抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸的制作方法

专利名称：抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸的制作方法
技术领域：
:本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及通过反义“死”寡核苷酸竞争非特异性模板来干扰引物聚合等非特异性扩增的技术领域。
背景技术：
:核酸扩增技术起源于1971年，Korana首先提出核酸体外扩增设想:“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。其思想种子进入到现代分子生物学发展的土壤就会生根、发芽。终于1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感:于试管中模拟天然的DNA体内指数式复制过程。其基本原理:提供一种合适的条件一模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent4，683，202)。核酸扩增PCR反应由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:拟扩增的模板DN A经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:升温至72°C左右，DNA模板一引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原理，按5’ -3’方向合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链，不断重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。一般PCR进行30个循环就能将待扩目的基因呈指数扩增放大数百万倍以上，超过30个循环引物二聚体非特异性扩增就极剧增加。反应最终的DNA扩增量可用Y =(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，η代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期PCR产物逐渐增加，进入一定循环后靶序列DNA片段的增加呈指数形式即对数期，随着扩增产物的累积及PCR成份的消耗，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，达到“停滞效应”平台期。随着1985-1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。PCR技术已成为生命科学领域最重要的核心基础技术，Kary Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现，被发明，包括反转录 PCR (RT-PCR)，原位 PCR,连接酶链反应(Ligase chain reaction, LCR)，标记PCR(Labeled primers, LP-PCR),反向 PCR(reverse PCR,扩增两引物外侧未知序列)，不对称 PCR(asymmetric PCR),降落 PCR(touchdown PCR),重组 PCR(recombinant PCR),巢式 PCR(nest PCR)，多重 PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差异 PCR，链替换扩增(Strand displacement amplification, SDA),依赖核酸序列的扩增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA),转录依赖的扩增系统(Transcript-basedamplification system, TAS), Q β 复制酶(Q-beta replicase)催化 RNA 扩增，滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA),环介导的等温扩增(Loop mediated isothermalamplification, LAMP)等，尤其是各种实时荧光PCR(Real-time PCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR和各种荧光探针Taqman(Hydrolysisprobe) ,FRET Hybridition probes,and Molecular Beacons PCR,详见综述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano, BioTechniques39:75-85, July 2005)。核酸扩增技术不仅极大提升了基因克隆技术也提高了核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓展到生物学的众多领域。PCR技术已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，已成为二十一世纪生物学最核心的基础技术。