一种制备带有突出末端的双链dna分子的方法

专利名称：一种制备带有突出末端的双链dna分子的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域一种DNA分子的构建方法。具体地，本发明涉及一种制备带有突出末端的双链DNA分子的方法。
背景技术：
DNA (Deoxyribonucleic acid)，又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，是生命体内重要的遗传物质。自然界中的DNA主要由四种不同的脱氧核糖核苷酸 (deoxytibonucleotide)按照不同的顺序排列而成，这四种带有不同碱基的核苷酸即腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，分别用字母 A、G、C和T表示。这四种核苷酸通过核苷酸五碳环上5’位的磷酸基团与3’位的羟基之间形成的磷酸二脂键相连，这四种核苷酸的不同排列顺序构成了生物体遗传多样性的物质基石出。自然界中，生物体内的DNA以反向互补双链的形式存在，两条带有互补碱基的DNA 链分子利用互补碱基之间的氢键结合在一起，形成一种特有的、稳定的双螺旋结构。不同的生物体内，DNA存在的形式多种多样，在同一个生物体的不同生长阶段，DNA的形式也可能不同。比如真核生物细胞核内DNA以高度结构化的染色体的形式存在，原核生物体内多以环状DNA的形式存在，质粒DNA以超螺旋的结构存在，有的病毒DNA以线性的形式存在。在体外对DNA的操作，比如对DNA分子的扩增、切割、修饰与重新组装等，也成为重组DNA技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。广义来说，DNA的重组技术是指利用供体生物的遗传物质，或人工合成的DNA分子，经过体外的分离纯化、PCR扩增、限制酶切割等处理后与适当的载体连接起来形成新的重组DNA分子， 然后将重组DNA分子导入受体生物中，从而实现对目标DNA分子的保存、扩增和分析等操作。体外对DNA的操作在各种工具酶(如限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等) 的作用下，DNA分子的存在形式可以更加多样化。以线性DNA分子的末端为例，DNA链露出末端核苷酸5’磷酸基团的一端称为5’端，露出末端核苷酸3’羟基基团的一端称为3’端， 反向互补双链DNA的末端则一条链是5’端，另一条链为3’端。如果一条DNA末端的5’核苷酸和3’核苷酸齐平，则该末端称为平末端(blunt end)；如果不齐平，即一条链在末端位置有一个或多个碱基冗余未能与互补链匹配，则该末端称为粘性末端(s "cky end)。粘性末端根据突出的链又分为5’突出末端和3’突出末端，分别对应5’突出链长和3’突出链长的情况。在基因工程操作中，具有互补序列的DNA末端可以连接在一起，这对于DNA片段的切割和连接非常重要。产生DNA末端的方式也很多，比如利用DNA聚合酶通过PCR扩增获得的片段可以是平末端或3’有一个A碱基突出的粘性末端；利用不同种类的限制性内切酶可以获得平末端或带有1-5个碱基的5’突出或3’突出粘性末端；一些核酸外切酶或聚合酶也可以将突出末端变为平末端。
目前限制性内切酶是用来产生粘性末端最常用的工具，限制性内切酶种类很多， 特异性强，可以根据需要设计带有限制性内切酶识别位点的DNA分子，通过酶的作用形成相应的末端。但是，目前所发现的内切酶中，最多只能产生带有5个碱基突出的粘性末端， 而在有些实验中，比如单分子力学实验(single molecule experiment)或者特殊的DNA重组实验中，我们需要一些末端(5’或3’ )突出长度达到10个或者更多碱基的DNA分子，面对这样的情况，限制性内切酶就无能为力了。如果所需要的DNA分子较短，可以采用合成两条不对称的互补链的方式，一条链较长，另外一条链较短，将需要在末端突出的部分留出来，这样，两条单链DNA分子通过退火以后可以形成一端或两端，5’或3’有多个碱基突出的分子。