一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白e的方法及其应用的制作方法

专利名称：一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白e的方法及其应用的制作方法
一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用技术领域
本发明属于蛋白的重组表达方法及其应用，特别是涉及一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其在抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的ELISA 检测中的应用。
背景技术：
水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)属于疱疹病毒科，α病毒属，人是其唯一宿主，因此又称人疱疹病毒3型，感染后可引起两种不同的临床病理症状。 VZV初次感染多发于青少年时期，表现为全身性的水疱疮(水痘)，此后，病毒潜伏在感觉神经节，当携带者由于免疫力低下等原因，病毒可再次激活而引发带状疱疹(病毒通过神经传播，到达表皮细胞，沿肋间神经区域形成水疱疹症状)。VZV的初次和再次感染均会引起中枢神经系统的病理症状，多表现为脑膜炎、脑炎、面瘫等，但往往不伴随疱疹体征，因而不利于该病毒感染的临床诊断和早期抗病毒治疗。
目前，临床多采用提取病人脑脊髓液中的核酸，进行探针法定量PCR确定患者是否为 VZV 感染。但 Steiner 等(Steiner I, Budka H, Chaudhuri A, et al. Viral meningoencephalitis -.a review of diagnostic methods and guidelines for management. Eur J Neurol. 2010，17 :e957_e999.)证明 PCR 鉴定受限于采样的窗口期，因此，虽然该方法具有很好的灵敏性，但易造成假阴性，并且VZV基因组与其它人α -疱疹病毒基因组，特别是单纯疱疹病毒，具有很高的同源性，因而不排除有假阳性的检测结果。 基于上述原因，研究者将VZV感染的诊断转向血清学的检测方法，Breuer等(Breuer J， Schmid DS, Gershon AA. Use and limitations of varicella-zoster virus-specific serological testing to evaluate breakthrough disease in vaccines and to screen for susceptibility to varicella. J Infect Dis. 2008，197 (S2) :S147_S151.)使用 VZV 感染的细胞膜蛋白裂解物作为捕获抗原，建立间接ELISA方法检测血浆中VZV特异性免疫球蛋白的含量，虽然与金标准膜抗原免疫荧光法(fluorescent antibody to membrane antigen, FAMA)相比具有很好的一致性，但仍存在与其它人疱疹病毒特免交叉反应的可能性。因此，建立可靠的血清学检测方法，提高检测体系的特异性，避免交叉反应，对于临床 VZV感染的诊断及高通量抗VZV特异性免疫球蛋白的筛选具有重要意义。
由于间接ELISA反应体系的灵敏性与捕获蛋白的包被浓度有关，而特异性与包被蛋白的抗原决定簇有关，因此，选择病毒特异性的抗原决定簇是提高抗VZV特异性免疫球蛋白检测特异性的关键。
已知VZV为双链DNA病毒，包括125000个碱基对，全部碱基序列已由Davison 等人确定，并公开发表(Davison AJ, Scott JE. The complete DNA sequence of Varicella-Zoster Virus. J gen Virol. 1986，67 :1759-1816.)。该基因组中至少存在着 72个0RF，编码33种VZV特有蛋白和13种糖蛋白，其中已发现gE (gp I )、gB(gpII)、gH(gp III)、gl (gp IV )、gC(gp V )和gL(gp VI)等6种糖蛋白共同存在于病毒囊膜表面和感染细胞的膜表面。
糖蛋白E对于病毒复制是必不可少的，同时也是感染细胞膜表面以及成熟病毒囊膜表面存在的最丰富的糖蛋白，高度保守，其作为候选亚单位疫苗的研究表现出良好的抗原特异性和抗体结合性。由于野生型VZV gpE的蛋白分子包括有四个区域，即信号肽(aal-24)、胞外区(aa25_539)、跨膜区和胞内区(aaM0_624)，而E蛋白的3个抗原决定族均分布在胞夕卜区(Grose C. Glycoproteins encoded by varicella-zoster virus :biosynthesis, phosphorylation, and intracellular trafficking. Annu Rev Microbil. 1990,44 :59-80.)。
