专利名称：华法林药物基因vkorc1和cyp2c9突变检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及PCR技术和高温连接酶(LDR)技术检测试剂盒，特别涉及到特异性引物的多种PCR和多重LDR技术检测华法林药物基因VKORCl和CYP2C9常规突变的试剂盒。
背景技术：
华法林是一种香豆素类口服抗凝药，广泛用于预防和治疗静脉血栓、肺栓塞、慢性心房纤维颤动、心肌梗塞、缺血性休克等多种血栓性疾病和人工心脏瓣膜植入手术，它的抗凝效果超过了目前批准的其它口服类抗凝药。但是华法林的剂量很难掌握，因为不同病人的所需用量可以相差十倍，而且使用不恰当的剂量会导致出血等严重不良反应。在过去二十年中，由于华法林治疗指数窄，剂量个体差异大以及有出血危险，使得它位居严重药物不良反应药物的前十名。美国每年新增华法林使用者二百万。在中国，每年使用华法林的患者超过四百万。患者口服华法林通常逐渐增加剂量，同时监测凝血酶原时间国际标准化比率(INR)，使之保持在2-3之间。但要达到稳定剂量通常需要几个月的时间[4’5]。因此华法林剂量过高，患者就会有出血的危险，剂量过低则达不到治疗效果。华法林剂量、抗凝稳定性和出血危险性受年龄、性别、体重、疾病、饮食中维生素K摄入等环境因素、以及遗传变异等因素的影响，其中遗传变异是主要影响因素。目前，已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位I基因(VKORCl)的基因多态性和细胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素。维生素K环氧化物还原酶(VKOR)是华法林作用的靶蛋白。华法林通过抑制VK0R，使无活性的氧化型(还氧化物型)VK无法还原为有活性的还原型(氢醌型)VK而起到抗凝作用。多个VKORCl的SNP (单核苷酸多态性)位点被发现与华法林用量个体差异相关，其中常见的两个SNP是第一内含子的1173C > T和3’ UTR的1639G > A。这些SNP位点呈高度连锁不平衡，经单倍型分析分为A、B两组单体型，A组(Hl和H2)与华法林低剂量相关，B组(H7、H8和H9)与高剂量相关。CYP2C9是华法林最主要的代谢酶。到目前为止，已发现的CYP2C9的等位基因有30种，其中以*1(野生型)、*2(Argl44CyS)、*3(Ile359Leu)最为常见。携带有变异性等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明显低于野生型，并且，其出血的危险性增加2 3倍。最近已有学者对这两个基因在华法林个体差异中的贡献大小进行了研究，这些研究显示VKORCl和CYP2C9的多态性对华法林用量个体差异的贡献比例分别6-37%和5_22%。近年来，一些针对特定人群，结合遗传因素和非遗传因素的华法林稳定剂量预测算法相继出现。但这些算法在广泛应用于临床之前，必须进行前瞻性的随机病例*对照研究，以评价其安全性和剂量预测的可靠性。在2007年8月，美国FDA更新了华法林药物说明，建议R144C突变体(CYP2C9*2)和I359L突变体(CYP2C9*3)和VK0RC1*1639G > A携带者降低华法林起始用量。但是并没有提供一个使 用遗传因素预测华法林个体治疗剂量的特殊方法。近年来针对华法林的基于药物基因组学的前瞻性研究仅见于欧美国家白种人的报道，由于存在人种间的差异，有必要对其他种族人群特别是中国人进行研究。
中国每年服用华法林的患者超过400万，而VKORCl和CYP2C9基因与华法林剂量具有很好的相关性，通过VKORCl和CYP2C9基因指导临床用药将为国家节约数十亿元的治疗费用。本研究就VKORCl和CYP2C9基因在中国苏北人群中的变异情况，来预测它们跟华法林剂量的关系，更科学地指导临床华法林的用药剂量，为华法林的个体化用药指明方向。华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变的检测方法通常是直接测序，但该方法步骤繁琐，试验周期长，对操作人员技术水平要求高，因此难以在临床大面积推广。更为重要的是测序技术本身灵敏度不高，只能检测15%以上的突变。而肿瘤组织是一个异质性的组织，VKORCl和CYP2C9突变又是一种杂合性突变，即EGFR基因DNA双链中有一条发生突变，而这种突变在检测样本中的比例小于15 %，测序方法根本就无法检出。高温连接酶(LDR)技术是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。我们基于测序分型技术的LDR试剂盒是针对临床应用设计，填补了国内外基因分型及DNA多态性检测在临床分子诊测应用上的空白。与传统的直接测序法相比，LDR测序分型试剂盒有如下显著优势:I)降低成本:测序反应的所有相关试剂完全由ABI或Beckman这样的大型国外企业掌握，试剂成本非常昂贵，而LDR技术则由于操作简单，试剂要求也非常简单，可大幅度降低成本。2)简化操作:直接测序法一般要经过PCR反应条件优化、PCR产物纯化、测序引物设计、测序反应化学类型选择等步骤，单是PCR产物纯化就是一个操作难点，而应用LDR测序分型试剂盒可以免去纯化这一繁琐的步骤，使得检测操作变得简单方便，同时也提高了检测结果的可靠性和准确性；方便了临床的开展3)提高数据量:DNA序列的测定只是针对某一区段进行的，而这一选定区段内医生和患者关心的一般只是其中的一个位点，而基于LDR技术的检测系统可`以同时进行多位点的SNP分型，这一高通量的特点不仅提高了临床检测的效率，也是很大程度上为病人节省了本需要多次检测的相应费用。4)操作简单流程短，从DNA制备开始，仅需要5个小时，而测序往往要超过8个小时。其中DNA制备0.5小时，PCR需2 3小时，LDR需0.5 I小时，测序时间需0.5小时，方便临床的开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多重PCR和LDR技术的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变检测试剂盒，可用于临床华法林药物基因常见突变检测。本发明的技术路线为:1，针对华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变位点VKORCl 1173G/T、VKORCl 1639C/T和CYP2C9*3设计能够与野生型和突变型模板上游或下游互补的寡基核苷酸引物，以及分别与VKORCl和CYP2C9突变位点VKORCl 1173G/T、VKORCl 1639C/T和CYP2C9*3突变位点结合的寡基核苷酸探针。2，配制适宜于PCR和LDR的反应体系。PCR反应体系包括Taq酶，UNG酶和dNTP，PCR缓冲液，引物等；LDR反应体系包括连接酶，UNG酶，dNTP，探针和缓冲溶液等。
