全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法及装置的制作方法

专利名称：全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明全封闭靶核酸扩增产物的检测装置，更具体地说，涉及利用荧光探针技术在全封闭检测装置中快速检测靶核酸扩增产物的方法，本发明还涉及了利用该全封闭的快速检测装置快速检测靶核酸扩增产物的试剂盒及其在检测传染病病原体中的用途。
现有技术核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初，人们致カ于研究基因的体外分离技木，1983年美国科学家Kary Mullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶， 孕育出了 PCR的雏形。经过两年的努力，在实验上证实了 PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。Kary Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。PCR技木本身非常简单，且能最大限度地满足生物学家操作DNA的不同要求。PCR 技术又以惊人的速度发展，并渗透到各生物学分支科学和临床各科的速度也令其它生物技术望而生叹。PCR在分子生物学、医学研究、生命科学、生物工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学等许多科学领域中都具有重要的实际应用价值，并对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展起到巨大的推动作用。PCR能提供基因物质的十分可信的精确分析，比任何现有技术敏感1万到100万倍。有人预测，21世纪为生物世纪，那么 PCR便是生物世纪最重要的技术。PCR具体应用有以下几个大的方面1、PCR可用于肿瘤的早期诊断和肿瘤治疗效果的測定2、PCR可用于病源微生物的測定，如HAV、HBV、HCV、HIV、致病菌、病毒等。3、遗传性疾病的诊断。4、早老性痴呆的诊断和治疗及巴金森氏病的诊断。5、法医鉴定分析，如亲子鉴定、犯罪现场标本分析。PCR产物一般为IO13拷贝/ml，取0. Iml即为IO9拷贝，而Img人基因组DNA才含 1.4X IO6拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应具有強大的扩增能力，提高了检测的敏感性。正是由于PCR反应具有強大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染便可导致假阳性結果。PCR反应中，主要存在三个污染源1.标本间的交叉污染；2.实验室克隆质粒的污染；3. PCR扩增产物的污染。其中以第三个污染源最主要，通过下面一个例子便可认识到PCR产物污染的严重性。在IOOml的反应管中可产生IO12拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池(50mX25mX2m)内稀释后，0. Iml稀释液含有400拷贝的扩增分子，远远超过了 PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，PCR检测微量感染因子吋，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。所以如何消除PCR假阳性结果则成了科研工作者们要解决的一大难题。为了能解决PCR扩增产物污染所造成的假阳性，许多学者也是想尽各种办法来解决这个问题。
PCR反应前后工作区的隔离包括试剂的准备和配制；临床标本的处理，提取DNA 模板；模板的扩增；扩增产物的检测和检定等。隔离PCR反应前后工作区，并且在PCR操作中封闭加罩，可提高扩增序列的特异性。目前认为将PCR反应工作分为试剂配制区、模板制备区、PCR反应区、产物检测区四部分；工作区环境应坚持经常紫外线消毒，这是防止PCR 污染的最主要措施。使用PCR预防污染试剂盒PCR污染预防试剂盒为采用修饰的dUTP(UNG)取代PCR 反应系统中的dTTP。扩增后产物可在下次PCR反应之前经尿嘧啶糖基酶(UNG)作用下被特异性降解，而此酶对天然的核酸模板毫无影响，因此先前扩增产物污染PCR系统，也不能成为下次PCR扩增的模板，从而可以根本上清除PCR污染dUTP扩增产物。同天然DNA —祥具有模板、杂交、克隆性质，只是对限制性内切酶作用有所影响。此外也可用dU代替引物中 dT，从而使UNG —开始就可以阻断污染的引物扩增。使用PCR预防污染试剂盒应注意PCR 反应中退火温度最好高于5°C，因为UNG在5°C以下才具有活性，如果退火温度低于5°C，变性后残余的DNA可降解新合成的dUDNA。通常95°C并不能完全灭活UNG ；扩增产物最好立即检測。