由于采用单抗亲和层析法，从VZV感染细胞的裂解物中提取足量的gpE需要大量的人力、物力资源并且代价较为昂贵，如果能利用基因重组技术对相应的抗原进行重组表达则可避免上述方法的缺点。发明内容
本发明的目的是提供一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法。
本发明所提供的重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法，是将去除跨膜区(疏水区)和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白EfelycoproteinE，gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。
所述His标签位于水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的羧基(C)端。
所述添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因可通过位点特异性整合系统Flp/FRT导入宿主细胞，具体方法可为将添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因插入载体pcDNA5/FRT/TO的多克隆位点中，再将该携带添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的中间载体与携带FLP酶基因的pOG44质粒共转染宿主细胞FLP-In-CHO，经筛选得到整合有添加His标签的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的宿主细胞。
在上述通过位点特异性整合系统Flp/FRT导入宿主细胞的中间载体中，所述添加 His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的上游为Pa 启动子，下游为FRT位点和筛选标记，所述筛选标记可为潮霉素B抗性基因、新霉素抗性基因或杀稻瘟素抗性基因等任一可用的筛选标记基因。其中，以pcDNA5/FRT/TO为出发载体构建的携带添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的重组载体为pcDNA5/FRT/T0-gpE-His。
所述筛选条件可为用浓度为200-400 μ g/mL(优选为300 μ g/mL)的潮霉素筛选 1-3周(优选为2周)。
用上述重组表达方法得到的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种抗水痘-带状疱疹病毒免疫球蛋白的ELISA检测试剂盒，其中包括了上述重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。具体还可包括包被缓冲液，使蛋白浓度 1 μ g/mL ；50 X 漂洗缓冲液 20ml ；anti-VZV IgG 国际标准品 NIBSC (50IU/ml) 200 μ 1 ； HRP标记羊抗人IgG (H+L)抗体20 μ 1 ；可溶性TMB显色底物20ml ；反应终止液20ml。
本发明提供了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法。该方法是将去除跨膜区和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白EfelycoproteinE，gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。该表达方法在保留水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)蛋白分子的抗原决定簇的同时去除其跨膜区(疏水区)和胞内区，且在重组蛋白的C末端引入His标签，该方法既有助于提高目的蛋白的表达量，又简化了下游的纯化工作，可较容易地实现水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的规模化生产，且批间质量稳定。可以本发明的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E作为捕获抗原，建立水痘-带状疱疹病毒的间接ELISA检测方法，用于血浆样本中抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的检测，因此，本发明对于提高临床诊断VZV感染的准确性，以及其它需要VZV特异性免疫球蛋白进行高通量检测的领域中具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为野生型全长VZV gE和本发明重组截短型VZV gE的分子模式图
图2为PCR扩增的截短型VZV gpE基因的1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果
图3为重组表达载体pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的BamH I和EcoR V双酶切鉴定结果
