专利名称：一种高正变率菌种选育方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种消除中间产物代谢积累的高正变率菌种选育方法。
背景技术：
生物医药、生物化工的科研与工业生产，菌种选育是提高产物水平或产量最常用、 最有效的方法之一，优良的高产菌种是发酵生产的关键。目前，菌种选育普遍采用的方法有随机筛选、推理选育、原生质体融合、基因工程技术等，传统的随机筛选费时、正变率极低， 已不多用；基因工程技术适合于生物合成途径简单的小分子产物的菌种改良；对于合成途径复杂的次级代谢产物的菌种改良，多采用方向性比较强、正变率较高的推理选育，这也是目前工业微生物改造最有效、使用最多的一种方法。推理选育通常选择生物合成途径的两端起始点(前体)和终点(目的产物)筛选抗性突变株，而微生物合成的中间反应少则几十步，多则数千步反应，真正存在问题(如代谢抑制造成中间产物积累)的限制性步骤很难找到，因而常被忽视。
发明内容
本发明的目的是通过找到并制备积累量多的途径中间产物，筛选其抗性/忍耐突变株，消除生物合成途径中限制性步骤的代谢抑制和阻塞，建立一种方向性、目的性非常强的选育高产菌株的方法。本发明的技术方案概述如下
一种高正变率菌种选育方法，其特征在于包括如下步骤
(1)代谢产物的检测分析出发菌株经发酵培养，培养物经分离去除营养物质，然后通过LC/MS检测分析，找出积累量最多的途径中间产物，并进行初步结构分析和确证；
(2)途径中间产物的分离制备通过色谱制备柱分离菌株的代谢产物，制备积累量最多的途径中间产物；
(3)确定最低抑菌浓度考查确定步骤(2)中制备得到的途径中间产物对于所述出发菌株的最低抑菌浓度；
(4)筛选将出发菌株经诱变剂诱变处理后，涂布于含有最低抑菌浓度途径中间产物的选择性平板，适宜温度下培养1-15天，挑选上述平板上生长的菌落，接种于固体斜面培养基，上述适宜温度下培养至菌落成熟，转接至摇瓶发酵培养基，上述适宜温度下摇瓶培养至发酵终点，测定产物含量，发酵水平最高的菌株，进行保藏备用；
所述适宜温度和所述培养基根据出发菌株确定。所述的出发菌株为细菌、真菌或放线菌。所述途径中间产物为目的产物生物合成途径中的中间步骤产物，其结构的分析和确证，结合生物合成途径以及目的产物的一、二级质谱图进行。
步骤(2)中所述途径中间产物的制备量以满足步骤(4)中筛选平板用量为准。步骤(3)中所述诱变剂为单一物理或化学诱变剂、或两种以上的复合诱变剂，诱变剂的选择以复合诱变的突变谱广为佳；诱变剂剂量以使菌株致死率达到20-99%为准。所述诱变剂剂量优选为使菌株致死率达到70-90%。步骤(3)中若途径中间产物在5% (w/w)以上相对较高浓度下对出发菌株没有抑菌性，则选择一个1-5% (w/w)的较高浓度，在所述较高浓度下进行步骤(4)筛选出发菌株的忍耐突变株。步骤(4)所得菌株循环重复所述步骤(I)、(2)、(3)、(4)，降低不同途径中间产物的积累，提高菌株合成产物的能力。本发明的优点是
本发明在推理选育的基础上更进一步，重点关注代谢途径过程中的复杂反应，找出发生积累的限制性步骤，某一中间产物若有积累，说明这一步存在代谢抑制，对应的酶活性或酶量不够。本发明将通过筛选MIC浓度下的积累中间产物的抗性/忍耐突变株，只有消除了中间产物的积累和代谢抑制作用，消除了关键步骤酶抑制的有效突变株才能生长，将其筛选出来，消除了中间产物的积累，更多地流向目的产物，从而筛选到高产突变株。采用本发明的方法进行菌种选育，直接找到并消除代谢途径中关键步骤的代谢抑制，消除中间产物的积累，更多地流向目的产物，目的性、方向性非常强，正向突变率最高可达80-90%，提高幅度可达到20-100%，甚至更高。本发明公开的筛选方法，过程不复杂，可以大幅提高菌种筛选效率，适合原始菌株选育，也适合于工业上的生产菌株选育；适合生物合成途径简单的菌种改良，更适合于生物合成途径复杂的菌种改良。