RS-PCR法(RNA-specif ic PCR)也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3'端(A区)有20个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5'端20个核苷酸(C区) 为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA与多余引物分开，再用和第二引物 (C)以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物 C进行扩増加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。荧光定量PCR法亦称荧光PCR技术(fluoresence PCR，F-PCR)，是1995年由美国 PE公司首先研制成功的，它融汇了 PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探測PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外，还可用HEX、JOE作为报告荧光，3'端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的強度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。 荧光定量PCR法检测靶核酸虽可起到全封闭、自动化检测，但由于仪器昂贵，操作场地要求严格以及操作人员须持证上岗，检测成本高，限制了核酸检测的广泛应用。全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置其原理为扩增反应完成后，完全不打开反应管的管盖，以避免靶核酸扩增物释放到空气中形成污染，把反应管在不开盖的情况下放入在封闭性的装置内，将靶核酸扩增物在物理性封闭的环境中由反应管转移至检测试纸条上，通过荧光检测的数值，判读结果，检测后不打开密封的装置，可将其全部废弃于安全处。在靶核酸扩增操作过程中常可见标本间的污染，污染可能来自阴性标本处理过程中所伴随的已知或未知的阳性物质，通过空气污染或气溶胶，造成假阳性反应；然而更多见的是上次靶核酸扩增的产物，成为下次靶核酸反应的模板，主要是通过靶核酸扩增反应结束后，必须打开PCR反应管的管盖，吸出扩增产物，进行凝胶电泳或其它必须开盖式的传统检测方法检测。扩增极其微量的样品靶序列污染，在短时间内可扩增上百万倍，从而影响检测结果判定。目前能够防止污染的免开盖的仪器或是装置都有着这样或那样的缺点如PCR反应前后工作区的隔离法，不能保证彻底的防止污染，且实验操作人员身上如果不慎携带有PCR产物，那么这种方法也起不到好的效果。PCR预防污染试剂盒法，使用该系统防污染的先决条件，是整个PCR系统必须从ー开始就采用dUTP代替dTTP，而且UNG-dUTP系统防污染试剂的价格也使该试剂的使用受到了限制。RS-PCR法对引物设计要求很高，同样不适合基层操作人员。荧光定量PCR法，由于荧光定量PCR仪的价格昂贵、操作要求高所以不适合基层操作人员使用。全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，虽然简单方便。但是密封效果不好，稍有不慎，同样会造成PCR产物的泄露而污染。况且成本过高，所以难以推广使用。 如果能有ー种既简单方便又快速又成本低的方法将对生物学领域有着巨大的意义。

发明内容
为了能更好地解决靶核酸扩增产物污染的问题，并结合以上所有可以防止靶核酸扩增产物污染方法的优缺点，本申请人结合荧光探针技术，开发出全密闭式快速检测靶核酸扩增产物的快速荧光检测物的装置，称为全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置。本发明提供一种全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法，是扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入在密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁， 使反应管内扩增产物与密闭装置内预置的检测液反应，然后进行荧光检测，判读結果。上述方法中扩增反应结束后，不打开反应管的管盖，可以避免靶核酸扩增产物释放空气中形成严重的气溶胶污染；扩增产物在这个完全密闭的装置内可以进行荧光检测； 检测后不打开密封的装置，可将其全部废弃于安全处。整个过程在密闭环境中进行，能有效地防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性。本发明提供ー种将PCR、恒温扩增或其它方法扩增的产物应用荧光检测的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置。其包括PCR管、顶针塞、离心管，所述PCR管能置于离心管中，所述顶针塞具有能刺破PCR管的穿刺针，离心管具有可密闭的管盖。所述顶针塞包括塞体和穿刺针，为了让PCR管中的液体顺利进入离心管，穿刺针外侧有突出的针脊，塞体上设有镂空结构，脊可以是1条或多条。穿刺针上还有漏液孔。上述装置还包括配合该装置的剪刀钳。以确保剪切后的O.aiil PCR管能够倒置入 1. 5ml离心管中，PCR管的顶部与离心管体是吻合的，从而确保PCR管进入离心管不会置歪。顶针塞塞体的尺寸是当顶针塞放置于离心管中吋，其位置使倒置放入的PCR管的尾部突出离心管ロ 3-10mm。