图4为重组表达载体pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的PCR鉴定结果
图5为重组表达载体pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的结构示意图
图 6 为转染后 0、5、10、15 天的转染 pcDNA5/FRT/T0-gpE-His 的 FLPHn-CHO 细胞和未经转染处理的FLP-In-CHO阴性对照细胞(作为筛选终止对照细胞)的LEICADMI 3000B 显微镜观察结果(10X40)
图7A为用抗His标签抗体进行的重组截短型VZV gpE的flfestern Blot鉴定结果
图7B为用抗VZV gpE多抗进行的重组截短型VZV gpE的^festern Blot鉴定结果
图8为纯化重组截短型VZV gpE的AKTA explore 100谱图
图9为经纯化的重组截短型VZV gpE的10% SDS-PAGE检测结果
图10为经纯化的重组截短型VZV gpE抗原性的flfestern Blot检测结果
图11为用本发明重组截短型VZV gpE蛋白进行水痘-带状疱疹病毒的ELISA检测的标准曲线具体实施方式
本发明是利用基因重组技术对相应的抗原进行重组表达而得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。该方法将截短的gpE基因导入到哺乳动物细胞基因组中进行表达，再通过纯化方法获得成分较为单一的rgpE。
已知成熟gpE蛋白分子的N端和C端磷酸化修饰和糖基化修饰占蛋白总重的 25%，因此选用能够对重组蛋白进行较完整的磷酸化和糖基化修饰，是保证重组蛋白具有与天然蛋白相一致的抗原性的关键。
哺乳动物细胞中，能够对外源蛋白进行较为完整的糖基化修饰的工程细胞主要包括CHO、HEK293和BHK，这些细胞表达的重组蛋白与天然蛋白相比具有十分接近的构象，而 CHO细胞又最为常用，已成功表达出多种重组人药用蛋白，且这些蛋白的生理功能均依赖蛋白分子的糖基化修饰。
基因工程常采用通过随机整合的方式将外源携带有目的基因的载体导入宿主细胞的基因组中，而在哺乳动物细胞表达系统中，基因组存在大约15000个以上的整合位点， 其中位于转录活性区的仅15个左右，这就造成利用随机整合的方法进行外源基因的整合时，实现转录活性区的整合机率仅有千分之一，目的蛋白的表达差异量可达95%以上。因此，用此类方法进行高表达细胞株的筛选时，需耗费大量的人力、物力和时间。
位点特异性整合表达技术可以快速而准确地将外源目的基因整合到细胞基因组的转录活性区，从而快速获得表达量较高的细胞株，而且基因拷贝数确定、无差异，外源基因在各细胞克隆之间的表达水平十分接近(Cone RD, Mulligan RC. High-efficiency gene transfer into mammalian cells !generation of helper-free recombinant retrovirus with broad mammalian host range. Proc Natl Acad Sci. 1984, USA 81: 6349-6535)。Flp/FRT的表达系统即是其中之一，其基本原理是在工程细胞基因组的转录活性区引入Flp重组酶特异识别位点FRT序列，当用同样具有FRT序列的表达载体进行转染时，在Flp的介导下可将外源基因定点整合在细胞基因组中的转录活性区(Broach JR, Guarascion VR, Jayaram Μ. Recombination within the yeast plasmid 2micro circle is site-specific. Cell. 1982,29 :227-234.)。Flp-In-CHO 细胞即是在转录活性区具有整合位点FRT的细胞系之一。
基于以上研究和分析，本发明提出了重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白 E的技术方案，并以下述实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E (gpE)的重组表达
本发明水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)(简称截短型VZV-gpE) 的重组表达方法，包括以下步骤
一、截短型VZV gpE基因的获得
(1)扩增VZV gpE基因的引物设计和合成
图1示出野生型全长VZV gpE和本发明重组截短型VZV gpE的分子模式图，与野生型全长VZV gpE相比，本发明重组截短型VZV gpE去除了跨膜区和胞内区，并在C端添加 7 His标签。依据NCBI公布的VZV基因组gpE序列(登录号=GenBank AY253715. 1)，本发明设计并合成两条引物，并在下游引物(gpE/R)中引入编码His标签的DNA序列，引物序列为
gpE/F 5' -CGC AGG ACA GTT AAT AAA CCT GTG-3‘禾口