图I为利迪链霉菌培养液全扫描的ESI - MS谱。图2为途径中间产物Str印tolol的LC/MS/MS谱及结构。图3为消除Streptolol的积累可增加利迪链菌素的生物合成示意图。图4为消除途径中间产物Dihydromonacolin的积累可增加桔青霉的生物合成示意图。图5为消除中间产物霉菌酸的积累可增加毒三素链霉菌合成利普司他汀 (Iipstatin)的能力示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例I
消除途径中间产物(Streptolol)的积累选育利迪链霉菌(5 Iydicus)
出发菌株利迪链霉菌AS4. 2501-P28 (天津大学化工学院提供)，其固体斜面培养基(g/ L)组成为淀粉20，葡萄糖5，蛋白胨2，Mg2SO4 ·7Η20 O. 5，NaCl O. 5，玉米浆2，琼脂20， PH自然。发酵培养基(g/L)为淀粉40，葡萄糖5，蛋白胨2，K2HPO4 I. 0，Mg2SO4 · 7H20 O. 5，NaCl O. 5，pH 6.5。固体斜面接种后于28 °C培养10天，培养好的斜面菌种接种于装有30 ml发酵培养液的250 ml三角瓶中，220 rpm、28 °C回转式摇床发酵培养96 h，取20 ml发酵液，加20 ml乙酸乙酯萃取，有机相真空浓缩至干，残留用甲醇4 ml溶解，作LC/MS 测定，如图1，最大的离子峰599 [Μ-ΗΓ是目的产物利迪链菌素，积累较多的中间产物为m/z 363 [Μ - H]—，其LC/MS/MS谱如图2，解谱分析其结构，确证为利迪链菌素分子结构的Streptolol部分。对此关键途径中间产物Streptolol进行提取,制备2g,平板考查， 其对于出发菌株的最小抑菌浓度(MIC)为O. 16%。试验选择诱变条件为UV紫外线照射20 秒(89%致死率)。筛选出发菌株UV照射15秒后，涂布于O. 16%最小抑菌浓度的Str印tolol选择性平板，28 °C培养10-15天，筛选Str印tolol的抗性突变株。挑选30个菌落传接斜面，同时接种一个出发菌株作为对照，28 °C培养10天，斜面成熟后，接种摇瓶，28 °C摇床发酵培养96 h，培养液进行HPLC测定产物浓度，结果22株比对照高，正向突变率73. 3%，最高的一株比对照提高56. 1%。实施例2
O. OOlM HNO2溶液诱变处理8min (25%致死率)，替代实施例I中的UV照射20秒，其它同实施例1，得到结果18株比对照高，正向突变率60. 0%，最高一株的产物浓度比对照提高 45%。实施例3
诱变条件UV照射15秒(80%致死率)、0. OOlM HNO2溶液复合诱变处理5min，替代实施例I中的UV照射20秒，其它同实施例1，得到结果26株比对照高，正向突变率86. 7%，最高一株的产物浓度比对照提高106%。实施例4
消除途径中间产物Dihydromonacolin的积累筛选美伐他汀的高产菌株桔青霉0°. citrinum)