刺破PCR管的方式是利用离心管管盖封闭离心管的过程中，管盖挤压PCR管管尾产生压力，推动PCR管向下移动，PCR管管盖被顶针刺破；顶针针尖锋利度能确保刚置入的PCR管没有刺破PCR管，在离心管管盖没有与管ロ接触前没有刺破PCR 管顶，只有在离心管管盖与管ロ接触形成一个全封闭的环境，顶针针尖刺破PCR管。在针表面的脊型设计使PCR管被刺破后顶针与管盖间产生缝隙，在离心力作用下，PCR管内的液体能够从原来密封的PCR管中流出；顶针塞体部设计的漏斗样穿空能够使从PCR管中流出的液体通过塞体进入离心管底部反应，且在PCR管内、塞体均没有液体残留。顶针塞塞体四周的镂空可以使管壁上的液体离心进入管底。顶针塞塞体的体长为2-6mm，使离心管内的反应液体在0. 5ml以下均适用。本发明还公开了ー种快速荧光检测靶核酸扩增产物的方法，是使用上述的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置检测核酸序列扩增物。
5
本发明还公开了ー种防止核酸扩增产物交叉污染，避免假阳性的方法，是使用上述全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置核酸序列扩增物。本发明还公开了上述全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法或装置在临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及基因水平上的种类鉴定中的用途。本发明将利用荧光探针技术，检测扩增产物。根据本发明的优选实验方案，在上述方法中，所述的封闭装置(离心管)内包含了靶核酸反应液以及检测液，井能在密封的环境中充分混合并反应，无须打开就能直接检测荧光，从而防止装置内的可能污染的物品因意外而外泄。根据本发明的更优选实验方案，在上述方法中，如果PCR管的管盖有突出部分，可以用用剪刀嵌剪切PCR管盖成圆型，但不破坏PCR管的密闭性，又能使PCR管顺利倒置入离心管内，同时经剪切后的PCR管管盖尽可能贴近离心管管壁，起到对PCR管一个相对定位的作用，使顶针对应PCR管管盖的中间位置。本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置与常规靶核酸检测技术相比，主要有以下优点(1)全密闭式检测。整个过程都是无须开盖的，且是密封的，很好的避免了因为开盖而造成的靶核酸扩增产物的污染a) PCR反应管从核酸扩增结束到倒置入离心管，均是封闭的；b)PCR管被刺破是在离心管管盖完全合上形成ー个密闭空间时开始的，至管盖盖死时穿刺产生的破ロ最大；c)由于PCR管的液体量小于100 μ 1，即使PCR管倒置后其液体由于毛細管虹吸现象留在顶端，只有在顶针完全刺破PCR管管盖并通过离心其才会进入离心管管底；(2)快速荧光检測。由于在离心管底部已预先加入有特异性识别靶核酸反应产物的莹光探针和限制性内切酶，靶核酸产物扩增产物经离心一进入离心管底部与其混勻即开始反应探针A和探针B同时识别靶核酸序列，三者形成一特殊结构，一旦形成这ー特殊结构，就能被限制性内切酶识別，限制性内切酶在探针A上标记有荧光基团FAM和淬灭基团Q 间进行切割，FAM与Q基团分离并脱落，Q基团不能再淬灭FAM，FAM发出荧光，同时新的探针A又结合到靶序列上产生新的切割，荧光信号不断被放大，10分钟左右荧光信号即可达到最強；(3)特异性強。由于需两条相邻探针同时识别靶序列，形成ー个特殊的空间结构后，限制性内切酶才开始切割并产生荧光信号(见图4)；(4)灵敏度高。该方法第一步靶核酸扩增具有公认的高灵敏性，同时第二步探针检测在限制性酶的作用下也是ー个信号放大方法；(5)操作简单、快速。整个检测过程只需十到十五分钟左右的时间；(6)检测只须一台小型荧光检测仪。由于该装置可使靶核酸扩增产物的检测在完全密闭状态下完成，大大降低了传统扩增后核酸检测法中因为电泳检测而开盖造成的污染。此方法操作简单，快速，检测成本低，可靠性高。本密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置在各领域使用过程中可以增加结果判断的准确性，缩短检测时间，也可使各领域的总体成本降低。这ー装置由于操作简単、快速、成本低和对防止靶核酸扩增物污染的效果显著，对在生物学领域工作的技术人员来说，有着很大的帮助。由于核酸扩增检测技术的广泛使用，所以本发明的这项装置可以应用于所有需要使用核酸扩增检测技术法来检测的领域。如临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及农业エ业海关牧业等领域在基因水平上的种类鉴定和基因突变检测等方面的应用。如1.本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置可应用于遗传病的产前诊断。用胎儿羊膜細胞，羊水或甚至母血可以检查胎儿的性別，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD 等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献，对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分。