gpE/R 5' -CGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGC MG CCC TCC GGT CCA-3'。
(2) VZV基因组DNA的获取
人胚肺二倍体细胞MRC 5 (第19代，购自ATCC)，使用DMEM(高糖，购自Hyclone) 培养基，10%胎牛血清(购自GIBC0)培养条件，于37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养， 1 2传代4 后，即细胞80%布满单层，按照0. 01M0I接种密度接种VZV Oka疫苗，同时设立空白对照，将血清降至培养约4-5d，75%细胞以上发生病变时收毒，病毒培养物反复冻融3次后，取200 μ 1上清液提取基因组DNA (High Pure Viral Nucleic Acid Kit，购自 Roche)0
(3)截短型VZV gpE DNA片段的扩增
以VZV基因组DNA为模板，使用上述引物gpE/F和gpE/R进行PCR扩增，PCR扩增体系为(总体积 50 μ 1)基因组模板 1 μ 1，KOD Plus(购自 Τ0Υ0Β0)1μ l，10XBuffer5y 1， 25mM MgSO4 2μ l,2mM dNTPs 5 μ 1，gpE/R 各 1μ l(20pmols), ddH20 34 μ 1 ；PCR 扩增条件为95°C 预变性 5min，95°C 30s ^ 58°C 30s ^ 72°C 2min (30 个循环)，72°C 5min。PCR 反应结束后，对PCR扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(M :DL2000 DNA Marker ；a 以VZV基因组DNA为模板，使用引物gpE/F和gpE/R扩增出的截短型VZV gpE基因；b =MRC 5细胞基因组作为模板的阴性对照)，显示获得了长度约1620bp的DNA片段，与预期片段大小相符，使用DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段。
(4)截短型VZV gpE克隆载体的构建
将回收并纯化的VZV gpE DNA片段使用普通Taq酶在3，末端引入dATP，将其连接至克隆载体PMD-18T(购自TaKaRa)的多克隆位点中，并转化大肠杆菌感受态TOP 10，将 BamH I/EcoR V双酶切鉴定正确的质粒进行测序分析，选取序列正确且BamH I位点在目的片段上游的阳性克隆，命名为pMD-18T-gpE-His，用于构建重组表达载体。
二、重组表达载体 pcDNA5/FRT/T0-gpE-His 的构建
将质粒pMD-18T-gpE-His 和载体 pcDNA5/FRT/T0 (购自 invitrogen)分别用BamHI/EcoR V双酶切，对酶切产物进行1 %琼脂糖电泳分离后，回收质粒 pMD-18T-gpE-Hisl620bp (目的基因-截短型 VZV gpE 基因)和载体 pcDNA5/FRT/T0 5100bp 的DNA片段，再将回收的目的基因与载体pcDNA5/FRT/TO的大片段用T4DNA连接酶(购自 NEB)进行连接，并转化大肠杆菌感受态TOP 10，扩大培养单个菌落后提取质粒，用BamH I 和EcoR V进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示(M:DL5000DNA Marker ；质粒为使用限制性内切酶BamH I和EcoR V消化后获得的DNA片段，泳道a_l与预期一致，其中2700bp为载体pMD-18T片段，1600bp为截短型VZV gpE基因片段)，结果经双酶切获得了 2700bp的载体PMD-18T片段和1600bp的截短型VZV gpE基因片段，与预期结果相符，再对质粒用引物gpE/F和gpE/R进行PCR鉴定，PCR鉴定结果如图4所示(M :DL2000 DNA Marker ；质粒使用引物gpE/F和gpE/R进行PCR扩增，泳道a_l均出现与预期大小1600bp —致的DNA片段(其中b、k为阴性克隆而未扩增出该目的片段)，最后对该质粒进行测序，测序结果表明获得了插入序列及位置均正确的携带有截短型VZV gpE基因的重组表达载体及其菌株，将该重组表达载体命名为pCDNA5/FRT/T0-gpE-His (其物理图谱如图5所示)。
三、FLP-In-CHO细胞的转染、筛选及克隆化
(I)FLP-In-CHO 细胞的转染
用脂质体转染试剂盒(购自Invitrogen)将步骤二构建的重组表达载体pcDNA5/ FRT/T0-gpE-His 转染 FLP-In-CHO 细胞(购自 hvitrogen)，同时设立 pcDNA5/FRT/T0 转染细胞作为空白对照，未转染任一质粒的细胞作为筛选的阴性对照。具体方法包括以下步骤
①细胞的准备=FLP-In-CHO细胞传入6孔板，使用D/F12培养液(购自HyClone)、5%新生牛血清(购自GIBC0)、37°C、5% CO2、饱和湿度中培养Mh，待细胞长成70%单层时倾去细胞培养液，用无血清D/F12培养基洗涤细胞两次，每孔加入无血清培养基2mL，即为备用细胞。