近年来，在PCR基础上为提高检测效率而发展出了许多增加热循环速度的快速微流体缩微PCR(lab-on-chip)和多重靶检测的高通量纳升PCR芯片(PCR-on_chip)，详见论文SURVEYand SUMMARY, Da Xing (2007) Nucleic Acids Res.，Vol.35，N0.13，p4223_4237，截至目前全世界PCR专利或相关的设计更是多达四至五位数以上。综上，常规终末检测PCR只能定性分析，灵敏度不够，低于1000拷贝数标本测不了否则引物二聚体非特异性扩增导致假阳性结果，以及扩增产物汽雾胶再污染所致假阳性等难题，常规PCR加产物凝胶电泳检测方法难以适用临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cycle threshold)与祀模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。扩增产物增加的信号既可通过产物DNA结合荧光染料显示，如基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR(US Patent6, 569, 627);又可采用带淬灭基团的荧光探针来检测。被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了 Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量 PCR 技术(Livak KJ，et al.，1995，Genome Res:4:357_362)，于 1997 年申请了水解探针(商品名:TaqMan) PCR发明专利(US Patent 6，485，903),以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针(US Patent 7，205，105)。被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活,分子信标Molecular beacon (Tyagi S, et al, 1996,NatBiotechnol 14:303-308)正是这样一种莖环结构的杂交探针，于1999年申请了 Molecularbeacon发明专利(US Patent 05925517)。其它双杂交(FRET)探针，蝎形(Scorpion)探针，Sunrise-Primer, Lux Pimers等使用范围局限于一定的应用，不明显优于水解探针TaqMan方法。荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR法灵敏度可达数个拷贝，定量精确，但引物二聚体扩增结合荧光的假阳性限制了其临床应用；而水解探针TaqMan实时荧光PCR增加了一道特异探针杂交，非特异性引物二聚体扩增不产生荧光，广泛用于临床检验，但也存在灵敏度低一个数量级，定量线性关系不精确。不同于常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物，一般PCR只扩增25至30个循环产物量就够用了 ；而实时荧光PCR需要检测低至10拷贝靶分子的近Ct40循环数，TaqMan等标记探针PCR至少需要扩增40个循环，基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR为了发挥更高灵敏度通常需要扩增45个循环。因此实时荧光PCR技术存在着更严重的引物二聚体非特异性扩增问题，极过量的仅四种碱基排列组合的一对引物存在25%以上的同源性，也具有25%的互补性，引物对3’末端少量互补杂交后在聚合酶作用下延伸形成引物二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR实验中，绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30个循环附近，有些引物对本底Ct值甚至不到25个循环，位于靶分子定量检测范围Ct值15-37循环或“黄金检测窗口”之内，严重干扰低浓度(拷贝数)靶分子的定量和弱阳性误读。其实常被忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光，但会竞争PCR系统成份，降低扩增效率而导致灵敏度降低，弱阳性易漏检；定量也不准确，低浓度(拷贝数)线性关系及重复性不佳。实时荧光PCR “闭管分析”多数情况下并不完全密闭，也存在扩增产物汽雾胶再污染的难题，除螺旋盖毛细管外，大多数0.2ml PCR试管或96孔板，在热循环95°C变性时，高温高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖，一个气雾胶颗粒就含有IO5个分子拷贝，气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的引物二聚体扩增或引物-探针聚合体的扩增，且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重复同一 PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从O循环开始而是从上次PCR结束循环数开始，污染物越来越多。扩增产物汽雾胶再污染一般采用dUTP代替dTTP产物再结合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG，US Patent 6，090，553)选择性降解污染产物，UDG/UNG随后PCR热变性失活，但在实际工作中对大量的引物二聚体含dUTP扩增产物降解作用有限，并不能消除或推后SYBR Green I实时荧光PCR本底引物Ct值。