出发菌株为美伐他汀的生产菌株桔青霉ci trinum) W- (丽珠集团新北江制药提供)，斜面孢子培养基是土豆琼脂培养基，发酵培养基(g/L)为葡萄糖60，甘油 40，玉米浆30，黄豆饼粉10，(NH4)2SO4 1.0，pH 7.0。斜面接种后于23 °C培养14天，将斜面孢子接种于含有灭菌发酵培养基的三角瓶，23 °C摇床发酵培养240 h，取20 ml发酵液， 离心收集菌体5g，加100 ml乙酸丁酯搅拌萃取，过滤弃菌渣，有机相真空浓缩至干，残留用甲醇10 ml溶解，作LC/MS测定。积累较多的中间产物为318，通过其质谱碎片离子，并结合已知的美伐他汀生物合成途径，确证为途径中间产物Dihydromonacolin (图4)。取2000 ml发酵液，离心收集菌体约lOOOg，加8000 ml乙酸丁酯搅拌萃取，过滤弃菌渣，酯相真空浓缩至干，甲醇2000 ml溶解，经制备柱分离，收集含途径中间产物 Dihydromonacolin的懼分,真空浓缩至干,得3. 2g。平板考查,此途径中间产物对于出发菌株的最小抑菌浓度(MIC)为O. 27%。试验选择诱变条件为紫外照射40秒，LiCl作用浓度
O.3%,(复合诱变致死率83%)。筛选出发菌株桔青霉MV-7紫外照射40秒后，涂布于最小抑菌浓度O. 27%的 Dihydromonacolin、0. 3%LiCl的选择性平板,23°C培养10-15天,挑选50个菌落传接斜面， 同时接种一个出发菌株作为对照，23 °C培养14天，斜面成熟后，分别接种摇瓶，23 °C摇床发酵培养216h，培养液分别进行HPLC测定美伐他汀，结果39株比对照高，正向突变率78%，最闻的一株比对照提闻29%ο实施例5
0.9倍MIC=O. 24%替代实施例3中的MIC O. 27%，其它同实施例3，得到结果正向突变率 90%，最高的一株比出发菌株提高33%。实施例6
1.5倍MIC=O. 405%替代实施例3中的MIC O. 27%，其它同实施例3，得到结果正向突变率56%，最高的一株比出发菌株提高21%。实施例7
消除中间产物霉菌酸的代谢积累筛选高产毒三素链霉菌(5 toxytricini)
出发菌株为利普司他汀的生产菌株毒三素链霉菌LP-19 (郑州佰开生物工程公司提供)，固体斜面培养基(g/L)组成为淀粉5，葡萄糖5，酵母提取粉5，干酪素5，ZnSO4WH2O O. 5，FeSO4 O. 5，琼脂粉20，pH7. O ;发酵培养基(g/L)为麸质粉10，低温黄豆饼粉28，甘油16，葵花油50，麦芽糊精5，卵磷脂25，ZnSO4WH2O O. LCaCO3 4.0，抗氧化剂5，pH 6.6。 固体斜面接种后于28 °C培养8天，二环接种于含有灭菌发酵培养基的三角瓶，28 °C摇床发酵培养168 h，取20 ml发酵液，离心收集菌体5g，加100 ml乙醇搅拌I小时萃取，过滤弃菌渣，有机相真空浓缩至干，残留用甲醇10 ml溶解，作LC/MS测定。积累较多的中间产物分子量为334，通过其质谱碎片离子，并结合已知的奥利司他生物合成途径(图5)，确证为途径中间产物霉菌酸。取1500 ml发酵液，离心收集菌体约lOOOg，加2000 ml丙酮搅拌I小时，过滤弃菌渣，1000 ml正庚烷萃取，正庚烷相真空浓缩至干，加甲醇600 ml溶解，经C18反相制备柱分离，收集霉菌酸的馏分，真空浓缩至干，得3. Sg。平板考查，霉菌酸对于毒三素链霉菌没有抑菌性，因而选择一个较高浓度3. 0%。试验选择诱变条件为紫外照射60秒(致死率85%)。筛选出发菌株毒三素链霉菌LP-19紫外照射20s后，涂布于3. 0%浓度的霉菌酸选择性平板，28°C培养6-9天，筛选霉菌酸的忍耐突变株。挑选50个菌落传接斜面，同时接种一个出发菌株作为对照，28 °C培养8天，斜面成熟后，分别接种摇瓶，28°C摇床发酵培养 168h，培养液分别进行HPLC测定利普司他汀，结果36株比对照高，正向突变率72%，最高的一株比对照提高23%。实施例8
5. 0%浓度的霉菌酸替代实施例6中的3. 0%浓度的霉菌酸加入选择性平板，其它同实施例6，得到结果正向突变率81%，最高的一株比出发菌株提高27%。实施例9