但是，这种方法的问题也很多，首先，它只能针对较短的分子，由于DNA化学合成技术的限制，超过200个碱基的单链 DNA分子很难通过化学合成的方法直接获得，因此也难以产生超过200个碱基对的双链DNA 分子；其次，随着DNA长度的增加，DNA化学合成过程中的错误率越来越高，而且，最重要的是，这个错误在形成DNA双链后很难被检测或修复；再次，由于引物较短，DNA双链退火过程中可能产生错配的分子；最后，目标分子的纯化存在困难而且这种方法很难被扩大获得大量的目标分子。对于较长的DNA片段，也可以采用先合成一条较长的带平末端的DNA双链，然后用引物退火的方法形成一个一端为平末端另一端具有所设计好的突出末端的接头，最后将这个接头连接到前面已合成好的长链DNA的末端。但该方法除了在接头的制备过程中存在上一个方法中的所有问题之外，在接头序列与DNA分子的连接过程中也存在问题包括终产物DNA序列的不确定性和难以发现及修正DNA序列中的突变，最重要的是DNA的连接效率受众多因素的影响，依赖于连接的方法获得的目的产物的量非常有限。本发明近乎完美地解决了上面几种方法中存在的问题，可以大量产生任意长度， 带有任意长度末端突出(可以是一端，也可以是两端，可以是5’突出，也可以是3’突出) 的特殊的双链DNA分子。

发明内容
本发明的目的在于提供一种产生带任意长度单链突出末端的双链DNA分子的方法。目前所发现的限制性内切酶只能产生突出碱基数不超过5个的DNA粘性末端而且末端的碱基受限制性内切酶识别位点的局限，利用本发明的方法可以产生末端带有5’或3’单链突出的双链DNA分子，获得带有任意长度和任意碱基序列的突出末端。本发明的方法可以用于快速大量获得一些特殊实验(比如单分子力学实验或DNA重组实验)中所需要的带有长片段突出粘性末端的DNA分子。本发明公开了一种制备带有突出末端的双链DNA分子的方法，包括下列步骤1)根据模板以及对应目标DNA分子(即前述带有突出末端的双链DNA分子)的序列，分别设计带有标记的正向引物、不带标记的正向引物、带有标记的反向引物及不带标记的反向引物。引物的设计原则是，由不带标记的正向引物和带标记的反向引物扩增所得到的DNA的正义链与目标DNA分子中的正义链一致；由带标记的正向引物和不带标记的反向引物扩增所得到的DNA的反义链与目标DNA分子中的反义链一致；由这两条链(即由不带标记的正向引物和带标记的反向引物扩增所得到的DNA的正义链与由带标记的正向引物和不带标记的反向引物扩增所得到的DNA的反义链)所组成的DNA分子即对应的目标DNA 分子。本发明的核心原理是利用两对不同的引物分别获得目标分子的正/反义链，这两条链互补后形成目标DNA分子，而非目标分子的DNA链则根据引物上带有的标记去除。因此， 引物设计的原则在于，目标分子的两条链分别存在于杂交前PCR获得的两种目的分子中。 由于退火后形成的四种DNA分子中只有一种不带标记，所以两个出发片段至少在一条链上需要带有标记，也就是说在设计引物时每个DNA分子需要在一条上游或者下游引物上带有标记。更具体的说，由于目标分子的突出段不带标记，因此扩增长片段的下游引物不能带有标记，所以对应其上游引物需要带有标记；对于另一条较短的出发片段来讲，目标分子中的短链来自于它，因此扩增该出发片段的上游引物不能带有标记，也即其对应的下游引物带有标记。2)将带有标记的引物与不带标记的引物交叉配对，分别PCR扩增模板获得两组扩增产物；3)将步骤2获得的两组扩增产物混合，变性后退火；4)纯化分离出退火产物中不带标记的分子，该不带标记的分子即为带有突出末端的目标DNA分子。步骤1中，只有所述不带标记的正向引物所在的正义链与不带标记的反向引物所在的反义链可以组成带有与目标DNA分子一致的突出末端的DNA分子。从另一方面来说， 带有标记的引物所在的链与其他链结合后形成的DNA分子与目标DNA分子不一致，这些非目标DNA分子可以在后续步骤中去除。步骤2中所述带有标记的引物与不带标记的引物交叉配对是指将带有标记的正向引物与不带标记的反向引物配对，不带标记的正向引物与带有标记的反向引物配对。步骤3的退火产物中既有带标记的分子也有不带标记的分子，其中，两条链均不带标记的分子即为带有目标突出末端的DNA分子(即前述目标DNA分子)。