专利名称：一种荧光定量rt-pcr检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒I型的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测人类免疫缺陷病毒I型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒I型核酸RNA进行定量检测，适用于人类免疫缺陷病毒I型感染的辅助诊断和人类免疫缺陷病毒I型感染者药物治疗的疗效监测。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原体。HIV 是 1983 年法国巴斯德研究所Montagnier等首次从一例慢性淋巴结肿大的男性同性恋病人的血液中分离得到的一株新逆转录病毒。次年，美国Gallo等也从AIDS患者体内分离得到相似的逆转录病毒，根据分子病毒学研究分析证明，二者是同一病毒的不同变种。1986年，国际病毒分类委员会将他们命名为HIV。HIV主要有两型，包括HIV-1和HIV-2。两型病毒的核苷酸序列相差超过40%。全世界的AIDS大多由HIV-1所引起，HIV-1起源于中非，以后扩散到地中海、欧美及亚洲地区，而HIV-2只在西非呈地区性流行。目前艾滋病已成为威胁全球，尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民生命健康安全的主要疾病之一。因此，早期检测出HIV的感染对相关疾病的治疗和预后有着重要的意义。HIV病毒株呈球形，直径约100_120nm，电镜下病毒内部有一致密的圆柱状核心。病毒外层为脂蛋白包膜，其中镶嵌有gpl20和gp41两种病毒特异的糖蛋白。病毒内层为20面体对称的核衣壳，由病毒结构蛋白组成。病毒核心含有病毒RNA，逆转录酶和核衣壳蛋白。HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，由2条相同的正股RNA链在5’端通过部分碱基互补配对而 形成双聚体。病毒基因组由9749个核苷酸组成，含有3组共9个基因(gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpu和vpr)。在病毒基因组的5，端和3，端各有一段相同的核苷酸序列，成为长末端重复序列(long terminal repeat, LTR),含有起始子、增强子、TATA序列，以及多个与病毒及细胞调节蛋白反应的区域，对病毒基因组转录的调控起关键作用。联合国艾滋病规划署公布的《2008年全球艾滋病流行状况报告》显示，2008年全球大约有3340万艾滋病病毒感染者，270万新发感染者，200万人死于艾滋病。其中，大约有43万新生儿感染艾滋病病毒，15岁以下儿童艾滋病病毒感染者的总数达到210万；年轻人占所有成年人(15岁以上)新发感染的40%。即使是随着医学技术等发展使艾滋病传播得到有效控制，但目前该病尚无法治愈，也无有效疫苗。艾滋病的广泛流行，主要是由HIV病毒引起的。因此，HIV感染的实验室诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，只有发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播。艾滋病能通过血液、精液和宫颈分泌物传播，其他体液如唾液、脑脊液、泪液、尿液、乳汁中曾分离到HIV，但不是主要的传播途径。典型AIDS病程一般1. 5 2. 5年，发烧、疲劳、淋巴结肿大、持续腹泻、咳嗽、气短、皮疹、淤血斑、中枢神经系统疾病，各种感染，包括寄生虫病、细菌、深部真菌、病毒。AIDS患者由于免疫功能缺陷而发生肿瘤、如卡波剂氏肉瘤、淋巴瘤等。HIV感染后经5年有10%发展成AIDS，30%为AIDS相关综合征，60 %为无症状带毒者，这给AIDS的预防带来困难，估计感染后10年有50%发展为AIDS，该病在5年内死亡率均在90%，多在临床症状出现后2年之内死亡。HIV感染的病毒学诊断技术一般包括病毒分尚和病毒成份(如抗原、核酸)的检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染，目前国外用于HIV抗体筛查的方法很多，根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、凝集法和层析法，可对血液、唾液和尿液标本进行常规或快速检测。在实际工作中常用的有酶联免疫吸附试验(ELISA)、明胶凝集试验和各种快速诊断试剂。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，HIV核酸定性检测可用于HIV感染的辅助诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。核酸检测已经成为了 HIV实验室诊断的发展方向。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时突光 PCR 的一种(Yuqi Z, Min Y, Johann WM, et al. 2002. Quantification ofHuman Immunodeficiency Virus Type IProviral DNA by Using TaqMan Technology. JCli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C, Seifried E, Roth WK, et al. 2001，TaqMan5_-nuclease human immunodeficiency virus type I PCR assay with phage-packagedcompetitive internal control for high-throughput blood donor screening.JClin Microbiol, 39 :4302-4308 ；Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al. 1996，Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of humanimmunodeficiency virus type I RNA in plasma. J Clin Microbiol, 34 :3016-3022 ;Christopherson C,Kidane Y,Conway B et al. 2000. PCR-based assay to quantify humanimmunodeficiency virus type I DNA in peripheral blood mononuclear cells. J ClinMicrobiol, 38 :630-634.)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实时荧光定量法首先对HIV-1靶核酸RNA逆转录(RT)，然后对其产物cDNA进行PCR扩增。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 PCR从半定量到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了 PCR污染问题等特 本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取HIV基因组编码区的相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。内标靶区域选取与HIV目标区域一致，并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸，设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团HEX,并与内标质粒共同组成内标质控体系,可在VIC通道检测荧光。对于待检物而言，若检测结果显示典型的S型荧光增长曲线，则为阳性标本，反之则为阴性。通过简单易操作的核酸提取系统，结合实时荧光PCR检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高效率、高灵敏和高特异。