为了克服引物二聚体造成的PCR假阳性结果使SYBR Green I实时荧光PCR等核酸扩增技术不利于临床检测分析的局限，本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”在充分优选的一对引物基础上，采用一段与引物3’末端互补的4-14base反义寡核苷酸来模拟潜在的非特异性模板DNA，竞争性地结合引物3’末端而干扰抑制过量引物非特异性扩增；或使用3’末端固相化任意序列4-9base (优选5-7)反义碱基寡核苷酸结合引物热启动缓释，再进行核酸PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线，没有非特异性扩增值干扰。再辅助以矿物油封闭下的一端引物缓释热启动及UNG修饰处理使核酸应用检测在PCR反应内没有引物二聚体累积，PCR多重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，万一可能的产物泄露也可进一步被UNG有效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核 酸扩增检测绝对可靠
发明内容
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核酸扩增PCR技术非特异性高背景主要是由引物二聚体(Primer Dimer)反复扩增、累积造成的。目前采用的种种抑制引物二聚体ro非特异性扩增的试剂、措施对引物-引物和靶-引物之间的作用缺乏特异针对性，没有根本解决ro非特异性扩增的限制。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”从关键的引物作用差异化来解决特异问题。根据引物与特异模板为引物全长碱基都互补作用，而与非特异模板为仅引物3’末端互补起主要作用的推想。就提出一种摸拟非特异模板的反义“死”寡核苷酸来同非特异模板竞争引物3’末端，通过限制反义“死”寡核苷酸长度使其不能同特异模板竞争全长引物，从而大大减少引物二聚体非特异性扩增的技术途径。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其基本特征在于能结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的策略，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸。其关键特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，反义干扰寡核苷酸与非特异性模板竞引物而PCR热循环条件下不能与特异靶模板竞争引物，使一对引物PCR反应内不会产生引物二聚体非特异性扩增。反义寡核苷酸适用于有引物结合、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增等技术。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”其特征是所述核酸扩增技术的一端引物缓释热启动，所述的引物缓释是引物杂交吸附于某一固体微球交联的反义寡核苷酸，并溶解于某一比重大且粘性强的液体，固相微球可逆吸附与释放引物。预加样的缓释引物常温下不进入PCR反应液使扩增不能进行，热变性后引物完全释放入PCR反应液启动PCR运行，并且要不干扰PCR。引物缓释热启动适用于有引物作用的各种热循环PCR技术。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于固体微球一般包括纳米(/小于20微米)葡聚糖凝胶或聚苯乙稀微球，表面带弱阳性电荷的纳米至微米级颗粒物质如壳聚糖(Chitosan)，弱阴性离子交换树脂/纤维素微球。微球表面带活性基团以氨基首选，因为带正电荷的氨基微球本身亦可吸附核酸负电荷。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于引物缓释溶剂一般采用比重大且粘性强的液体如15% -20% Dextran (w/v,葡聚糖)液，天然粘胶等，所述的引物缓释溶剂溶解引物预先加入PCR管底室温下不与后加的反应液混勻，在PCR热变性后粘稠引物才被热混匀而释放入反应体系启动扩增。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于引物缓释配合PCR反应液表面用矿物油封闭，从而杜绝PCR产物气雾胶挤出管盖外二次污染，矿物油面上溅出的反应液因缺少缓释引物而PCR成份不全，所以没有扩增产物泄漏。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸选择一种4-9base任意碱基反义寡核苷酸，采用任意碱基组合的每一个序列位置均四种碱基排列的寡核苷酸，排列组合数=4n(n为序列碱基数)，覆盖了所有潜在的非特异性结合。任意碱基反义寡核苷酸采用纳米活性微球共价交联固相化，加入1-5 μ M的固相化反义寡核苷酸就可结合多数引物而间接固相化引物并抑制热循环中引物非特异性扩增。