步骤3中采用的变性与退火方法均为常规，一般变性温度为95-100°C，变性时间以1-3分钟为宜，退火条件为，从变性温度开始，缓慢降温至室温(25°C )。所述缓慢降温，是指为了让DNA在温度下降的过程中有足够的时间进行充分复性，较佳地，降温的速度不超过0. 2°C每秒。较佳的，步骤3中两组扩增产物等摩尔比例混合。步骤4可采用能与所述标记结合的树脂或介质去除退火产物中带标记的分子来分离出目标DNA分子。比如，当标记为生物素时，可以用亲和素树脂去除带标记的分子。当然，步骤4还可以结合其他常用的DNA纯化方法如琼脂糖凝胶电泳或硅胶介质进一步纯化以去除其他杂质，从而获得纯度更高的目标DNA分子。采用本发明的方法制备的DNA分子(如载体)可应用于基因工程或材料工程以及微观物理学领域的研究等。本发明所述目标分子或目标DNA分子是指带有突出末端的双链DNA分子。目标 DNA分子可以利用本发明的方法制备，是具有特殊末端结构的双链DNA分子，这种特殊末端结构是指该DNA分子的一端或者两端，其中的一条链有比其互补链多余的碱基，这些碱基的数量可以是一个或多个。本发明所述引物是指，用于引发PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)反应的，人工合成的一段短的单链DNA分子。本发明所述标记是指，可以通过共价键连接到DNA分子上，而不影响DNA本身特性和功能的一类具有特定结构和功能的分子或基团。这些标记基团往往具有某种特性， 比如和某些物质特异结合或产生某种特殊的荧光等。可以用于本发明的特殊标记可以是生物素(Biotin)、双生物素(Dual-Biotin)、地高辛(Digoxigenin, DIG)、Nitrondole、 Cholesteryl等，但不局限于这些；本发明所述能与所述标记结合的树脂或介质可以是但不局限于结合有亲和素、链霉亲和素、抗生物素抗体、抗地高辛抗体、抗Nitrondole抗体、抗Cholesteryl抗体的树脂或介质。本发明所述能与所述标记结合的介质是指，一类具有多孔特性的固相物质(比如琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、丙烯酰胺凝胶等)，在这些物质的表面存在大量的特殊基团或分子，这些基团可以与上述特殊标记产生特异性结合，这些基团或分子可以是链霉亲和素介质、亲和素、抗生物素抗体、抗地高辛抗体、抗Nitrondole抗体、抗Cholesteryl抗体等，但不局限于这些。本发明所述琼脂糖凝胶电泳分离是指，DNA在一定的电流条件下，在用琼脂糖制备的多孔性支持材料中进行电泳，利用DNA带负电的特性，将DNA与其他杂质或将不同长度的 DNA分离开来的一种方法。本发明所述利用硅胶介质进行DNA纯化是指，利用硅胶介质可以在特定缓冲条件下结合DNA，通过更改缓冲液组分又能释放DNA的特性，首先创造DNA结合条件，使DNA结合到硅胶介质上，其次，改变条件，让DNA释放出来，从而实现将DNA与其他杂质分离的手段。采用本发明的方法产生带有特殊末端的DNA分子具有如下优点1、适用性广。采用本发明的方法不受DNA长度和序列的影响，对突出端的序列以及DNA本身的序列与长度没有要求。2、可变性强。采用本发明的方法可以产生一端，或者两端带有特殊末端的DNA分子；末端的DNA突出可以是3’端突出也可以是5’端突出；突出的碱基个数可以是一个或多个，至任意个，而超过5个长度的突出是其他方法所不能完成的，本发明的方法对通常使用限制性内切酶酶切方法不能产生的，突出长度超过5个碱基的粘性末端特别适用，当然该方法同样可以产生长度较短的，可以由限制性内切酶产生的末端。3、操作简单。本发明中用到的均为基本的分子生物学操作技术，可以在常规生物学实验室完成，没有特殊设备的要求。4、纯度极好。本发明的产物可以经过多次纯化，获得极高纯度的产物，而且本发明的产物可以通过测序等方法验证DNA序列。5、扩展性好。本发明的方法既可用于小量操作，产生纳克级别的产物，也可以放大至微克级、毫克级，乃至更高的产量，工序一致，缩放方便。


图1是不同形式的DNA末端示意2是用本发明的方法产生5’突出末端的DNA分子为例示意3是用本发明的方法产生3’突出末端的DNA分子为例示意图
