一种荧光同步检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒的制作方法

专利名称：一种荧光同步检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于诊断试剂一核酸诊断技术领域，具体涉及一种灵敏度高、特异性强、适合于常规血液核酸筛查的同步提取和同步实时检测肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)和艾滋病毒核酸的方法和试剂盒。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)统计，超过一半国家没有对献血者献出的血液进行彻底检验，导致艾滋病、肝炎、疟疾和梅毒等疾病在很多地方泛滥。全球每年增加的560万名艾滋病毒携带者中，有5% 10%的人是经由输血或血液制品而感染的。在非洲儿童和妇女中病毒携带者的比例高达20% 25%。20世纪80年代以来，法国、日本、罗曼尼亚、美国、德国以及中国等国家都曾因血液筛查欠缺而导致过严重的后果。血液传染病一旦在一个地方发生，往往会造出爆炸性传播，因此输血安全对人民的安全和社会的稳定有着极其特殊的意义。临床血液检测也面临日益剧增的检测压力。据WHO估计，我国艾滋病感染人数到2010将达到1000万，并持续高速增长。我国60%以上的人曾受到乙肝病毒的感染，最终有1/10左右的人发展成为乙肝表面抗原阳性。另外，在所有肝炎中慢性化程度最高的丙型肝炎，发病人数也达到4000万左右。与血液安全的极端重要性相比，目前的检测手段还远远滞后于社会的需要。目前对输血安全性构成严重威胁的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV-1)主要采用酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)进行检测。虽然经过了几代的改良，在灵敏度、特异性、精密度以及稳定性等方面取得了长足的进步，但作为一种间接滞后的检测方法，它所检测的是病毒所引发的人体抗体而不是病毒本身，因此不能够消除对“窗口期”标本的漏检，所谓“窗口期”即在被感染早期，体内还未产生抗体或抗体在检测限以下，此时的血清学检测一般为阴性，而HBV、HCV、HIV-1病毒感染产生的抗体的窗口期又特别长，其中丙型肝炎病毒(HCV)的窗口期约为66 82天，乙型肝炎病毒(HBV)和人类免疫缺陷综合症病毒I型(即艾滋病毒I型，HIV-1)的窗口期分别为约59天和22天。另外，由于病毒的突变等原因也造成了部分免疫学方法检测漏检的可能。所以免疫学诊断方法存在固有的缺陷，不能杜绝漏检——检测方法的滞后已给输血安全和临床检验带来严重威胁。近年来，核酸技术的发展和逐渐成熟为人们直接检测病毒的存在提供了最有力的工具。核酸扩增技术(Nucleic acid Amplification Technology, NAT)就是这一类技术的统称。核酸检测的是病毒基因本身，是在最根本的层面上对病毒的检测。核酸检测大大缩短了病毒检出的窗口期，并具有极高的灵敏度、特异性、精密度和稳定性。事实证明NAT检测可将HBV、HCV和HIV-1感染的平均“窗口期”分别缩短25天、59天和11天，分别缩短“窗口期”45%、89%和50%。正因为如此，越来越多的国家认识到血液核酸检测的重要性，在西欧等国家作为强制性指标在临床输血及血制品中执行，同时，美国、日本、欧盟已将NAT检测纳入献血者的常规筛查 项目。国外已有多个单项核酸检测产品投放市场。美国、澳大利亚、加拿大等国家相继有产品问世。罗氏公司也开发了核酸诊断试剂盒。但这些试剂盒要么是开放性的PCR-ELISA检测模式，要么操作繁琐、易发生检测污染，并且都是单个指标单次检测，这些缺陷使之很难适应市场现状的需要。分析这些核酸诊断试剂的现状，主要存在以下几点不足:I)试剂是开放式的，污染的可能性大；自动化程度低，而自动化和全封闭性事核酸检测最关键的技术瓶颈。2)试剂为单项检测的，没有一个血筛试剂可以同步提取、同时实时检测多种病毒核酸(如，HBV、HCV和HIV-1)，如FDA批准的罗氏血液筛查试剂均为单项操作，使用的扩增程序各不相同，检测过程也不尽相同；FDA批准的另一家GEN-PR0BE公司所使用的TMA技术可以同时扩增HCV与HIV-1，但不能同时扩增HBV ;另外检测要么是不同管操作，各测各的，要么是同管操作，但一旦测定结果为阳性时却不能分辨是HCV还是HIV-1。迄今为止，美国FDA只批准过上述两个产品可用于血液核酸筛查。3)操作繁琐，重复性差，通量低，不适于临床检验和大规模的血液筛查。