所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸选择一种4-14base特异碱基反义寡核苷酸，所述的特异碱基反义寡核苷酸序列与引物3’末端序列互补，优选5’ -3’方向平行互补，加入0.1-1OOpM的特异反义寡核苷酸结合特异配对引物，抑制PCR反应中引物非特异性扩增。采用比重大且粘性强的溶剂如葡聚糖溶解反义寡核苷酸结合引物，粘稠引物与其它PCR成份短暂分隔而缓释热启动。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸的反义喊基包括 2’-0-Methyl RNA、2’-Fluoro RNA、2’-0,4’-C-methylene bridgeRNA(LNA 锁核酸)、和 PNA(妝核酸)、Morpholino、N3’ - > N5’ Phosphoramidate 等。其中 RNA 类反义喊基包括 2’ -O-Methyl RNA、2，Fluoro RNA、2，-0,4，-C-methylene bridgeRNA(LNA锁核酸)组成的反义干扰寡核苷酸3’末端羟基封闭。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸的反义碱基可间隔1-5个正常碱基而合成嵌合DNA，这种经济嵌合的特异碱基反义寡核苷酸适合大部分PCR;而较短的任意碱基反义寡核苷酸全部采用反义碱基，特别适合多重PCR。所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于其技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括:核酸提取试剂，dNTPs, Taq等DNA聚合酶及其缓冲液，逆转录酶及其缓冲液，上游引物F /下游引物R，荧光染料或探针，标准对照物，纯化水dH20，矿物油。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其应用的PCR扩增基本原理、操作流程及适用范围均同于一般常规核酸扩增PCR技术，只是引物结合了一段短“反义”碱基寡核苷酸序列。虽然反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides, Stein C.A,2002,Molecular Cancer Therapeutics Vol.1,p347_355,Minireview)大量应用于代谢研究和作为治疗药物，但目前尚未见为了减少引物二聚体非特异性扩增的引物结合“反义”碱基寡核苷酸方法。本发明内容主要是以荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR技术来书写、实验及应用，原因是基于染料SYBR Green I实时荧光PCR技术原理简单、直观，定量数据容易分析，并不是表示本发明技术仅限于SYBR Green I实时荧光PCR这一技术。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”适用于有引物杂交、延伸的各种核酸扩增技术而解决其引物二聚体非特异性扩增的根本问题。核酸扩增系统一般由模板、引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液组成，其中引物不仅决定着检测的特异性，而且扩增产物直接从引物延伸而来，靶核酸扩增数百万倍是由于过量的数百亿倍的引物作用所致，一对扩增引物往往使用5 μ Μ/L或5ρΜ/ μ I浓度(反应终浓度 0.1 μ Μ/L 或 0.1pM/ μ I)，折算成分子数为 5 X 6.02 X 1017/L 或 5 X 6.02 X IO11/ μ 1.其数目远远过量于模板浓度，甚至较最终扩增产物分子数目也高出千倍以上。一对引物每条浓度必须3-5 μ Μ/L或3-5ρΜ/ μ I才能有效的特异性扩增靶模版，如此极过量的一对引物3’末端彼此间有互补即相互杂交延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体形成一般是借助其3’末端多个互补碱基反向配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续反向互补碱基可通过常规引物设计方法规避。但碱基仅四种组成排列，引物3’末端与非特异性模板有1-2个互补序列不可避免，同时DNA单链有一定柔性弯曲度，引物3’末端少数碱基互补就可借助其互补区外的多个断续配对碱基的合力结合、延伸一些序列，延伸了的引物对之间易多个碱基互补杂交、延伸产生二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性扩增、并结合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR本底对照实验中，引物二聚体非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期，非特异性扩增开始严重起来，对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30-32个循环附近，实时荧光PCR第30-38个热循环仍位于1000-10拷贝靶分子检测范围或黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性(附