3，从待测样本中提取DNA，加到PCR反应体系中，进行多重PCR反应。4，从上述PCR产物中加一定量到LDR反应体系中，进行多重LDR反应。5，将得到的LDR产物进行测序检测，根据测序图谱判断样本是否存在突变，以及是哪种突变。本发明提供的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变检测试剂盒包括以下组分:PCR缓冲液，酶1，酶2，LDR反应液，阴性质控品，野生型质控品，VKORCl 1173G/T阳性对照，VKORCl 1639C/T阳性对照，CYP2C9*3阳性对照。其中酶I包括Taq酶,UNG酶和dNTP ;酶2包括连接酶，UNG酶，dNTP等。本发明华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变检测试剂盒，其特征在于VKORCl基因和CYP2C9基因检测位点的引物序列分别是:VKORCl 1173G/T 上游引物:CCGAGAAAGGTGATTTCCAAVKORCl 1173G/T 下游引物:AGGGGAGGATAGGGTCAGTGVKORCl 1639C/T 上游引物:CCTGACACCTAGTGGCTGGTVKORCl 1639C/T 下游引物:CCTCTGGGAAGTCAAGCAAGCYP2C9*3 上游引物:GGAAGAGAITGAACGTGTGACYP2C9*3 下游引物:CTATGAATTTGGGGACTTCG。本发明华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含VKORCl 1173G/T的探针序列为:1173_modifyP-CTTGGACTAGGATGGGAGGTCGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1173_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT1173_GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC本发明华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含VKORCl 1639C/T的探针序列为:1639_modifyP-GGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1639_CTTTTTTTTTTTTTTTTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCG1639_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCA。本发明华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含CYP2C9*3的探针序列为:CYP2C9*3_modifyP*GTATCTCTGGACCTCGTGCACCACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT*FAMCYP2C9*3_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAATCYP2C9*3_CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG 根据本发明的实施方案，阴性质控品是生理盐水；野生型质控品，VKORCl 1173G/T阳性对照，VKORCl 1639C/T阳性对照，CYP2C9*3阳性对照分别为测序结果检测分别为野生和突变的质粒D N A。根据本发明的实施方案,其中试剂盒的待检样品为多种途径获取的带有相关肿瘤DNA的临床样品，包括手术切除组织，石蜡包埋组织切片，穿刺组织，胸水，全血、血浆和血清坐寸O根据本发明的实施方案，试剂盒用于判定检测有效性的标准是:每次都检测阴性质控品，野生型质控品和突变型质控品，检测结果阴性质控品和野生型质控品均为阴性且突变型质控品为阳性时，实验才有效。本发明所述的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，目前针对临床华法林药物基因VKORCl和CYP2C9突变检测方案主要有两种=Taqman探针法和Sanger测序法。Taqman探针法操作简单快速,实验灵敏度高,但无法同时检测多个突变位点。Sanger测序法操作繁琐，检测需10小时以上，检测灵敏度低，无法检测低滴度样本(突变比率小于15% )0基于PCR*LDR的VKORCl和CYP2C9突变位点检测方案能够突破传统核酸突变检测技术的局限:对多个突变位点进行检测；检测灵敏度达到1% ;操作方便，基本实现操作自动化，产品的检测时间缩短为5个小时左右。
具体实施方式
:实施例1I，华法林药物基因 VKORCl和CYP2C9检测试剂盒的组成:PCR缓冲液，酶1，酶2，LDR反应液，阴性质控品，野生型质控品，VKORCl 1173G/T阳性对照，VKORCl 1639C/T阳性对照，CYP2C9*3阳性对照和分隔并集中包装这些管的试剂盒子。2，核酸提取:取10到30毫克新鲜组织或200微升抗凝血，使用Qiagen或其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取样本DNA。3，配制适宜于PCR和LDR的反应体系。PCR反应体系包括Taq酶，UNG酶和dNTP，PCR缓冲液，引物等；LDR反应体系包括连接酶，UNG酶，dNTP，探针和缓冲溶液等。4，多重PCR扩增。扩增管中，加入18ul PCR缓冲液、Iul酶I和Iul样本DNA，扩增条件为:95°C 15min，35个循环包括94°C 30秒；56°C lmin30秒；72°C 30秒，最后72°C5min。5，多重LDR反应。反应管中，加入8ul LDR缓冲液、Iul酶2和Iul上述PCR产物，反应条件为:94°C 2min, 15个循环包括94°C 30秒；60°C 2min。6，测序仪结果检测，将得到的LDR产物进行测序检测，检测结果用GeneMapper4.0软件进行分析。7，根据本发明的实施方案，试剂盒用于判定检测有效性的标准是:每次都检测阴性质控品，野生型质控品和突变型质控品，检测结果阴性质控品和野生型质控品均为阴性且突变型质控品为阳性时，实验结果有效。4个位点为纯合子参见附