4)兼容性差，大多提供核酸提取试剂的厂家往往不提供扩增检测试剂或者二者不能很好的匹配，需要用户调整甚至优化；有的能提供匹配试剂，却又不一定适用于特定的核酸自动提取仪；及时上述条件得到满足，用户还要根据扩增检测试剂的要求选用指定的仪器，如 COBAS AMPLIC0R 等。5)试剂往往不是即用型的，例如使用前需要溶解干粉、在一些瓶瓶罐罐中加入指定量的乙醇或异丙醇等有机试剂，有的试剂使用前还有复杂的配制工作，稍有不慎就造成试验的彻底失败。不同人员的操作还引入试剂准备这一步骤的操作误差；并且某些试剂一旦开封后或复融后即使低温保存有效期也只有几天，尤其不适于标本量较少情况下的多批次反复使用，也不利于核酸检测在大中型医院检验科室的广泛应用，成为血液筛查和临床核酸检验方法发展的瓶颈之一。因此，本领域迫切需要开发适合于常规血液核酸筛查的自动化、高通量、多项目的同步核酸提取和实时扩增检测技术平台及可应用于规`模化生产的性能稳定、可操作性强、即用型试剂的试剂盒，并有相关的仪器、耗材与之匹配。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，由高温变性、低温退火(复性)和适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA/RNA的地方。实时荧光定量PCR技术，即PCR荧光定量检测是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是一种在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针(TaqMan探针)，利用荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具体为利用Taq DNA聚合酶5' —3' DNA聚合酶和5' —3'核酸外切酶活性，对目的片段进行扩增及对TaqMan探针进行切割进而产生荧光信号，实现对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、单管操作无污染、实时和准确的特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
荧光定量PCR检测技术有如下不足:DPCR荧光定量检测需一对扩增引物和一条TaqMan荧光探针，三条寡核苷酸序列均需保守，扩增片段长度范围100 150bp，且在引物及TaqMan探针设计方面有诸多要求和限制条件；2)PCR反应组分包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+浓度等诸多因素需优化；3) PCR反应耗时长；4)易产生PCR产物污染等。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'-末端，而淬灭剂则在3'-末端。常用的荧光基团是FAM，TET, VIC和HEX等。本发明利用TaqMan探针报告荧光基团与淬灭荧光基团相互作用的机制，在不进行PCR反应的条件下，实现对肝炎和艾滋病毒的定性检测。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能同步提取HBV、HCV、HIV-1病毒的核酸、同步实时检测HBV、HCV、HIV-1病毒的核酸的试剂盒，以克服传统蛋白质检测和荧光定量PCR检测固有的缺陷和不足，同时弥补现有国内外同类产品的诸多不足乃至方法学上无法解决的致命缺陷。本发明提出一种能同步提取并同步实时检测血清或血浆中HIV-1、HBV、HCV病毒核酸是否存在的方法和试剂盒。按照本发明所述的方法包括以下三项相对独立又相互关联的内容，并且提供了可选的组合以提供完整实现本发明所述的试剂盒。1、本发明提供了一种基于核酸杂交特异性同步捕获提取HBV、HCV、HIV-1核酸的方法，其特征是选用了 HBV、HCV、HIV-1各自保守序列特异性的生物素修饰的寡核苷酸序列作为核酸提取试剂的捕获探针，保守序列的选择不受传统方法后续PCR检测所用特异性引物的限制，因此作为捕获探针的保守序列可选择范围更为广泛。2.本发明提供了一种变通的通用捕获核酸的方法，即设计一段中间探针，无修饰的普通寡核苷酸其3'-端连接有一段polyA序列01igo(dA)18 25,作为中间杂交的主干探针，使用生物素修饰的Oligo(ClT)25作为通用捕获探针；中间探针的5'-端核酸序列作为特异性识别检测项目中病毒核酸的“识别臂”，杂交并捕获病毒核酸，而3'-端的Oligo (dA) 25作为生物素化的Oligo (dT) 25的识别位点，为其捕获,最后杂交形成杂交复合体为链亲合素包裹的磁珠所吸附，经洗涤液Wl和W2的洗涤，出去非特异性杂交物如变性蛋白和糖类等杂质，最后磁珠进入洗脱液，经加热操作，核酸模板从杂交复合体洗脱下来进入洗脱液，而仍吸附着生物素化Oligo (dT)25的废磁珠经仪器自动移走，洗脱液即可作为荧光互补探针杂交检测的模板。