图1)。引物形成二聚体理论上是低于引物间杂交Tm值温度时耐热聚合酶部分催化作用，但是热变性热启动PCR的本底引物Ct值也仅推后1-3个循环数，多在Ct33个循环左右。因此热启动仅能破坏一对引物3’末端个别1-2个碱基杂交，引物二聚体大部分成因还应该是源于热循环引物退火温度54°C时末端少数互补碱基再借助3’末端外的引物间多个不连续配对互补碱基的合力结合、而延伸产生二聚体；也存在可能引物退火温度时，其3’末端分子热运动碰撞Taq酶催化每次延伸一两个碱基。还有常常被大家忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光，但会耗尽PCR系统成份，降低扩增效率使弱阳性定量不准或漏检。更严重的是TaqMan等探针与过量引物之间亦会有互补杂交、延伸,一些TaqMan探针实时荧光PCR的本底循环阈值(Ct值)在36-38个循环附近，亦有一定的假阳性误诊。在不加模板，仅加一对引物与TaqMan探针的SYBR Green I实时PCR的本底Ct值提前至25个循环左右，说明引物加探针PCR会形成一些“带探针序列的二聚体、聚合体”，随后非特异性扩增的“二聚体、聚合体”竞争结合大量TaqMan探针，导致一定的假阳性和低浓度靶模板不易竞争探针所致灵敏度降低而弱阳性漏检。核酸扩增假阳性结果可能的原因还包括:⑴过量引物与无关DNA模版的非特异性杂交、扩增，首先引物设计除考虑靶基因外，样本中所有核酸DNA可能交叉杂交的大段连续碱基序列均必须排除在引物选项之外，这样即使存在个别区少量杂交也仅导致线性扩增，非特异性扩增不聚焦；不容易产生一对引物恰好都非特异性杂交于一段无关DNA的指数式扩增。其次，因无关DNA模板浓度比较低，过量的引物与低浓度随机无关序列DNA要进行比较多个循环才有可能非特异性Ct值，但加样过多模版也会提升引物二聚体H)所致的本底Ct值。(2)扩增产物气雾胶再污染，其主要成份是引物二聚体，也包含阳性扩增产物片段。防止气雾胶溢出扩散的关键是采用螺旋盖PCR管、加矿物油封闭等密闭措施，但即使PCR反应液表面加一层矿物油也因加样/矿物油时溅出的或液面管壁上残留的PCR混合液仍然能在热盖条件下有效PCR扩增，并有产物气雾胶溢出，造成下次同一重复PCR交叉污染。防止这种污染的一个措施是同时采用dUTP代替dTTP的底物(dNTP)，dUTP不影响正常PCR扩增，但PCR产物气雾胶污染因含dUTP的单链/双链DNA均被扩增体系预加的UDG酶降解，理论上UDG酶可从含dUTP六个碱基以上的DNA片段切除dUTP，对于大于IOObp阳性靶分子片段比较有效，而实际PCR检测中对于引物二聚体作用降解极其有限，可能引物二聚体太短，含dUTP密度不够而量又大。核酸扩增系统的引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg2+离子成份均是长期实验优化结果，允许变化的范围非常窄，简单的浓度改变对引物二聚体非特异性扩增和靶特异性扩增的效果基本 均是平行的作用。如使用降低一半浓度的常规引物能显著降低二聚体的形成量，但也同时平行急剧降低特异性靶模板扩增数量，使正常PCR不能进行。改变聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg2+、K+离子效果基本也是同样结果。但对于扩增100-200bp短模板常规实时荧光PCR尤其TaqMan探针法而言，使用降低一半常规浓度dNTP底物可提高部分扩增效率。核酸扩增技术常常采用多种PCR增强剂，如甜菜碱(Betaine)，二甲基亚砜(DMSO)，甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺(DMF)等增加扩增效率、平行推前约1-2个Ct值，更主要还是有效增进模板二级结构解链而增加扩增效率，但也都平行增加引物二聚体本底Ct值，而对靶特异扩增和引物二聚体非特异性扩增没有特别选择性。寻找解决引物二聚体非特异性扩增关键性措施还得从引物的靶特异配对和碱基互补非特异性杂交的差异化规律去探索。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其原理是基于PCR过量引物3’末端与任意DNA有任何碱基互补都会杂交延伸尤其是过量引物3’末端与过量引物作为模板DNA间更易杂交延伸进而一对引物间互为模板和互为引物形成引物二聚体非特异性扩增，短的非特异性杂交虽没有引物-靶特异性杂交优势但极度过量亦带来一定程度非特异性延伸扩增，且引物二聚体一旦形成就是其引物最具竞争优势的指数扩增模板。最根本核心特征是这种非特异性杂交区因引物优选设计而会很短，潜在的非特异性扩增模板序列一定是引物3’末端互补碱基序列。因此一条创新思路就是利用“反义”寡核苷酸模拟非特异性扩增模板，仅竞争性地结合引物3’末端而因修饰的“反义”碱基序列既不能充作扩增模板也不能充作扩增引物，这种仅保留结合功能“死的”反义寡核苷酸长过非特异性杂交区而选择性地竞争抑制引物非特异性扩增；“反义”寡核苷酸又明显短于引物-靶特异性杂交长度而不影响热循环条件下特异性靶扩增Ct值。在PCR反应循环内消除了引物二聚体的扩增(附图2)，也就杜绝了连续、反复同一 PCR扩增时累积气雾胶的污染之源。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其内容是采用各种3’端轻基封闭的反义寡核苷酸，包括第一代的Methylphosphate Oligonucleotides (甲基磷酸骨架寡核苷酸)，Phosphorothioate Oligonucleotides (硫代磷酸骨架寡核苷酸)，这种第一代反义寡核苷酸能抵抗核酸酶水解而应用于gene silence/knockout (基因沉默或敲去)研究和作为抗癌药物，但对某些保真度不高的核酸聚合酶如Taq没有抑制，起不到较好的“反义”作用。