发明内容
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒I型的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测人类免疫缺陷病毒I型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒I型核酸RNA进行定量检测，适用于人类免疫缺陷病毒I型感染的辅助诊断和人类免疫缺陷病毒I型感染者药物治疗的疗效监测。其基本原理是利用荧光PCR技术，以HIV基因中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过含有逆转录酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的一步法RT-PCR对HIV-1RNA进行快速定量检测。同时，试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT值)实现对未知样本的定量检测。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案I)使用适当的核酸分析软件分别对已知的Hiv-1基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于Hiv-1基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了人类免疫缺陷病毒I型检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。内标靶区域选取与HIV目标区域一致，并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸，设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite和HIX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。3)适宜于一步法RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启动Taq酶、2’-脱氧核苷三磷酸、RNA酶抑制剂(RNasin)、能够与 双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。选择与HIV-1目的基因探针结合无关的序列(其他物种序列)作为内标设计的靶基因，在探针位置人工合成了一段寡核苷酸序列，应用核酸分析软件PC/GENE (瑞典PC/GENE公司出品)对上述检索结果进行同源性比较，找出同源区段。4)从待测样本中提取核酸RNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线对未知样本的核酸RNA进行定量检测。基于以上技术方案发明的试剂盒包括(I)核酸提取试剂、HIV-1反应液A、HIV-1反应液B、HIV-1反应液C、HIV-1内标溶液、阴性质控品、HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品、HIV-1阳性定量参考品1-4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR反应体系包括HIV-1反应液A、HIV-1反应液B和HIV-1反应液C。根据本发明的另一个优选实施方案，其中HIV-1反应液A (引物探针混合液)由正向引物、反向引物、目的的寡核苷酸探针、内标的寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’ -ATGGCAGTATTCATYCACAATT-3’ (SEQ ID NO 1)和5’-ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG-3’ (SEQ ID NO :2)。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是 5’ -X-ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT-Y-3’ (SEQ ID NO :3)，其中 X/Y 表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的引物探针浓度均为5 15pmol/人份,优选引物浓度为IOpmol/人份、探针浓度为5pmol/人份。
根据本发明的另一个优选实施方案，引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是 5’-X-TGACGGACCACACTGACCAGAG-Y-3’ (SEQ ID NO :4)，其中 X/Y 表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的探针浓度为3 IOpmol/人份，优选探针浓度为5pmol/人份。根据本发明的另一个优选实施方案，HIV-1反应液B由逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀释液组成。根据本发明的另一个优选实施方案，其特征还在于c-MMLV酶用量为1. 5 3. 5U/人份、热启动Taq酶用量为3 7U/人份、RNasin用量为15 25U/人份、dNTPs浓度为
0.20mmol/L，酶稀释液为一般市售的酶系稀释液。根据本发明的另一个优选实施方案，HIV-1反应液C包括一步法RT-PCR反应缓冲液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. O)、150mmol/LKC1、3. OmmoI/L MgCl20根据本发明的一个优选实施方案，阴性质控品为阴性血浆，HIV-1强阳性质控品和HIV-1临界阳性质控品均为含有HIV-1目的片段的病毒样颗粒，且浓度分别为5. OX IO6和5.0X103IU/ml ;HIV_1阳性定量参考品1_4均为含有HIV-1目的片段的重组质粒，浓度为
1.OXlO4-L OX 107IU/ml ;质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为50°C逆转录 15min，I 个循环；95°C 15min, I 个循环；最后 94°C 15s, 55°C 45s, 45 个循