该方法的优点是生物素标记的Oligo (dT) 25是一致的，结合效率仅取决于设计的中间探针的杂交效率。主干探针是包含有HBV、HCV、HIV-1特异性探针序列的线性排列的寡核苷酸片段，作为一条三联体探针，HBV、HCV、HIV-1特异性探针序列之间间隔有连接臂如3 8个T或A，生物素修饰通用捕获探针的5,-端，这样可省去一些链亲和素包裹磁珠的量，相应可以提高磁珠的量，有利于检测灵敏度的进一步提高。
3、本发明通过了一种基于荧光互补探针杂交同步检测肝炎和艾滋病毒的方法，其技术原理为:
根据目的基因保守区设计一条探针序列( 30bp)，分别在5'-和3'-端标记发射荧光基团(如，FAM)和淬灭荧光基团(NFQ)，当单条探针存在时，由于其两端两个荧光基团距离较远而不会引起荧光淬灭效应，即有荧光产生(类似分子信标〈molecular beacon)与目的基因结合时发射荧光的原理)；并以该探针序列的反义链作为另一条探针序列，分别在5'-和3'-端标记另一种发射荧光基团(如，HEX)和淬灭荧光基团(NFQ)，同样，当单条探针存在时，由于其两端两个荧光基团距离较远而不会引起荧光淬灭效应。当两条互补探针发生配对，由于一条探针的发射荧光基团与另一条探针的淬灭荧光基团相互靠近而发生荧光淬灭效应，则两条探针均不产生荧光信号；当一条探针与某条目的基因核酸片段发生配对，其互补链探针无法与该探针结合而失去对该探针的荧光淬灭效应，则可产生一个荧光信号。理论上，一条目的基因DNA双链可产生两个荧光信号。经变性与复性操作后，可定量检测目的基因片段数量、浓度等。假设FAM探针量多于HEX探针量，FAM本底荧光值为FfamI，HEX本底荧光值为0，当探针与模板发生配对，此时FAM荧光值为Ffam2(Ffam2 > FfamI), HEX荧光值为FtexI。由于探针与模板之间配对几率远大于模板间配对几率，因此模板在变性解链后，所有DNA/RNA单链与探针配对。无论Ffam2如何增加，模板量即Fhra￡l。本发明将基于荧光互补探针杂交法同步检测肝炎和艾滋病毒的试剂盒中的HBV、HCV, HIV-1各自特异性互补探针中的FAM探针量均略高于HEX探针量，使得检测结果均以HEX荧光值为准，故可将HEX探针称为检测探针，并以此实现对肝炎和艾滋病毒的快速定性检测。综上所述，本发明在于提出了一种检测HBV、HCV、HIV-1病毒核酸的试剂盒，包括同步提取HBV、HCV、HIV-1核酸的磁珠提取试剂及一次性耗材和核酸检测试剂及相关耗材，其中含有去抑 制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液W1、洗涤液W2、洗脱液和内对照等。匹配仪器可使用上海复星长征医学科学有限公司制造的SuperPure System-32等。上述提到的裂解液为裂解血清、血浆等体液标本中病毒颗粒的异硫氰酸胍溶液，具体为 4 6M 异硫氰酸胍，20 50mM Tris, PH6.0 8.0，I % 20% NP-40，1% 20%Triton X-100,0.1% 10% SDS，0.01 I μ M捕获探针，1% 10%聚合物；其中捕获探针对 HBV 为〈SEQ ID N0.9>，对 HCV 为〈SEQ ID N0.10>，对 HIV-1 为〈SEQ ID N0.11>，纯度为PAGE或HPLC ;所述磁珠悬液为含有TWEEN 20的超顺磁材料的磁珠，表面包有均匀一层亲和素，直径为0.1 10 μ m,含有BSA> NaN3成分，如Invitrogen公司、Promega公司、Roche公司等生产的磁珠；所述洗涤液Wl和W2为含氯化钠的溶液，具体为洗涤液Wl:LiCl, TrisPH7.0，十二烷基磺酸锂，防腐剂及TWeen20等分散剂，色素如品红或其它燃料等，其中LiCl的浓度范围为0.15 3M，Tris的浓度范围为10 100M，pH范围为6.0 8.0，十二烷基磺酸锂浓度为1%，防腐剂为NaN3^ProClin 300等，Tween20的浓度范围为0.001%— 0.1% ；洗涤液W2:成分与洗涤液Wl相仿但不含十二烷基磺酸锂和色素，LiCl浓度范围为0.1 IM ;所述去抑制剂为含有蛋白酶和甘油的醇溶液；所述洗脱液为DEPC处理过的纯化水配制的Tris缓冲液，加有Tween 20分散剂和EDTA、NaN3和DTT。本发明中，标本提取所用的中间探针(存在于裂解液中)为〈SEQ ID N0.12>和〈SEQ ID N0.13>。所述核酸捕获探针为:HBV检测探针针对HBV核心区(C区)的编码基因中的一段基因片段〈SEQID N0.9>