②脂质体/DNA的准备将20 μ 1脂质体Lipofectine溶入200 μ 1无血清培养基中，轻轻混勻，室温放置40min，取2 μ g经除菌的重组质粒DNA pcDNA5/FRT/T0-gpE-His和 1 μ g pOG44质粒(购自！Iomega)溶入200 μ 1无血清培养基中，混勻后，置于室温备用，将制备好的DNA与脂质体轻轻混合均勻，室温放置10-15min，即得到包裹好的脂质体/DNA。空白载体对照采用同样的方法。
③细胞转染将制备好的脂质体-DNA混合物小心滴加至备用细胞培养基表面，于 37°C,5% CO2饱和湿度中孵育6h，弃去混合液，加入含10%小牛血清的D/F12培养基继续培养48-7池，视细胞生长情况进行传代。
(2)抗性细胞的筛选及克隆化
将步骤(1)获得的转染细胞进行传代，生长24h后，更换为选择性培养基(含5% 新生牛血清和300 μ g/mL的潮霉素B)D/F12培养基继续培养，间隔2d换液一次，待阴性对照细胞全部死亡时，得到具有潮霉素B抗性的CHO细胞(转染表达载体中携带抗性基因，转染成功的细胞可在选择培养基中生长)。
利用有限稀释法对获得的潮霉素B抗性的CHO细胞进行克隆化培养，具体方法如下
①待抗性细胞处于对数生长期时，用适量的0.25%胰酶消化细胞，待细胞收缩变圆，用吸管充分吹打细胞，将细胞分散为单个细胞悬液；
②取少量细胞悬液，用台盼蓝染色并计数活细胞；
③细胞悬液进行连续倍数稀释后，将制备好的细胞悬液接种于96孔培养板，使细胞浓度在每孔有1-2个细胞的水平，每孔加入0. ImL含10%新生牛血清的D/F12培养基，于 37°C>5% CO2饱和湿度培养；
⑤每日观察培养板各孔细胞情况，孵育4-5d，挑选含单个细胞的孔；
⑥待克隆长至孔底面积的约2/3时，用适量的0. 25%胰蛋白酶消化，转种至M孔培养板扩大培养；
⑦按照同样的方法，待细胞长满孔底面积的约2/3时，将细胞转种至6孔板，继而扩大培养直至转入25cm2细胞培养瓶，即可按常规方法培养、传代及冻存细胞。
使用LEICA DMI 3000B 显微镜观察 pcDNA5/FRT/T0-gpE_His 转染的 FLP-In-CHO 细胞和FLP-In-CHO阴性对照细胞，第0、5、10、15天筛选结果如图6所示，筛选的初始和筛选后第5天两孔细胞密度较一致，在筛选的第10天对照细胞较转染pcDNA5/FRT/T0-gpE-Hi 的CHO细胞死亡较多，而在筛选第15天(筛选结束)时，转染pCDNA5/FRT/T0-gpE-His的细胞已有明显的细胞簇生长，而阴性对照细胞几乎全部死亡。
四、重组截短型VZV gpE的鉴定
将步骤三中获得具有抗性的细胞克隆在M孔板中长至约80%时，收集上清，采用 EPS 601(购自GE Healthcare)60V-120V电泳系统、5% -10%聚丙烯酰胺凝胶进行分离，待蛋白分子量最小的条带移动至胶的底层时，结束电泳，使用考马斯亮蓝进行染色。
上述SDS-PAGE电泳结束以后，使用EPS 6020mA稳定电流，将凝胶上的蛋白分子转移至硝酸纤维素膜上(0.45 μ m，购自BioRad)，转膜后用含2% BSA、0. 5% Tween 80的 PBS缓冲液封闭池，重组糖蛋白E分别使用羊抗VZV gpE多抗(购自SANTA CRUZ)、小鼠抗 His标签单抗(购自TIANGEN)作为一抗，HRP标记兔抗羊IgG(H+L)抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(均购自中衫金桥公司)作为二抗进行抗原抗体结合反应，反应结束后， 以Super ECL Plus显色系统(购自普力莱公司)显色并使用IQuant Capture 350成像仪 (购自GE Healthcare)拍照观察。
结果如图7A和图7B所示(泳道a-d 转染pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的不同细胞克隆表达上清；泳道e 转染pcDNA5/FRT/T0载体的FLP-In-CHO阴性对照细胞表达上清)， 可以看出，转染pcDNA5/FRT/T0-gpE-His的不同细胞克隆在70kDa处均有蛋白印记，与预期蛋白分子量相一致，表明经重组表达获得了目的蛋白。
五、重组截短型VZV gpE蛋白的纯化和鉴定
收集步骤三中扩大培养的克隆化CHO细胞(pcDNA5/FRT/T0-gpE-Hi s转染的 FLP-In-CHO细胞)表达上清，采用Ni-NTA亲和层析树脂(购自Qiagen公司)进行纯化，具体步骤如下
(1)纯化所需缓冲液
①柱平衡液(CB):20mM Na2HPO4,0. 5M NaCl, pH 7. 4。
②洗脱缓冲液(EB):20mM Na2HPO4,0. 5M NaCl,200mM 咪唑，pH 7. 4。
以上缓冲液均使用0. 22 μ m滤膜除菌过滤，备用。
(2)细胞上清的预处理
细胞表达上清4000g离心30min后取上清，使用0. 22 μ m滤膜除菌过滤后，5倍体积CB置于4°C透析Mh，期间更换透析液2-3次。
(3)介质准备