环收集突光信号。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是血清或血浆等样品。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒可以检测出人类免疫缺陷病毒I型的最低浓度为100IU/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。本发明针对人类免疫缺陷病毒I型基因设计特异性引物和探针，检测的线性范围为250IU/ml 1. OX 108IU/ml，与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒(丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、EB病毒、人类疱疹病毒等)无交叉反应。试剂盒的灵敏度为99. 80%，特异性为97. 76%。本发明与现有技术相比，具有以下优点(I)使用一步法RT-PCR对HIV-1RNA进行快速定量检测，灵敏度，特异性高。(2)全封闭反应，提取病毒核酸RNA以后，直接用于RT-PCR检测，避免了污染发生。(3)试剂盒带有内标物质，可以用于对核酸提取和PCR扩增的整个过程进行监控，从而减少假阴性结果的出现。
图1显示HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品、阴性质控品和HIV-1阳性定量参考品1-4的检测结果。HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品扩增曲线有FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，且HIV-1强阳性质控品定值范围在1.0X106 2.0X107IU/ml ;HIV_1临界阳性质控品定值范围在1. OX IO3
2.OX 104IU/ml ;可明确判定为阳性。阴性质控品FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期；可明确判定为阴性。HIV-1阳性定量参考品1-4FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，CT值< 37，且R2 ^ O. 97，均符合质量控制判断标准。图2显示HIV-1RNA特异性参考品的检测结果。8份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。8份特异性参考品分别为正常人的标本及来自于其他血源性病原微生物标本，分别为乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)。图3显示灵敏度参考品的检测结果。6份灵敏度参考品中HIV-1RNA灵敏度参考品BI B3必须检出，且BI B3检出值必须在允许范围内，B4检测呈阳性反应，B6检测呈阴性反应。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 :人类免疫缺陷病毒I型试剂盒的检测方法(I)标本采集、运送和保存标本采集
血清-用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22 25°C)放置30 60分钟，血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5分钟；吸取上层血清，转移至1. 5ml灭菌离心管。血浆-用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA_2Na(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5 10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5 10分钟后即可分离出血浆，转移至1. 5ml灭菌离心管。标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试，_20°C保存期为3个月；-70°C以下长期保存，应避免反复冻融。标本运送采用o°c冰壶。(2)核酸提取将待测样本与阴性质控品、HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品进行同步处理。a).在1. 5ml的无菌离心管内加入50 μ I的蛋白酶K ;b) ·取样本200 μ I加入离心管中；c).再加入200 μ I的裂解工作液(即已含Carrier RNA的病毒裂解液)，盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，高速离心10秒(防止温育时产生气泡)，72°C 10分钟。同时可将洗脱液置于72°C预热；d).再加入250 μ I无水 乙醇，盖紧管盖，振荡15秒；e).将混合液全部吸至离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心柱装至新的
收集管；f).将500 μ I的抑制物去除液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心
柱装至新的收集管；g).将500 μ I的去离子液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心柱装
至新的收集管；h).再次将500 μ I的去离子液加入离心柱，室温下12，OOOrpm离心I分钟，将离心
柱装至新的收集管；i).将离心柱-收集管于室温下14，OOOrpm离心3分钟以除去残余的乙醇；j).将离心柱取出，放置于新的1. 5ml离心管。打开离心柱盖子，72°C放置2分钟(使用干式恒温器，不能使用水浴锅)；k).在离心柱的膜的正上方小心加入72°C预热的洗脱液50 μ 1，盖紧离心柱管盖，室温静置I分钟后，14，OOOrpm离心I分钟。离心管内即为病毒核酸溶液,建议立即使用，如需保存，置于_20°C。(3) PCR 检测a)配制体系将2 μ I HIV-1反应液Α，3 μ I HIV-1反应液B，25 μ I HIV-1反应液C充分混合，然后分装30 μ I至每个PCR反应管。b)加样往上述HIV-1反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、阴性质控品、HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品和直接加入HIV-1阳性定量参考品20 μ I。盖紧管盖，8，OOOrpm离心数秒后转移至PCR扩增仪。
扩增程序设置
ABI7300/7500荧光PCR扩增仪的参数设置如下
Reporter Dye FAM
Quencher Dye none
Passive Reference none
如使用Roche LightCycler和达安的DA 7600无需设定以上参数。
扩增温度参数统一设置如下
50 0C 15 分钟；
95 0C 15 分钟；
45个循环(94°C 15秒一550C 45秒)，荧光检测选择在55°C 45秒这一环节；
保存文件，运行。
(4)结果分析