2.本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置可应用于致病病原体的检测。外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用PCR、PT_PCR 或杂交方法来检测，其范围包括細菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物，PCR诊断的特点检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒(乙肝)，細菌(如结核、厌氧菌)和原虫 (如梅毒螺旋体)等来说尤为适用。3.本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置可应用于癌基因的检测和诊断。虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段，但癌变是由基因变异所导致的这ー 基本事实已无庸置疑，所以癌基因、抗癌基因入抗转移基因的研究，离开分子水平的诊断手段是无法进行的，临床上已可应用的例子有白血病残留細胞的定量(包括慢粒和急粒)，肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达。通过原位杂交观察特定癌基因及抗转移基因的植入和反义寡核苷酸对强表达癌基因的阻断均已成为近代基因治疗的着眼点。4.本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置可应用于DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证。这ー为公、检、法部分所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、ー个精子取得个体特征图谱，这ー 领域也已发展到骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。5.本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置可应用于动、植物检疫。 灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口 ロ岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物 (种畜、种籽)等是否携带烈性传染病(艾滋、动物病毒、植物病毒等)病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。6.本发明的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置可应用于高科技生物医学领域中的应用。在转基因动植物中检查植入基因的存在。


图1是本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置的结构。图2是本发明的检测装置顶针塞的结构。图3是本发明的检测装置的操作步骤。
图4是本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测原理。图5是本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测金黄色葡萄球菌基因。图6本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测金黄色葡萄球菌耐药基因。图7本发明的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置检测沙眼衣原体基因
具体实施例方式以下结合附图和实施例可以具体说明本发明的技术方案，但并不构成对本发明的保护范围的限制。如图1，ー种全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其包括PCR反应管11、顶针塞12 和离心管13 ；在PCR管11中进行的核酸扩增反应结束，PCR反应管11内有核酸扩增反应液14，使管11倒置进入离心管13，离心管13预置有顶针塞12以及检测液16 (含有检测核酸扩增反应液的探针A、探针B以及限制性内切酶)，利用离心管管盖封闭离心管的过程中， 管盖挤压PCR管管尾产生压力，推动PCR管11向下移动，PCR管管盖15被顶针刺破；顶针针尖锋利度能确保刚置入的PCR管不能被刺破，即在离心管管盖没有与管ロ接触前顶针没有刺破PCR管盖15，只有在离心管管盖与管ロ接触形成一个全封闭的环境，顶针针尖刺破 PC R管。在针表面的脊型设计使PCR管被刺破后顶针与管盖间产生缝隙，在离心力作用下， PCR管内的液体14能够从原来密封的PCR管中流出；顶针塞体部设计的漏斗样穿空能够使从PCR管中流出的液体通过塞体进入离心管底部与预置检测液16混合并反应，且在PCR管内、塞体均没有液体残留。顶针塞塞体四周的镂空可以使管壁上的液体离心进入管底。如图2，顶针塞包括穿刺针21、固定穿刺针的塞体ぬ，穿刺针和塞体都具有漏液设计。具体地，顶针塞包括针21、脊型突起22、塞体弧形表面23，针塞漏液漕对、塞体漏液漕 25.