5' -Biotin-ACC ACC AAA TGC CCC TAT—3'；HCV检测探针针对HCV基因序列中5 '-非转录区(UTR区)的一段序列〈SEQIDN0.10>5' -Biotin-AGT ACC ACA AGG CCT TTC G-3/ ；HIV-1检测探针针对HIV-1gag区基因序列〈SEQ ID N0.11>5' -Biotin-CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TC-3/ 。所述探针为TaqMan探针，包括内标探针和三种病毒的检测探针，其中，三种病毒的互补检测探针均采用相似的荧光基团标记形式:一条探针采用FAM荧光基团标记，其互补探针采用HEX基团标记；内标互补探针中一条探针采用FAM荧光基团标记，其互补探针采用ROX基团标记，且每一对互补的荧光标记探针，均为FAM探针量稍多于非FAM探针量。本发明所用探针为TaqMan-MGB非荧光淬灭基团探针，由于常规TAMARA淬灭基团为荧光淬灭基团，自身带有荧光，故在多重反应中汇产生荧光相互叠加干扰，而且其本身为以荧光基团占据了仪器的一个检测通道，故选用非荧光淬灭基团NFQ作为淬灭基团；本发明中所采用的探针序列为:HBV的互补Taqman探针为:<SEQ ID N0.1>5' -FAM-CGA CGA GGC AGG ACC CCT AGA AGA A-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.2>5' -HEX-TTC TTC TAG GGG TCC TGC CTC GTC G-NFQ-3;；HCV的互补Taqman探针为:<SEQ ID N0.3>5' -FAM-CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC-NFQ-3'，<SEQ ID N0.4>5' -HEX-GTG TAC TCA CCG GTT CCG CAG-NFQ-3'；HIV-1的互补Taqman探针为:<SEQ ID N0.5>5' -FAM-CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA-NFQ-3'，<SEQ ID N0.6>5' -HEX-TAT CCC ATT CTG CAG CTT CCT CAT TGA TGG-NFQ-3'；内标的互补Taqman探针为:〈SEQ ID N0.7>5' -FAM-AAT GTA ACA GAA AAC TTT AAC ATG TGG AAA-NFQ-3'，<SEQ ID N0.8>5' -ROX-TTT CCA CAT GTT AAA GTT TTC TGT TAC ATT-NFQ-3'，
且，每一对互补的荧光标记探针，均为FAM探针量稍多于非FAM探针量；并将4对探针等浓度等体积混合，制成探针混合液，每条探针浓度约为5 μ M0所述2XAnnealing Buffer 为退火缓冲液，具体为含 30mM Tris.HCl (ρΗ8.4),50mM KCl,2mM MgCl2, 5mM DTT 和 1.5% 甲酰胺。所述阳性对照为:含有部分HBV DNA, HCV RNA、HIV-1RNA片段的混合物，均为与待测项目的荧光探针序列互补的一段基因DNA或RNA，并在3 '-端连接有polyA序列Oligo (dA)18 25以被通用杂交探针捕获，其中HBV阳性对照为一段DNA序列，HCV阳性对照为一段RNA序列，HIV-1阳性对照为一段RNA序列，三者混合物适当稀释后保存于核酸稳定液中作为试剂盒的阳性对照；所述内对照为一段RNA序列，与检测项目的探针结合区不同，不能结合检测探针，只能结合特异性的内标探针，并在3 '-端连接有polyA序列Oligo(ClA) 18 25以被通用杂交探针捕获；所述的内标探针为一段人工合成的与检测项目无关的寡核苷酸序列，其检测探针的报告荧光基团与待测项目的报告荧光基团不同，以便区分同一份标本的检测结果和内对照结果，为避免实验假阴性，须在每个检测管中设立对照，即内对照，且内对照的检测结果必须为阳性；所述阴性对照为正常献血员的血浆。本发明试剂盒的标本处理所采用的是磁珠提取法。该技术使用链亲合素磁珠(基于核酸杂交原理)，由于DNA和RNA均有相同的杂交性能,所以以便认为该方法对DNA和RNA有相似的提取效果，通过多次洗涤后除去杂质，最后将核酸在低盐或水中洗脱下来作为核酸扩增检测的模板。