新一 代的反义寡核苷酸仅保留碱基结合功能而失去了作为扩增模板或引物等核酸基本性能，包括 2’-0-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、2’-0,4’-C-methylene bridgeRNA (LNA 锁核酸)、和 PNA (妝核酸)、Morpholino、N3’ - > N5’ Phosphoramidate 等。不同于代谢研究和药物使用13-25nt (nucleotides)长反义寡核苷酸,本发明“抑制引物非特异性扩增的反义寡核苷酸”是采用4-14nt/base末端羟基封闭的反义寡核苷酸，其序列与引物3’最末端碱基序列互补配对，平行方向互补配对抑制引物非特异性扩增效果明显优于反向互补配对。依据反义寡核苷酸长短不同，引物(5μΜ浓度)中含0.1ρΜ-100ρΜ不等,较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度得到最佳引物非特异性抑制效果。由于反义寡核苷酸有效使用浓度明显低于引物浓度，反义寡核苷酸既可采用全长反义碱基序列也可以采用正常碱基与反义碱基间隔的策略，采用正常碱基与反义碱基间隔的反义寡核苷酸经济便宜，但这种部份反义寡核苷酸是一把双刃剑，既抑制引物非特异性扩增又可部分成为引物非特异性模板，其在引物(5 μ M浓度)中的量不能超过10ρΜ-1000ρΜ，否则引物二聚体非特异性扩增本底Ct值明显前移。RNA类反义碱基序列不能有效作为扩增模板但仍可为引物，其末端羟基必须封闭但可仅限于3’末端，可采用乙酰化、磷酸基团、氨基、烷基、醛基、羧基、生物素、地高辛、胆固醇、及各种淬灭基团等选一种经济高效交联来封闭末端羟基的延伸；反义寡核苷酸3’末端最后一个碱基也可采用双脱氧碱基或3’ Inverted dT来封闭末端的延伸。反义寡核苷酸结合抑制一条引物就能有效抑制非特异性扩增，一对引物都设制反义寡核苷酸可进一步降低非特异性本底但PCR体系也带来更多的复杂性、和不确定交叉非特异性。不同的PCR体系最终需要通过实验来检验取舍。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其反义寡核苷酸亦可采用一些变通方法，如首先常规合成正常普通碱基的寡核苷酸，在其碱基未脱保护情况下作广泛的烷基化、酰基化、卤代、及氧化等化学修饰，其末端羟基可简单卤氢酸反应卤代封闭，最后脱碱基保护基生成保留碱基特异性结合的抑制非特异性扩增反义寡核苷酸。其次设计与引物3’最末端碱基序列互补配对的短4_7nt/base全反义碱基寡核苷酸,再连续合成串联的重复序列反义寡核苷酸二聚体或化学交联成重复序列反义二聚体及一些变通。最佳的策略还是合成4_9nt/base全反义碱基寡核苷酸全排列集合，即4_9nt/base序列包含所有排列组合的每一个序列位置均四种碱基排列，排列组合数=4n(n为序列碱基数)，覆盖了所有的非特异性杂交，引物(5μΜ浓度)中含量=100ρΜ-1ρΜΧ4η(η为序列碱基数)不等的反义寡核苷酸ΝΝΝΝ-ΝΝΝΝΝΝΝΝΝ (N为任意碱基)混合物可以抑制任意可能的引物非特异性扩增。以 7nt/base 为例，引物(5 μ M 浓度)中含量=IOpMX47 = 1.64Χ105ρΜ = 1.64Χ10-1μΜ。使用1-2 μ M的3’末端固相化(交联微球)任意序列4-9base反义碱基寡核苷酸不仅抑制任意可能的引物非特异性扩增，还可以使引物结合固相化反义碱基寡核苷酸并溶于15-20%Dextran (葡聚糖)液中而间接固相化，这种固相引物又可轻易被PCR热启动释放。于18%Dextran中的一端缓释固相化引物预先加入PCR管底，再依次小心沿管壁加入PCR反应液、样本模板和矿物油封闭，固相化引物由于Dextran比重大而沉于管底，不要混匀以免破坏缓释层，短瞬离心使固相化引物颗粒和加矿物油冲起的反应液下沉。进行PCR反应热变性后释放引物进入PCR反应液，恢复所有成份后PCR有效扩增，既不干扰靶分子特异性Ct值，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线。PCR时热盖并不能封闭扩增反应，仍需要加矿物油封闭，但在矿物油面上的残留反应液PCR时会挥发至管顶而挡住荧光光路，所以有矿物油时PCR仪仍需要设置热盖，而热盖条件下残留反应液留在矿物油面上仍能有效热循环扩增，所以设置热盖但不要等热盖升温就开始PCR，首先变性95°C 2-5分钟使矿物油面上的残留反应液尽量挥发挤出管外 再等热盖升温至105°C，同时管底预置的固相化缓释引物使矿物油面上的残留反应液因缺少一引物成份而绝不会扩增导致扩增产物气雾胶交叉污染；固相化缓释引物还使矿物油下面PCR反应液热启动，避免低温时启动非特异性扩增。PCR多重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，万一可能的扩增产物泄露也可进一步被UNG有效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核酸扩增应用检测绝对可靠。消除常温时聚合酶非特异性扩增的热启动PCR还包括其它PCR成份如dNTP缓释，更常见的方法还是聚合酶Taq修饰抑制和蜡包Mg2+离子热启动释放，热启动聚合酶Taq又包括端N缺失的KlenTaq,抗Taq酶抗体和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar,抑制非特异性扩增效果都不是十分明显，且抗体、Aptamar用量太大而抵消了一点热启动优势。