图1A，4个位点为杂合子参见附图1B。实施例2用上述方法对200例临床样本进行检测，其中VKORCl 1639C/T位点检出121例纯合子，79例杂合子；VK0RC1 1173G/T位点检测出115例纯合子，85例杂合子；CYP2C9*3基因检出纯合子155例，杂合子45例。根据上述检测结果指导临床华法林的剂量，患者不良反应大幅降低。通过LDR技术检测华法林用药相关的VKORCl基因和CYP2C9基因突变位点，可用于华法林药物剂量的预测和心血管患者临床个体化用药方案的指导，对临床用药指导有重要意义。
权利要求
1.一种采用特异性引物探针高温连接酶技术(LDR技术)的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，该试剂盒包括:PCR缓冲液，酶1，酶2，LDR反应液，阴性质控品，野生型质控品，VKORCl 1173G/T阳性对照，VKORCl 1639C/T阳性对照，CYP2C9-3阳性对照和分隔并集中包装这些管的试剂盒子。其中VKORCl基因和CYP2C9基因检测位点的引物序列分别是: VKORCl 1173G/T 上游引物:CCGAGAAAGGTGAITTCCAA VKORCl 1173G/T 下游引物:AGGGGAGGATAGGGTCAGTG VKORCl 1639C/T 上游引物:CCTGACACCTAGTGGCTGGT VKORCl 1639C/T 下游引物:CCTCTGGGAAGTCAAGCAAG CYP2C9-3 上游引物:GGAAGAGAITGAACGTGTGA CYP2C9-3 下游引物:CTATGAAITTGGGGACTTCG。
2.根据权利要求1的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含VKORCl 1173G/T的探针序列为:1173_modifyP-CTTGGACTAGGATGGGAGGTCGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1173_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT1173_GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC。
3.根据权利要求1的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含VKORCl 1639C/T的探针序列为:1639_modifyP-GGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1639_CTTTTTTTTTTTTTT`TTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCG1639_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCA。
4.根据权利要求1的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于LDR反应液中包含CYP2C9-3的探针序列为:CYP2C9-3_modifyP-GTATCTCTGGACCTCGTGCACCACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMCYP2C9-3_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAATCYP2C9-3_CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG。
5.根据权利要求1的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于酶I中还包括Taq酶，UNG酶和dNTP。
6.根据权利要求1的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于酶2中还包括连接酶，UNG酶和dNTP。
7.根据权利要求1的华法林药物基因VKORCl和CYP2C9检测试剂盒，其特征在于阴性质控品是生理盐水；野生型质控品，VKORCl 1173G/T阳性对照，VKORCl 1639C/T阳性对照，CYP2C9-3阳性对照分别为测序结果检测为突变的质粒D N A。
全文摘要
本发明提供一种特异性多重PCR技术和多重LDR技术检测华法林两种药物基因VKORC1和CYP2C9检测突变的试剂盒，特别涉及心血管患者组织以及患者血液中VKORC1和CYP2C9基因突变的诊断。本试剂盒针对分子靶向药物疗效相关的特定突变位点，设计特定的引物序列和探针序列，在进行多重PCR后，通过野生型探针和突变型探针与目的片段连接后在测序仪上进行片段分析，根据结果的峰图判读结果。本发明可对VKORC1和CYP2C9基因3个特定突变位点进行检测，可以用于华法林药物剂量的预测和心血管患者临床个体化用药方案的指导。
文档编号C12Q1/68GK103184271SQ201110448310
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者江培学, 杨志军, 陈伟华, 范雯琦, 吴大治, 夏懿 申请人:上海复星医学科技发展有限公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司