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3 15、End值可设在5 20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Iteport界面察看结果，记录未知样本数值(C)。
(5)结果判定
如果FAM检测通道无对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判样品的HIV-1RN浓度小于检测灵敏度。
如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，且Ct值< 45，则按以下方法判断
若样品的2. 50E+002彡C彡1. 00E+008，则该样品的HIV-1RNA浓度=C IU/ml ；
若样品的Ol. 00E+008,则该样品的HIV-1RNA浓度>1. OX 108IU/ml。如果需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的HIV-1RNA浓度=(CX稀释倍数)IU/ml ；
若样品的 C < 2. 50E+002，则该样品的 HIV-1RNA 浓度< 2. 5X 102IU/ml。
实施例2 :人类免疫缺陷病毒I型试剂盒中质控品及阳性定量参考品的使用
人类免疫缺陷病毒I型试剂盒中质控品及阳性定量参考品包括HIV-1强阳性质控品，HIV-1临界阳性质控品，阴性质控品和HIV-1阳性定量参考品1-4，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。
质量控制
阴性质控品FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期
HIV-1阳性质控品FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，且HIV-1强阳性质控品定值范围在1. OXlO6 2. 0X107IU/ml ;HIV_1临界阳性质控品定值范围在1. OXlO3 2. 0X104IU/ml ；
HIV-1阳性定量参考品FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，CT 值< 37，且 R2 ^ O. 97 ； 9
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。检测结果(见附图1):阴性质控品的扩增曲线不呈S型，阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线，HIV-1阳性定量参考品1-4FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，阴、阳性质控品和HIV-1阳性定量参考品1-4均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施 只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒I型的试剂盒，试剂盒包括(1)核酸提取试剂、HIV-1反应液A、HIV-1反应液B、HIV-1反应液C、HIV-1内标溶液、阴性质控品、HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品、HIV-1阳性定量参考品1_4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR反应体系包括HIV-1反应液A、HIV-1反应液B和HIV-1反应液C，其特征在于HIV-1反应液A(引物探针混合液)中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’-ATGGCAGTATTCATYCACAATT-3’ (SEQ ID NO:1)5’-ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG-3’ (SEQ ID NO 2) 用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’ -X-ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT-Y-3’ (SEQID NO :3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针； 用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’ -X-TGACGGACCACACTGACCAGAG-Y-3’ (SEQID NO :4)，其中X/Y表示荧光标记基团。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于正、反向引物的浓度均为IOpmol/人份，目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/人份。
3.根据权利要求1的试剂盒，HIV-1反应液B由逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀释液组成，其中c-MMLV酶用量为1. 5 3. 5U/人份、热启动Taq酶用量为3 7U/人份、RNasin用量为15 25U/人份、dNTPs浓度为O. 20mmol/L,酶稀释液为一般市售的酶系稀释液。
4.根据权利要求1的试剂盒，HIV-1反应液C包括一步法RT-PCR反应缓冲液和DEPC水，其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. O)、150mmol/L KCl,3.Ommol/L MgCl20
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的最佳反应温度和时间为50°C逆转录15min，l个循环；95°C 15min，I个循环；最后94°C 15s，55°C 45s，45个循环收集荧光信号。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为阴性血浆，HIV-1强阳性质控品和HIV-1临界阳性质控品均为含有HIV-1目的片段的病毒样颗粒，且浓度分别为5.O X IO6和5. O X 103IU/ml ;HIV_1阳性定量参考品1_4均为含有HIV-1目的片段的重组质粒，浓度为1. OXlO4-L OX 107IU/ml ;质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的待检样品是血清或血浆等样品。
全文摘要
本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测人类免疫缺陷病毒1型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒1型核酸RNA进行定量检测，适用于人类免疫缺陷病毒1型感染的辅助诊断和人类免疫缺陷病毒1型感染者药物治疗的疗效监测。
文档编号C12Q1/70GK103045756SQ201210014378
公开日2013年4月17日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者李明, 丁渭, 陈华云 申请人:中山大学达安基因股份有限公司