图4是一个长度为62Ibp，一端带有14bp 5，突出末端的DNA实例示意5是一个两端分别有IObp 3’突出和IObp 5’突出的载体及其用途示意6是利用双重测序的方法对突出末端的验证流程示意7是实施例1中的末端验证测序结果的比对情况
具体实施例方式本发明根据需要扩增的模板，分别用带有特殊标记(如生物素)的引物和不带标记的引物成对扩增所需要的片段，一对引物根据目标DNA分子的正义链设计，使带有标记的引物扩增后形成反义链而不带标记的引物扩增后形成正义链；同样地，另一对引物根据目标分子的反义链设计，使带有标记的引物扩增后形成正义链而不带标记的引物扩增后形成反义链。然后，这两种产物等摩尔比例混合，变性后重新退火，则退火后的产物中含有不带标记的目标DNA分子正义链和反义链所组成的双链DNA，这即是目标DNA分子，而其他的带有标记的分子均可以用能与标记物结合的树脂或介质(比如，针对生物素而言，可以用亲和素树脂)去除，最后留下的即目标分子。进一步，如图2所示，以产生一端带有平末端，另一端带有5’突出的双链DNA分子为例，本发明包括如下的步骤(1)根据DNA模板设计四条引物Oligo FA 正向引物，带有特殊标记；Oligo FB 正向引物，序列与Oligo FA相同，不带标记；Oligo RA 反向引物，带有特殊标记；Oligo RB:反向引物，比Oligo RA长，多出的序列即目标分子中所需要的5’突出的核苷酸序列，不带标记。按照前述思路，这两对引物采用如下方式组合使用Oligo FA/01igo RB 这对引物产生一条较长的DNA双链，其中，正义链带特殊标记，反义链不带标记；Oligo FB/01igo RA 这对引物产生一条较短的DNA双链，其中，正义链不带标记， 反义链带特殊标记。(2)按照上述配对情况，分别用设定好的引物对在模板上进行扩增，获得两种DNA 分子，利用凝胶电泳或硅胶柱对产物进行纯化。(3)将这两种DNA分子等摩尔比例混合，在复性缓冲液中，加热至95°C进行变性， 随后，缓慢降温至室温进行退火，此时，如图2所示，该体系内含有四种形式的DNA分子Isoform A 即Oligo FA/01igo RB的PCR产物，两条链变性后重新复性组成原来的分子，该分子正义链带有特殊标记，反义链无标记；Isoform B 即Oligo FB/01igo RA的PCR产物，两条链变性后重新复性组成原来的分子，该分子正义链无标记，反义链带有特殊标记；Isoform C 变性过程中，上述Isoform A的正义链与Isoform B的反义链结合在一起，形成一个具有3’突出末端的，两条链均带有特殊标记的DNA分子；Isoform D 变性过程中，上述Isoform A的反义链与Isoform B的正义链结合在一起，形成一个具有5’突出末端的，两条链均不带标记的DNA分子，该分子即我们所需要的目标DNA分子。(4)将这四种DNA分子的混合物与能特异性结合上述特殊标记的介质混合，在适当的结合缓冲液中，使带有标记的DNA分子结合到介质上，留在溶液中的分子即所需要的目标DNA分子。如果需要更高纯度，该步骤可以重复。(5)目标DNA分子可以用琼脂糖凝胶电泳或硅胶介质进行进一步纯化以去除其他杂质。进一步，如图3所示，以产生一端带有平末端，另一端带有3’突出的双链DNA分子为例，本发明包括如下的步骤(1)根据DNA模板设计四条引物Oligo FA 正向引物，带有特殊标记；Oligo FB 正向引物，序列与Oligo FA相同，不带标记;Oligo RA 反向引物，不带标记；Oligo RB:反向引物，比Oligo RA长，多出的序列即目标分子中所需要的3’突出的核苷酸序列的互补序列，带有特殊标记。按照前述思路，这两对引物采用如下方式组合使用Oligo FA/01igo RA 这对引物产生一条较短的DNA双链，其中，正义链带特殊标记，反义链不带标记；Oligo FB/01igo RB 这对引物产生一条较长的DNA双链，其中，正义链不带标记， 反义链带特殊标记。(2)按照上述配对情况，分别用设定好的引物对在模板上进行扩增，获得两种DNA 分子，利用凝胶电泳或硅胶柱对产物进行纯化。