该技术一方面避免了传统方法中使用酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，另一方面引入了机械化操作，高通量自动化操作或半自动化操作，减少了人为操作因素对实验结果的影响；且相关技术人员可通过短时间培训即可掌握其操作流程并掌握其技术要领。本发明的试剂盒组成中使用内对照质控系统，即在裂解液中加入特定序列的内对照RNA，与待测项目共同经过裂解、纯化、检测等步骤。该内对照序列含有与待测项目无关的核苷酸片段，所用内对照探针为该核苷酸片段序列特异性的TaqMan探针。如果试验结果为待测项目与内对照均为阴性，则表明试验失败，试验效果无效。不含内对照的试验方案尽管缺少了一道质控标准，但不影响试剂盒的正常使用。本发明的试剂盒作为一种定性检测的试剂，但不排除可以作为定量检测的试剂:血液筛查的意义在于定性分析，侧重于试剂的灵敏度和特异性；临床检测及药物疗效侧重于定量分析。

本发明的试剂盒需配合核酸磁珠提取仪及荧光定量PCR仪使用。本发明具有以下几方面的优势:I)自动化程度高，减少了人工操作，避免了可能的污染及人为误差；2)多种核酸病毒同时提取，同步实时检测；3)无需PCR反应，避免了 PCR产物污染；4)封闭性检测、灵敏度高、特异性好、精密度高、稳定性好、便于操作；5)适用于大规模高通量的血液筛查，如血液中心和血液制品生产企业等开展核酸筛查；6)整个流程时间短、效率高。


:图1为磁珠法提取核酸操作步骤示意图；图2为荧光互补探针杂交法原理示意具体实施方式
实施例1生物素修饰捕获探针及阴阳性对照的制备I生物素修饰通用杂交捕获探针的构建:委托生工生物工程(上海)有限公司合成以下序列:<SEQ ID N0.12>5' -ACC ACC AAA TGC CCC TAT TTT TTT AGT ACC ACA AGG CCT TTCG AAA AAACTA TGT TTC CCC TTG GTT CTC TC AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA-3'和<SEQ ID N0.13>51 -Biotin-Oligo (dT) 25。2阳性对照的构建:委托生工生物工程(上海)有限公司合成以下序列:HBV DNA阳性对照序列:<SEQ ID N0.14>5' -CGA CGA GGC AGG ACC CCT AGA AGA AM MA MA AM AMMA AM AM-3,；HCV RNA阳性对照序列:<SEQ ID N0.15>5' -CUG CGG AAC CGG UGA GUA CAC AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA-3,；HIV-1 RNA阳性对照序列:<SEQ ID N0.16>5' -CCA UCA AUG AGG AAG CUG CAG AAU GGG AUA AAA AAA AAMAA AM AM MAAAA-3;。3内对照的构建:委托生工生物工程(上海)有限公司合成包含以下序列的质粒:<SEQ ID N0.17>5' -AAU GUA ACA GAA AAC UUU MC AUG UGG AM AM MA AAAMA AAA AAA AMAAA-3;。实施例2标本处理:核酸提取的磁珠法及试剂配制I基于核酸杂交原理的标本处理试剂组成:裂解液:5M异硫氰酸胍，50mM Tris, PH8.0,10% NP-40,10% Triton X-100,6%SDS，I μ M捕获探针，5%聚合物等；其中捕获探针对HBV为〈SEQ ID N0.9>，对HCV为〈SEQID N0.10> 为〈SEQ ID N0.11>。磁珠悬液:lmg/mL链亲合素包裹的磁珠,含有防腐剂及Tween20等分散剂；洗涤液Wl:LiCl，Tris ρΗ7.0，十二烷基磺酸锂，防腐剂及TWeen20等分散剂，色素如品红或其它燃料等；洗漆液W2:LiCl, Tris ρΗ7.0,防腐剂及Tween20等分散剂等；去抑制剂:含有蛋白酶和甘油的醇溶液；洗脱液:DEPC处理过的纯化水配制的Tris缓冲液，加有Tween 20分散剂和EDTA、
NaN3 和 DTT 等；