顶针塞的针尖设计的大小能保证其能刺破PCR管管盖且自身不易折断，围绕顶针的脊型突起22可保证在穿刺针21穿破管盖后针尖与管盖间产生缝隙，使PCR管内液体可以流出。塞体弧形表面23的弧形表面设计可使PCR管中的液体进到塞体表面液体不残留。 穿刺针体镂空漕对、塞体中间漏斗样小孔漕25能保证在离心时PCR管内液体通过顶针孔出来且可以完全穿过顶针塞塞体，不会有液体残留。图3说明了本发明的检测装置的操作步骤。在本发明的优选实验方案中，所述的反应管是PCR反应管，管盖部分超薄设计，易被刺破。所用离心管为标准的1. 5ml印pendorf离心管。ー个具体的实施步骤如下a)靶核酸扩增反应结束后，不打开反应管的管盖，以避免靶核酸扩增产物释放到空气中形成严重的气溶胶污染；b)PCR反应管利用剪刀钳剪切管盖成圆型并可以倒置放入离心管内，整个PCR管还是ー个密封的状态；c)通过离心管管盖对PCR管尾部的推力，将倒置的PCR管下压，PCR管管盖被顶针塞刺破；d)通过离心，靶核酸反应液在离心力作用下穿过被刺破的PCR管盖和顶针塞孔， 进入离心管；
e)由于离心管中已预置有检测靶核酸反应液的荧光探针，使扩增产物在这个完全
密闭的装置内可以进行荧光检测；f)通过荧光检测的数值，判读结果；g)检测后不打开密封的装置，因PCR管、离心管、顶针塞材质均为塑料制品，无金
属器件，可将其全部废弃于安全处。如下实施例可以具体说明本发明的技术方案，但并不构成对本发明的保护范围的限制。实施例1 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)为例的靶核酸扩增物检测1.PCR 扩增

权利要求
1.一种全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法，是扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入在密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁，使反应管内扩增产物与密闭装置内预置的检测液反应，然后进行荧光检测，判读結果。
2.—种全密闭式靶核酸扩增物快速荧光检测装置，包括PCR管、离心管，其特征在于还包括ー顶针塞，所述PCR管能置于离心管中，所述顶针塞具有能刺破PCR管的穿刺针，离心管具有可密闭的管盖。
3.根据权利要求2所述的全密闭式靶核酸扩增物快速荧光检测装置，其特征在于所述顶针塞包括塞体和穿刺针，穿刺针外侧有突出的针脊，塞体上设有镂空结构。
4.根据权利要求3所述的全密闭式靶核酸扩增物快速荧光检测装置，其特征在于所述穿刺针上有漏液孔。
5.根据权利要求2所述的的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其特征在于还包括配合该装置的剪刀钳。
6.根据权利要求2所述的的全封闭靶核酸扩增物快速检测装置，其特征在于顶针塞塞体的尺寸是当顶针塞放置于离心管中吋，其位置使倒置放入的PCR管的尾部突出离心管ロ 3-10mmo
7.ー种快速荧光检测靶核酸扩增产物的方法，是使用权利要求4-7之一的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置检测核酸序列扩增物。
8.ー种防止核酸扩增产物交叉污染，避免假阳性的方法，其包括使用权利要求4-7之一的全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置核酸序列扩增物。
9.权利要求1所述方法在临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及基因水平上的种类鉴定、基因突变检测中的用途。
10.权利要求2— 6之ー全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测装置在临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及农业ェ业海关牧业在基因水平上的种类鉴定、基因突变检测中的用途。
全文摘要
本发明涉及全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法和装置，所述方法是扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入在密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁，使反应管内扩增产物与密闭装置内预置的检测液反应，然后进行荧光检测，判读结果。所述装置包括PCR管、离心管和一顶针塞，所述PCR管能置于离心管中，所述顶针塞具有能刺破PCR管的穿刺针，离心管具有可密闭的管盖。采用本发明的方法的装置，可快速荧光检测靶核酸扩增产物，并能防止核酸扩增产物污染、避免假阳性；可在临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及农业工业海关牧业等领域在基因水平上的种类鉴定等方面得到应用。
文档编号C12M1/34GK102534011SQ201210014508
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者曹利民 申请人:曹利民