(3)将这两种DNA分子等摩尔比例混合，在复性缓冲液中，加热至95°C进行变性， 随后，缓慢降温至室温进行退火，此时，如图3所示，该体系内含有四种形式的DNA分子Isoform A 即Oligo FA/01igo RA的PCR产物，两条链变性后重新复性组成原来的分子，该分子正义链带有特殊标记，反义链无标记；Isoform B 即Oligo FB/01igo RB的PCR产物，两条链变性后重新复性组成原来的分子，该分子正义链无标记，反义链带有特殊标记；Isoform C 变性过程中，上述Isoform A的正义链与Isoform B的反义链结合在一起，形成一个具有5’突出末端的，两条链均带有特殊标记的DNA分子；Isoform D 变性过程中，上述Isoform A的反义链与Isoform B的正义链结合在一起，形成一个具有3’突出末端的，两条链均不带标记的DNA分子，该分子即我们所需要的目标DNA分子。(4)将这四种DNA分子的混合物与能特异性结合上述特殊标记的介质混合，在适当的结合缓冲液中，使带有标记的DNA分子结合到介质上，留在溶液中的分子即所需要的目标DNA分子。如果需要更高纯度，该步骤可以重复。(5)目标DNA分子可以用琼脂糖凝胶电泳或硅胶介质进行进一步纯化以去除其他杂质。下面对本发明的实施例作详细说明本发明的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1构建一个长度为62Ibp，一端为平末端，另一端有14bp 5，突出的DNA分子1. 1引物设计与合成以如图三所示的DNA分子为例，现需要合成一个长度为621bp，一段为平末端，另一段有14bp 5，突出的DNA分子，也就是说，该分子的正义链长621bp，反义链长63^p，反义链与正义链互补后，5’端多出来14个未配对的碱基。根据本发明的方法，设计如下四对引物，本实施例中，采用生物素(Biotin)作为特殊标记Oligo FA :5，-Biotin-ATGCTGGTTGCGCTGATCA-S' (SEQ ID NO 2)Oligo FB :5，-ATGCTGGTTGCGCTGATCA-3，(SEQ ID NO 3)Oligo RA 5' -Biotin-CTAACGGTTACCGATCAGGAAG-3，(SEQ ID NO :4)Oligo RB :5，-tgctcgacatgttcCTAACGGTTACCGATCAGGAAG-3，(SEQ ID NO :5)其中引物Oligo FA和Olido RA引物的5’端均用生物素进行标记，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，用HAP方法纯化。1.2PCR分别获得片段首先在生工生物工程(上海)有限公司用基于PCR的合成方法合成模板片段，该片段命名为K0378，片段的序列如SEQ ID N0:1所示。将该片段克隆至pUC57载体中，带有该片段的载体命名为PUC57-K0378。SEQ ID NO 1 atgctggttgcgctgatcaccctgacttttatccatttttgtgctctgatcactccaggtccggattt tttcctggtaagccaaaccgcggtatctcgctcccgcaaagaagcaatgctggtcgttgccggtatcactgcaggc gttctgttctgggcgtctctggccctgatgggtctgaacattatcttcgaaaagatggcttggctgaaacagggt ctgetgattgcaggcggcctgtatctgtgctggctgggctaccagatgctgcgttccgccttcagcaaaaaccag caggaagaggttacgaccgtcgaactgcctaaagctccgtacctgttcttcatgaaaggcctgctgaccaacctg tctaacccgaaagcagtgatttatttcggctccgtgttcagcctgtttctggctaatccgcagctggaccaggta cactggctgctgttcatcattgtgagcgttgagaccattctgtggttctgcttcgtgaccttcatcttctccctg ccgtcttttcgtgcggcgtaccgtaacttctctaagtggatcgacggtatttctggtggcatctttaccgttttc ggtatcttcctgatcggtaaccgttag以该质粒DNA为模板，分别用引物对Oligo FB/01igo RA和Oligo FA/01igo RB 使用pfu DNA polymerase进行PCR扩增，反应体系如下