内参照:约含有40000copies/mL内参照的RNA溶液，使用时将其以1: 20比例加入到裂解液中，在裂解液中内参照的浓度约为2000COpieS/mL，美国测试加入100 μ L裂解液参与提取。2操作流程:I)取专用96孔槽(试剂盒核酸纯化专用)，用排枪分别向96孔槽各列内提取试齐U，如下:第I列和第7列加入20 μ L去抑制剂、100 μ L裂解液、100 μ L磁珠悬液、待测标本血清100 μ L和10 μ L内参照，96孔槽孔壁避免有液滴附着，并反复吸打数次使混匀；第2列和第8列加入200 μ L洗漆液Wl ;第3、4、9和10列加入200 μ L洗漆液W2 ;第6列和第12列加入100 μ L洗脱液；第5列和第11列为空白。2)启动SuperPure System-32,在提取仪中装入梳子,执行核酸抽提程序,运行大约I小时，结束后取出96孔槽，并将第6孔内RNA核酸提取液转移至EP管内，-20°C保存。
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实施例3核酸检测:荧光互补杂交探针检测体系模式及试剂配制I荧光互补探针杂交反应液的配制:2 X Annealing Buffer:退火缓冲液中含 30mM Tris.HCl (pH8.4), 50mM KCl, 2mMMgCl2, 5mM DTT 和 1.5% 甲酰胺；荧光探针混合液:含5μΜ HBV、HCV、HIV-1和内标荧光互补探针，稳定剂及缓冲液。每一对互补的荧光标记探针，均为FAM探针量稍多于非FAM探针量；并将4对探针等浓度等体积混合，制成探针混合液，每条探针浓度约为5 μ M0试剂配比及配制:将2XAnnealing Buffer和荧光探针混合液按照25 μ L:5μ L的比例混合，并加入20 μ L核酸样本,反应液体积为50 μ I,上机进行荧光互补杂交探针检测。
权利要求
1.一种检测艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎核酸的试剂盒，为一种同步提取并荧光互补探针杂交同步检测肝炎和艾滋病毒的方法及试剂盒，其特征在于包含去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗漆液、洗脱液、内对照、2 X Anneal ing Buffer、突光探针、阳性对照、阴性对照,其中，所述的去抑制剂为含蛋白酶的醇溶液；所述裂解液为裂解血清、血浆样本中病毒颗粒的异硫氰酸胍溶液，并含有由生物素修饰的寡核苷酸作为核酸提取的捕获探针；所述洗涤液为含氯化钠的溶液；所述洗脱液为低盐缓冲液；所述磁珠悬液含链亲和素包裹磁珠；所述2X Anneal ing Buffer为退火缓冲液；所述荧光探针为HBV、HCV、HIV-1和内标特异性的各自两条互补的Taqman探针；所述阳性对照为含有与HBV、HCV、HIV-1荧光探针序列对应互补的一段DNA或RNA ;所述阴性对照为正常献血员的血浆；所述内对照为不同于HBV、HCV,HIV-1荧光探针序列的一段内标RNA，可于内标探针特异性结合；其中: HBV的互补Taqman探针为:〈SEQ ID N0.1>5' -FAM-CGA CGA GGC AGG ACC CCT AGA AGA A-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.2>5' -HEX-TTC TTC TAG GGG TCC TGC CTC GTC G-NFQ-3;； HCV的互补Taqman探针为:〈SEQ ID N0.3>5' -FAM-CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.4>5' -HEX-GTG TAC TCA CCG GTT CCG CAG-NFQ-3'； HIV-1的互补Taqman探针为:〈SEQ ID N0.5>5' -FAM-CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.6>5' -HEX-TAT CCC ATT CTG CAG CTT CCT CAT TGA TGG-NFQ-3'； 内标的互补Taqman探针为:〈SEQ ID N0.7>5' -FAM-AAT GTA ACA GAA AAC TTT AAC ATG TGG AAA-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.8>5' -ROX-TTT CCA CAT GTT AAA GTT TTC TGT TAC ATT-NFQ-3;， 且，每一对互补的荧光标记探针，均为FAM探针量稍多于非FAM探针量；并将4对探针等浓度等体积混合，制成探针混合液，每条探针浓度约为5 μ M0