I.0%浓度的霉菌酸替代实施例6中的3. 0%浓度的霉菌酸加入选择性平板，其它同实施例6，得到结果正向突变58%，最高的一株比出发菌株提高21%。
权利要求
1.一种高正变率菌种选育方法，其特征在于包括如下步骤(1)代谢产物的检测分析出发菌株经发酵培养，培养物经分离去除营养物质，然后通过LC/MS检测分析，找出积累量最多的途径中间产物，并进行初步结构分析和确证；(2)途径中间产物的分离制备通过色谱制备柱分离菌株的代谢产物，制备积累量最多的途径中间产物；(3)确定最低抑菌浓度考查确定步骤(2)中制备得到的途径中间产物对于所述出发菌株的最低抑菌浓度；(4)筛选将出发菌株里诱变剂进行诱变处理后，涂布于含有最低抑菌浓度途径中间产物的选择性平板，适宜温度下培养1-15天，挑选上述选择性平板上生长的菌落，接种于固体斜面培养基，上述适宜温度下培养至菌落成熟，转接至摇瓶发酵培养基，上述适宜温度下摇瓶培养至发酵终点，测定产物含量，发酵水平最高的菌株，进行保藏备用；所述适宜温度和所述培养基根据出发菌株确定。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的出发菌株为细菌、真菌或放线菌。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述途径中间产物为目的产物生物合成途径中的中间步骤产物，其结构的分析和确证，结合生物合成途径以及目的产物的一、二级质谱图进行。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述途径中间产物的制备量以满足步骤(4)中筛选平板用量为准。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述诱变剂为单一物理诱变剂、 单一化学诱变剂或两种以上的复合诱变剂；诱变剂剂量以使菌株致死率达到20-99%为准。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述诱变剂剂量为使菌株致死率达到 70-90%ο
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)中若途径中间产物在5%(w/w)以上相对较高浓度下对出发菌株没有抑菌性，则选择一个1-5% (w/w)的途径中间产物较高浓度，筛选所述较高浓度下出发菌株的忍耐突变株。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(4)所得菌株循环重复所述步骤(I)、(2)、(3)、(4)，降低不同途径中间产物的积累，提高菌株合成产物的能力。
全文摘要
本发明公开了一种消除中间产物代谢积累的高效菌种选育方法，步骤为(1)LC/MS(液相/质谱联用)分析检测出发菌株的代谢产物，找到积累最多的途径中间产物，确定代谢途径中关键步骤的代谢抑制点；(2)通过色谱制备柱分离菌株的培养物，提取积累最多的途径中间产物；(3)对步骤(2)获得的途径中间产物，筛选其抗性/忍耐突变株，通过消除代谢途径中关键步骤的代谢抑制，消除中间产物的积累，更多地流向目的产物，从而筛选到高产菌株。本发明公开的菌种选育方法，从复杂的生物合成途径中找到关键步骤，消除其中间产物的代谢抑制和积累，从而提高菌株的合成能力，大大提高了筛选效率，具有方向性强、高正变率、提高幅度大、方法简单等优点，适合于所有微生物的选育，尤其适合于生物合成途径复杂的次级代谢产物的菌种选育。
文档编号C12R1/80GK102586222SQ201210015119
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者姚清国, 李小兵, 李海龙, 段书德 申请人:石家庄学院