权利要求
1.一种制备带有突出末端的双链DNA分子的方法，包括下列步骤1)根据模板以及对应目标DNA分子的序列，分别设计带有标记的正向引物、不带标记的正向引物、带有标记的反向引物及不带标记的反向引物；2)将带有标记的引物与不带标记的引物交叉配对，分别PCR扩增模板获得两组扩增产物；3)将步骤2获得的两组扩增产物混合，变性后退火；4)纯化分离出退火产物中不带标记的分子，该不带标记的分子即为带有突出末端的目标DNA分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，引物的设计原则是由不带标记的正向引物和带标记的反向引物扩增所得到的DNA的正义链与目标DNA分子中的正义链一致；由带标记的正向引物和不带标记的反向引物扩增所得到的DNA的反义链与目标DNA分子中的反义链一致；由不带标记的正向引物和带标记的反向引物扩增所得到的DNA的正义链与由带标记的正向引物和不带标记的反向引物扩增所得到的DNA的反义链所组成的DNA 分子为目标DNA分子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标DNA分子是指带有突出末端的双链DNA分子，该DNA分子的一端或者两端，其中的一条链有比其互补链多余的碱基，多余碱基的数量为一个或多个。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记是指，可以通过共价键连接到DNA 分子上，而不影响DNA本身特性和功能的一类具有特定结构和功能的分子或基团。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标记选自生物素、双生物素、地高辛、 Nitrondole 禾口 Cholesteryl0
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中两组扩增产物等摩尔比例混合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4采用能与所述标记结合的树脂或介质去除退火产物中带标记的分子来分离出目标DNA分子。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述能与所述标记结合的树脂或介质为结合有亲和素、链霉亲和素、抗生物素抗体、抗地高辛抗体、抗Nitrondole抗体或抗 Cholesteryl抗体的树脂或介质。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4还结合其他常用的DNA纯化方法进一步纯化以去除杂质。
全文摘要
本发明提供了一种制备带有突出末端的双链DNA分子的方法。本方法利用带特殊标记的引物，通过带特殊标记的引物与不带标记的引物的不同组合，分别在模板DNA上扩增获得不同长度的DNA片段，这两种DNA分子通过变性和退火后，由不带标记的DNA链组成带有突出端的DNA分子，而带有标记的非目标DNA分子可以用与该标记结合的介质去除。利用本发明的方法可以产生通常用限制性内切酶方法不能产生的粘性末端，该粘性末端可以是5’突出，也可以是3’突出，突出的长度可以是任意多个，对模板DNA的序列、长度以及突出段的序列均无特殊要求。该方法操作简便，适合小量或大量生产。
文档编号C12N15/10GK102559660SQ20121001440
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者李威, 李彬 申请人:生工生物工程(上海)有限公司