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于使用荧光互补探针杂交体系单管一步法同时对肝炎和艾滋病毒进行检测，检测项目包含DNA及RNA病毒；含有内对照作为每个测试的全程监测质控。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于使用生物素及寡聚核苷酸修饰的捕获探针快速纯化内对照RNA、阳性对照DNA/RNA及样本核酸。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所说的裂解液中含有标本提取所用的捕获探针:对于HBV为:〈SEQ ID N0.9>.5' -Biotin-ACC ACC AAA TGC CCC TAT-3'； 对于HCV为:〈SEQ ID N0.10>.5' -Biotin-AGT ACC ACA AGG CCT TTC G-3/ ； 对于HIV-1为:〈SEQ ID N0.11>.5' -Biotin-CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TC-3/ 。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所说裂解液中含有标本提取所用的中间探针:〈SEQ ID N0.12>5' -ACC ACC AAA TGC CCC TAT TTT TTT AGT ACC ACA AGG CCT TTCG AAA AAA CTATGT TTC CCC TTG GTT CTC TC AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA-3;和〈SEQ ID N0.13>5' -Biotin-Oligo (dT) 25。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于裂解液的组成为:4 6M异硫氰酸胍，20 50mM Tris, PH6.0 8.0，I % 20% NP-40，1% 20% Triton X-100,0.1% 10%SDS，0.01 I μΜ捕获探针，1% 10%聚合物；其中捕获探针对HBV为〈SEQ ID N0.9>，对HCV 为〈SEQ ID N0.10>为〈SEQ ID N0.11>，纯度为 PAGE 或 HPLC ;所述磁珠悬液为含有TWEEN 20的超顺磁材料的磁珠，表面包有均匀一层亲和素，直径为0.1 10 μ m，含有BSA、NaN3成分；所述洗涤液为含氯化钠的溶液；所述洗脱液为DEPC处理过的纯化水配制的Tris缓冲液，加有Tween 20分散剂和EDTA、NaN3和DTT。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述2XAnnealingBuffer为缓冲液中含 30mM Tris.HCl (pH8.4), 50mM KCl,2mM MgCl2, 5mM DTT 和 1.5% 甲酰胺。
8.如权利要求1中所述的一种荧光互补探针杂交同步检测肝炎和艾滋病毒的试剂盒，其特征在于:所述的杂交反应液的配制和检测程序如下: a、荧光互补探针杂交反应液的配制: 将2XAnnealing Buffer和荧光探针混合液按照25 μ L: 5μ L的比例混合，并加入20 μ L核酸样本,反应液体积为50 μ L ; b、荧光互补探针杂交检测反应程序: [1]95°C2min [2]94°C2min[3]经20min 冷却至 25°C IOmin 于第三步25°C，每隔30s采集一次荧光[4]End。
全文摘要
本发明属于核酸诊断技术领域，具体为一种同步提取并荧光互补探针杂交同步检测肝炎和艾滋病毒的方法及试剂盒。该方法包括以磁珠作为自动化介质，通过生物素及寡聚核苷酸修饰的捕获探针特异性同步捕获HBV、HCV、HIV-1核酸的方法和实时同步多项检测的基于Taqman探针的荧光互补探针杂交法。相应的试剂盒包括去抑制剂、裂解液、磁珠悬液、洗涤液、洗脱液、内对照、2×Annealing Buffer、荧光探针、阳性对照、阴性对照。本发明的特点是无需PCR反应、单管操作、封闭性检测、自动化程度高、多种病毒核酸同步提取，同步实时检测；灵敏度高、特异性好、精密度高；适用于大规模血液筛查、临床检验及科研单位使用。
文档编号C12Q1/70GK103184297SQ20111044859
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者迟大利, 吴大治, 夏懿 申请人:上海复星医学科技发展有限公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司