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，聚合酶Taq(5U/l.! I)中加入微量0.5-0.7mg/100mlPoly-Phosphoric Acid(Sigma04101,多聚磷酸)单独使用不影响祀特异扩增Ct值,而多聚磷酸所带负电菏常温时结合抑制Taq酶、推后引物本底Ct值2-3个循环，与反义寡核苷酸结合缓释引物联用特别有效，相互加倍作用双重热启动，进一步保证了靶特异扩增可靠性。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”典型的几种反义寡核苷酸引物PCR实例:1.RNA类反义干扰寡核苷酸PCR:常见的RNA 类反义核苷包括 2’ -0-Methyl RNA、2’ Fluoro RNA、2’ -O,4’-C-methylene bridge RNA (LNA锁核酸)等,这类反义干扰寡核苷酸在PCR过程中不能作为扩增模板，其合成采用成熟的亚磷酰胺固相法，5’连接DMT的四种苯甲酰保护环外氨基的A、C、丁酰保护环外氨基的G和T核苷亚磷酰胺修饰单体均有很多商业公司供应，化学合成从3’ -5’方向，第一步控孔玻璃珠CPG-3’固相5’ DMT核苷脱DMT帽和分别活化单体成亚磷酰胺四唑、第二步偶联单体与5’脱帽羟基而延伸一个碱基、第三步盖帽-乙酰化封闭未反应的5’脱帽羟基、第四步氧化-碘液氧化而稳定亚磷酯键，循环一至四步延伸至所需碱基长度；最后氨解脱保护及反向柱纯化，末端羟基采用乙酸酐在N-甲基咪唑作用下乙酰化封闭延伸功能，或3’标记磷酸。现有太多的商业公司提供合成服务，又既可以购买ABI公司全自动合成仪合成，较短寡核苷酸也可手工固相法合成。序列在充分优选的一对引物基础上，采用一段与引物3’末端互补的4-14base反义寡核苷酸，而LNA锁核酸碱基亲和力高出RNA3-7°C、高出DNA2-5°C，所以LNA选用一段与引物3’末端互补的3_9base反义寡核苷酸。反义干扰寡核苷酸方向优选5 ’ -3 ’方向与引物3 ’最末端平行配对互补的序列，既可合成全长反义碱基序列也可以与引物3’最末端互补的采用反义碱基及每个反义碱基间隔1-5个正常碱基的策略，采用正常碱基与反义碱基间隔的反义寡核苷酸经济易合成，但这种部份反义寡核苷酸既抑制引物非特异性扩增又 可部分成为引物非特异性模板，最多加量须少于最佳抑制量的10-100倍。反义寡核苷酸来模拟潜在的非特异性模板DNA，竞争性地结合引物3’末端并干扰抑制过量引物非特异性扩增；再进行常规核酸PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线。一对上下游引物(51^/1)，其中一条加入0.1 1-100 11不等，较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度、实验得到最佳引物非特异性抑制效果，反义寡核苷酸引物于15% -20% Dextran (葡聚糖,w/ν)和0.1M NaCl中稀释2_4倍作为热启动缓释引物，粘稠比重大的葡聚糖溶解引物预先加入管底室温下不与后加的反应液混匀，在PCR热变性后粘稠引物才释放入反应体系启动扩增。底物dNTP(IOmM)采用dUTP代替dTTP的底物，dUTP不影响正常PCR扩增，但PCR产物气雾胶污染因含dUTP的单链/双链DNA均被扩增体系预加的UDG酶降解，理论上UDG酶可从含dUTP六个碱基以上的DNA片段切除dUTP，对于大于IOObp阳性交叉污染片段降解比较有效。创新的10XPCR反应buffer:含0.6MTris-CL (pH8.3) ,0.lMKCL,30mM (NH4)2SO4,16mM MgCL (TaqMan探针 18mM)使扩增效率提高并更加耐受杂质干扰。Taq 酶(5U/ μ I)加 0.0006% Poly-Phosphoric Acid (多聚磷酸，w/v)作为热启动聚合酶并含(M)G酶(lU/μ I)。进行25 μ I反应体系实时荧光PCR，首先加2 μ I的缓释引物(1.25 μ Μ)于PCR管底，不必换吸头；按比例配制PCR反应液:
权利要求
1.“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于能结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的策略，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸，其关键特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，反义干扰寡核苷酸与非特异性模板竞引物而PCR热循环条件下不能与特异靶模板竞争引物，使一对引物PCR反应内不会产生引物二聚体非特异性扩增，反义寡核苷酸适用于有引物结合、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增等技术。
2.“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”其特征是所述核酸扩增技术的一端引物缓释热启动，所述的引物缓释是引物杂交吸附于某一固体微球交联的反义寡核苷酸，并溶解于某一比重大且粘性强的液体，固相微球可逆吸附与释放引物，预加样的缓释引物常温下不进入PCR反应液使扩增不能进行，热变性后引物完全释放入PCR反应液启动PCR运行，并且要不干扰PCR，引物缓释热启动适用于有引物作用的各种热循环PCR技术。