20mL Ni-NTA介质装入XK1520层析柱(购自GE Healthcare)，过夜至完全沉降， 排除气泡，连入AKTA explore 100层析仪(购自GE Healthcare)，使用5倍柱床体积CB对介质进行洗涤和平衡，流速为2mL/min。
(4)目的蛋白的纯化
将O)中处理的CHO细胞表达上清连接至层析柱的进样口，设定上样流速为2mL/ min ；使用CB平衡5倍柱床体积，至基线接近AU28tlnm零值；再以2_5个柱床体积的EB洗脱结合在配基上的目的蛋白，并根据洗脱峰收集洗脱样本。AKTA explorelOO谱图如图8所示， 表明经纯化获得了纯度较高的重组截短型VZV gpE蛋白。
(5)重组截短型VZV gpE蛋白纯化后的纯度和抗原性鉴定
使用步骤四的方法对上述(4)纯化后蛋白的纯度和抗原性进行鉴定，经纯化的重组截短型VZV gpE的10% SDS-PAGE检测结果如图9所示(M 蛋白分子量Marker ；泳道a_c 不同AU28tlnm吸光值的洗脱峰样品；泳道d 纯化前表达上清)，经过亲和层析纯化后，去除了 CHO细胞表达上清中的大部分杂质蛋白，获得了较单一的条带；纯化前后重组截短型VZV gpE抗原性的Wfestern Blot检测结果如图10所示(泳道a_c 不同AU28tlnm吸光值的洗脱峰样品；泳道d 纯化前表达上清)，结果显示，纯化后的重组蛋白(泳道a c)可被VZV-gpE 抗体识别，说明保留了目的蛋白抗原决定簇的活性。
实施例2、重组截短型VZV gpE蛋白在水痘-带状疱疹病毒的ELISA检测中的应用
用本发明重组截短型VZV gpE蛋白进行水痘-带状疱疹病毒的ELISA检测，具体方法包括以下步骤
一、rgpE间接ELISA方法的建立
(I)ELISA检测体系的缓冲液及试剂
①包被缓冲液50mM碳酸盐缓冲液，取1. 76g Na2CO3, 2. 86g NaHCO3加入到900mL 去离子水中，调至pH 9. 6，用IL容量瓶定容。0. 22 μ m滤膜过滤保存。
②漂洗缓冲液=NaCl8. 76g,Tris 碱 2. 42g，0. 05% Tween (V/V)，加入到 800mL 去离子水中，用HCl调pH 7. 4，用IL容量瓶定容。0. 22 μ m滤膜过滤保存。
③样品稀释液②中漂洗缓冲液加入BSA(w/v)即可。
④标准品anti_VZV IgG国际标准品，50IU/mL，购于英国NIBSC。
⑤酶标抗体HRP标记羊抗人IgG (H+L)抗体，购自中衫金桥公司。
⑥TMB显色底物可溶性TMB显色底物，购自TIANGEN。
⑦终止液2MH2SO4。
(2)抗原包被
使用BCA法对纯化后的蛋白(本发明重组截短型VZV gpE蛋白)进行浓度测定， 为612yg/mL，使用包被缓冲液按照1 600倍稀释包被聚丙烯微量滴定板，即包被蛋白浓度为lyg/mL，每孔150μ 1，置于4°C 24h，再以含有2% BSA的漂洗缓冲液(每孔200 μ 1) 于4°C封闭Mh。封闭结束后，弃去封闭液，拍干孔中残留的液体，置于4°C密封待用。
(3)标准曲线的绘制及血浆样本中抗VZV-gpE抗体的测定方法
①标准品稀释至10IU/mL、5IU/mL、2IU/mL、lIU/mL、0. 5IU/mL，待测血浆样品以稀释液按照1 100倍进行稀释，依次加入( 中包被好的微量滴定板中，置于37°C湿盒中作用Ih后，弃去各孔中的标准品/血浆样品，于吸水纸上拍干。
②每孔加入300 μ 1漂洗液，于振荡器作用^lin，弃去漂洗液，拍干；重复3次。
③每孔加入1 5000倍稀释的HRP标记的羊抗人IgG (H+L)抗体，置于37°C湿盒中作用Ih后，弃去2抗。
④重复②的操作。
⑤每孔加入TMB显色底物液100 μ 1，避光作用30min，使用2M H2SO4终止。
⑥紫外分光光度计450nm光波处读取吸光值。
⑦以标准品的浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，得到相应的一元二次方程。
标准曲线如图11所示，标准曲线方程为y = 0. 68+0. 32x-0. 02x2。
⑧将测得的血浆样品OD值代入⑦中得到的标准曲线或方程中，计算抗VZV gpEIgG的浓度。
二、rgpE间接ELISA法特异性和灵敏度的分析
(1)血浆样本
①VZV IgG (FAMA法测定)阴性且HSV IgG阴性(IFAT法测定)血浆样本30份。
②VZV IgG (FAMA法测定)阴性且HSV IgG阳性(IFAT法测定)血浆样本22份。
③VZV IgG(FAMA法测定)弱阳性(1 2 1 16，来自接种疫苗4周人群的血浆样本)且HSV IgG阴性(IFAT法测定)血浆样本47份。
④VZV IgG(FAMA法测定)强阳性(彡1 32)，多为带状疱疹恢复期患者血浆样本)且HSV IgG阴性(IFAT法测定)血浆样本83份。
以上样本用于验证本水痘-带状疱疹病毒间接ELISA法的特异性。
(2)参考商品anti-VZV IgG间接ELISA试剂盒
以使用纯化VZV糖蛋白(VZV whole-gp)包被的Virion(ELISA Classic VZV IgG, 购自德国 Serion 公司)和 VaccZyme (anti-VZV glycoprotein IgG，购自英国的 Binding Site公司)作为对照，验证本发明水痘-带状疱疹病毒的间接ELISA法的灵敏度。
