使乳酸杆菌均匀分散在培养基表面，置37℃培养箱培养18-48小时。选择123株能长出菌落的乳酸杆菌。(三)耐高铜选育肉汤10克胰蛋白胨；10克牛肉浸膏；5克酵母浸粉；2克磷酸氢二钾；2克枸椽酸二铵；20克葡萄糖；0.58克七水硫酸镁；0.25克四水硫酸锰；5克乙酸钠；1ml吐温-80；1000毫升蒸馏水；用冰醋酸调pH至5.4，将上述成分与1克五水硫酸铜分别加热溶解后，将二者混合装进Hungates管，趁热充1.5％CO21分钟，封口，高压灭菌，取出凉下来后，按1％接种量分别接种上述123株乳酸杆菌培养物在上述肉汤中，选择51株接种后18-72小时能生长的菌株。(四)抗大肠杆菌选育制作麦康凯培养基，溶解后高压灭菌，无菌操作倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌(K88、K99和987P)培养液(4.0×108cfu/ml)于培养基表面，然后在距平皿中线约3.5cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，补底，沟与划线的培养物垂直。用上述51株乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18-24小时后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟边缘的距离。选择出现大肠杆菌菌落离小沟边缘最远的2株乳酸杆菌。(五)乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养的选育。将上述2株乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养24小时后，观察乳酸杆菌与大肠杆菌的数量变化关系。方法如下分别取5ml乳酸杆菌培养物(108cfu/ml)与15ml无菌普通营养肉汤混合，制成含乳酸杆菌培养物的营养肉汤，接种10％大肠杆菌培养，大肠杆菌的起始浓度为107cfu/ml，起始培养液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N的NaOH调pH为7.0，置37℃，2.5％CO2培养箱培养24个小时后，取出培养液，培养液经梯度稀释后，取0.3ml稀释液均匀涂布MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基置5％CO237℃培养箱培养18-48小时，取菌落数在30-150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量。同样地，在培养24小时后取出培养液稀100倍后，取0.3ml稀释液置于麦康凯琼脂上，均匀涂布，做3个平行样，将麦康凯琼脂平板置37℃，普通培养箱培养18-48个小时，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示；选育出1株能使大肠杆菌数量下降最多且自身数量较高的发酵乳酸杆菌Lactobacillus fermentum。
13.一种权利要求1所述的格氏乳酸杆菌的用途，其特征在于，该格氏乳酸杆菌与在仔猪十二指肠发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠中发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
14.一种权利要求1所述的罗伊氏乳酸杆菌的用途，其特征在于，该罗伊氏乳酸杆菌与在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠中发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
15.一种权利要求1所述的嗜酸乳酸杆菌的用途，其特征在于，该嗜酸乳酸杆菌与在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在十二指肠中发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌和在在结肠中发挥益生作用的发酵乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
16.一种权利要求1所述的发酵乳酸杆菌的用途，其特征在于，该发酵乳酸杆菌与在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在十二指肠中发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌和在空肠中中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。
17.一种含乳酸杆菌的用于断奶仔猪饲料中的复合添加剂，其特征在于，该饲料复合添加剂含在仔猪胃中发挥益生作用的格氏乳酸杆菌、在仔猪十二指肠发挥益生作用的罗伊氏乳酸杆菌、在空肠中发挥益生作用的嗜酸乳酸杆菌和在结肠发挥益生作用的发酵乳酸杆菌；所述格氏乳酸杆菌为由仔猪胃肠道粘膜中分离选育的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的格氏乳酸杆菌Lactobacillusgasseri，其保藏号为CGMCC No.0840；所述的罗伊氏乳酸杆菌为健康断奶仔猪十二指肠粘膜中分离选育的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri，其保藏号为CGMCC No.0841；所述的嗜酸乳酸杆菌为健康断奶仔猪空肠粘膜中分离选育的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的嗜酸乳酸杆菌Lactobacillus acidophilus，其保藏号为CGMCC No.0842；所述的发酵乳酸杆菌为由健康断奶仔猪结肠粘膜中分离选育出的于2002年12月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的发酵乳酸杆菌Lactobacillus fermentum，其保藏号为CGMCC No.0843；所述格氏乳酸杆菌在该饲料复合添加剂的含量为4.0-5.0×104cfu/g；所述罗伊氏乳酸杆菌在该饲料复合添加剂的含量为6.0-8.0×104cfu/g；所述嗜酸乳酸杆菌在该饲料复合添加剂的含量为1.0-1.2×105cfu/g；所述发酵乳酸杆菌在该饲料复合添加剂的含量为2.0-4.0×104cfu/g。
全文摘要
本发明涉及由仔猪胃肠道中分离选育的格氏乳酸杆菌Lactobacillus gasseri，其保藏号为CGMCC No.0840；罗伊氏乳酸杆菌Lactobacillus reuteri，其保藏号为CGMCCNo.0841；嗜酸乳酸杆菌Lactobacillus acidophilus，其保藏号为CGMCC No.0842；和发酵乳酸杆菌Lactobacillus fermentum，其保藏号为CGMCC No.0843；该四种乳酸杆菌组合，用于制备有效防治仔猪断奶腹泻和促进生长的复合益生菌制剂，应用于仔猪断奶后日粮中。可提高仔猪的日增重，解决仔猪断奶后的腹泻问题。
文档编号A61K35/74GK1511945SQ0215975
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者李德发, 黄沧海, 谯仕彦, 马永喜, 邢建军 申请人:中国农业大学