3.根椐权利要求2所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的固体微球一般包括小于20微米的纳米葡聚糖凝胶或聚苯乙稀微球，表面带弱阳性电荷的纳米至微米级颗粒物质如壳聚糖，弱阴性离子交换树脂/纤维素微球，微球表面带活性基团以氨基首选，因为带正电荷的氨基微球本身亦可吸附核酸负电荷。
4.根椐权利要求2所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的引物缓释溶剂一般采用比重大且粘性强的液体如15%-20% (w/v)葡聚糖液，天然粘胶等，所述的引物缓释溶剂溶解引物预先加入PCR管底室温下不与后加的反应液混匀，在PCR热变性后粘稠引物才被热混匀而释放入反应体系启动扩增。
5.根椐权利要求2所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的引物缓释配合PCR反应液表面矿物油封闭而杜绝PCR产物气雾胶挤出管盖外二次污染，矿物油面上溅出的反应液因缺少缓释引物而PCR成份不全，所以没有扩增产物泄漏。
6.根椐权利要求1所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的反义干扰寡核苷酸选择一种4-9base任意碱基反义寡核苷酸，采用任意碱基组合的每一个序列位置均四种碱基排列的寡核苷酸，排列组合数=4η，η为序列碱基数，覆盖了所有潜在的非特异性结合，任意碱基反义寡核苷酸采用权利要求2所述的微球共价交联固相化，加入1-5 μ M的固相化反义寡核苷酸就可结合多数引物而间接固相化引物并抑制热循环中引物非特异性扩增。
7.根椐权利要求1所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的反义干扰寡核苷酸选择一种4-14base特异碱基反义寡核苷酸，所述的特异碱基反义寡核苷酸序列与引物3’末端序列互补，优选5’ -3’方向平行互补，加入0.1-1OOpM的特异反义寡核苷酸结合特异配对引物，抑制PCR反应中引物非特异性扩增，采用权利要求4所述的比重大且粘性强的溶剂葡聚糖溶解反义寡核苷酸结合引物，粘稠引物与其它PCR成份短暂分隔而缓释热启动。
8.根椐权利要求1所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的反义干扰寡核苷酸的反义碱基包括2’ -0-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、LNA锁核酸、和肽核酸、MorphoIino> N3’ - > N5’ Phosphoramidate,其中 RNA 类反义喊基包括 2’ -O-Methyl RNA>2’ Fluoro RNA、LNA锁核酸组成的反义干扰寡核苷酸3’末端羟基封闭。
9.根椐权利要求1所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，所述的反义干扰寡核苷酸的反义碱基可间隔1-5个正常碱基而合成嵌合DNA，这种经济嵌合的特异碱基反义寡核苷酸适合大部分PCR;而较短的任意碱基反义寡核苷酸全部采用反义碱基，特别适合多重PCR。
10.根椐权利要求1所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于5U/ μ I聚合酶Taq中加入微量0.5-0.7mg/100ml Sigma04101多聚磷酸单独使用不影响靶特异扩增Ct值，而多聚磷酸所带负电菏常温时结合抑制Taq酶、推后引物本底Ct值2-3个循环，与反义寡核苷酸结合缓释引物联用特别有效，相互加倍作用双重热启动，进一步保证了靶特异扩增可靠性。
11.根椐权利要求1所述的“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于其技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括:核酸提取试剂，dNTPs, Taq等DNA聚合酶及其缓冲液，逆转录酶及其缓冲液，上游引物F/下游引物R，荧光染料或探针，标准对照物，纯化水dH20，矿物油。 ·
全文摘要
本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其通过结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的扩增，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸。其基本特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，通过纳米微球固相化反义寡核苷酸来间接固相化引物于PCR系统缓释热启动，配合矿物油封闭PCR而杜绝气雾胶交叉污染，使PCR反应不会产生非特异性扩增。反义寡核苷酸适用于有引物退火、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增技术。
文档编号C12Q1/68GK103205425SQ20121001511
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者江洪, 岳素文, 阮志强, 江必胜, 江雨康 申请人:北京万达因生物医学技术有限责任公司