(3)测定及结果
同一份血浆样品分别使用三种检测体系(Virion、VaccZyme和本发明重组截短型 VZV gpE)进行测定，结果如表1所示，用本发明重组截短型VZV gpE蛋白进行水痘-带状疱疫病毒的间接ELISA法(参见步骤一的操作)的特异性为100%，灵敏度与Virion的相关性为88%，与VaccZyme的相关性为81 %，说明其作为血浆中VZV特异性免疫球蛋白的检测方法具有可行性，并且使用工程细胞株表达的抗原稳定性好，易于批量生产，适用于高通量的样本检测。
表1 VZV gpE间接ELISA法的的特异性和灵敏度
权利要求
1.一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法，是将去除跨膜区(疏水区)和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)截短型糖蛋白E (glycoproteinE, gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述His标签位于水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的羧基(C)端。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因可通过位点特异性整合系统Flp/FRT导入宿主细胞，具体方法为 将添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因插入载体pcDNA5/FRT/T0的多克隆位点中，再将该携带添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的中间载体与携带FLP酶基因的pOG44质粒共转染宿主细胞FLP-In-CHO，经筛选得到整合有添加His标签的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在所述通过位点特异性整合系统Flp/FRT 导入宿主细胞的中间载体中，所述添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的上游为Paw启动子，下游为FRT位点和筛选标记，所述筛选标记可为潮霉素B抗性基因、新霉素抗性基因或杀稻瘟素抗性基因等任一可用的筛选标记基因；以pcDNA5/FRT/T0 为出发载体构建的携带添加His标签的水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的基因的重组载体为 pcDNA5/FRT/T0-gpE-His。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述筛选条件为用浓度为 200-400 μ g/mL的潮霉素筛选1_3周。
6.用权利要求1-5任一项所述重组表达方法得到的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。
7.权利要求6所述的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E在抗水痘-带状疱疹病毒免疫球蛋白的ELISA检测方法中的应用。
8.一种抗水痘-带状疱疹病毒免疫球蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。
9.根据权利要求8所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括包被缓冲液，包被蛋白浓度1 μ g/mL ；50 X漂洗缓冲液20ml ；anti-VZV IgG国际标准品NIBSC (50IU/ ml) 200 μ 1 ；HRP标记羊抗人IgG (H+L)抗体20 μ 1 ；可溶性TMB显色底物20ml ；反应终止液 20ml。
全文摘要
本发明公开了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用。该方法是将去除跨膜区和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。该表达方法有助于提高目的蛋白的表达量，简化了下游的纯化工作，可较容易地实现蛋白的规模化生产，且批间质量稳定。以本发明重组蛋白作为捕获抗原可用于血浆样本中抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的间接ELISA检测，可提高临床诊断VZV感染的准确性，并用于其它需要VZV特异性免疫球蛋白进行高通量检测的领域。
文档编号C12N15/38GK102517302SQ20111044806
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者冯晶晶, 吕茂民, 唐倩, 王卓, 王建国, 章金刚, 马玉媛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所