专利名称：人胚皮层神经干细胞的分离培养方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人胚皮层神经干细胞的分离培养方法。
技术背景
神经干细胞的发现是神经科学领域的重大突破，为神经发育和神经组织移植等研究领域开辟了广阔前景。神经干细胞是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。一般认为神经干细胞主要存在于哺乳动物胎脑的纹状体、小脑半球、脑室区等，成年哺乳动物脑的侧脑室壁和海马等区。有关哺乳动物胚胎阶段和成年动物在特定脑区存在神经干细胞已不断得到证实，但对人类神经干细胞的研究尚少。发明内容
从人胚皮层中分离培养并鉴定神经干细胞利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚皮层中分离具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代，贴壁分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。
具体的，为实现本发明的目的，所述的人胚皮层神经干细胞的分离培养方法包括以下步骤
Sl 原代细胞的分离和培养取胚龄12周水囊引产的新鲜人胚胎，在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的细胞培养液中漂洗三次，用细吸管反复吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液，经100目不锈钢网过滤， 制成单细胞悬液，经分胎蓝染色计数活细胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12无血清培养基， 调整细胞含量为1 X IO51Iir1，将细胞悬液分装于25ml细胞培养瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2条件下静置培养7天。
S2 传代培养及单细胞克隆、传代将原代培养7天后的细胞克隆悬液用吸管轻柔吹打进行机械分离，制成单细胞悬液，用含化7和bFGF的无血清培养液将细胞悬液按 IXIOW浓度传代接种于培养瓶，在37°C，5% CO2条件下静置培养7天，同时进行克隆形成实验，计数每代的克隆形成率，每7-9天机械分离传代，方法同前。采用有限稀释法，将原代克隆细胞制成的单细胞悬液，稀释到40Π1Γ1，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，选取仅有一个细胞的培养孔作记号，并动态观察。待长成单细胞克隆球后机械分离成单细胞悬液，再将一个克隆的所有细胞种至培养瓶中，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自某单个细胞的亚克隆。
S3 克隆诱导分化分别选取部分传代及单细胞克隆的细胞种植于多个多聚赖氨酸包被的玻片上，并加入含血清培养基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，观察其生长分化情况，分别于7天、14天行免疫荧光检测。
S4 间接免疫荧光检测将克隆细胞滴至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁12小时后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗体免疫荧光染色(抗Nestin IgG)。分别将传代及单细胞克隆的细胞种植于预置多聚赖氨酸包被玻片的含血清培养集中，于7天、14天时取出， 进行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗体的免疫荧光单标染色及NeuN和CNP抗体的免疫荧光双标染色。
本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从从胚龄12周的新鲜人胚皮层中成功建立一株人胚神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原。 分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中
图1所示为本发明的人胚皮层神经干细胞的分离培养方法的步骤流程图。
具体实施方式
如图1所示的本发明的人胚皮层神经干细胞的分离培养方法的步骤流程图，所述方法包括以下步骤
Sl 原代细胞的分离和培养取胚龄12周水囊引产的新鲜人胚胎，在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的细胞培养液中漂洗三次，用细吸管反复吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液，经100目不锈钢网过滤， 制成单细胞悬液，经分胎蓝染色计数活细胞加入含化7和bFGF的DMEM/F12无血清培养基， 调整细胞含量为1 X IO51Iir1，将细胞悬液分装于25ml细胞培养瓶，每瓶3ml，37°C，5 % CO2条件下静置培养7天。
S2 传代培养及单细胞克隆、传代将原代培养7天后的细胞克隆悬液用吸管轻柔吹打进行机械分离，制成单细胞悬液，用含B27和bFGF的无血清培养液将细胞悬液按 IXIOW浓度传代接种于培养瓶，在37°C，5% CO2条件下静置培养7天，同时进行克隆形成实验，计数每代的克隆形成率，每7-9天机械分离传代，方法同前。采用有限稀释法，将原代克隆细胞制成的单细胞悬液，稀释到40Π1Γ1，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，选取仅有一个细胞的培养孔作记号，并动态观察。待长成单细胞克隆球后机械分离成单细胞悬液，再将一个克隆的所有细胞种至培养瓶中，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自某单个细胞的亚克隆。
S3 克隆诱导分化分别选取部分传代及单细胞克隆的细胞种植于多个多聚赖氨酸包被的玻片上，并加入含血清培养基(DMEM/F12/B27/bFGF+5 %胎牛血清)，观察其生长分化情况，分别于7天、14天行免疫荧光检测。
S4 间接免疫荧光检测将克隆细胞滴至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁12小时后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗体免疫荧光染色(抗Nestin IgG)。分别将传代及单细胞克隆的细胞种植于预置多聚赖氨酸包被玻片的含血清培养集中，于7天、14天时取出， 进行Nestin、NeuN, GFAP, CNP抗体的免疫荧光单标染色及NeuN和CNP抗体的免疫荧光双标染色。
实验结果与分析
1.克隆细胞形态观察人胚皮层原代培养细胞成圆形球状，悬浮生长，经分胎蓝染色计数活细胞在80 %以上，培养7天时细胞数目明显增加，可见数十个至数万个细胞组成的细胞球，细胞形态规则，边界清楚，折光性强。有少数细胞贴壁生长，分化出有突起的神经原细胞，经传代克隆后仍未出现与原代培养相同的大量次代克隆。单细胞克隆显示单个细胞在培养3天时细胞克隆增大至数十个，此后随密度增加生长加快，经传代后仍成悬浮生长，细胞形态不变。
2.诱导分化结果将传代克隆及单细胞克隆后获得的克隆细胞经胎牛血清培养 12h后即见部分克隆细胞团向四周发出放射状细胞索，2天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，细胞索不断增粗和伸长，一周后大部分细胞已从其边缘向外迁移分化成大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞或神经原样细胞，突起互相交织成网状，2周后部分神经细胞开始衰退、死亡。
3.间接免疫荧光检测将原代、传代和单细胞克隆的细胞进行Nestin免疫荧光染色，结果显示大部分细胞呈Nestin抗原阳性，尤其是传代3次以上的克隆90%以上均呈阳性。NeuN免疫荧光染色呈阴性。经含血清培养7天、14天行NeuN、GFAP和CNP免疫荧光单标染色显示均有阳性表达细胞存在，NeuN、GFAP和CNP双标染色证实有神经元细胞和胶质细胞同时存在。Nestin免疫荧光染色在7天时尚可见部分阳性细胞，2周时几乎未找到 Nestin阳性细胞。
本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1. 一种人胚皮层神经干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤51原代细胞的分离和培养取胚龄12周水囊引产的新鲜人胚胎，在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 1)的细胞培养液中漂洗三次，用细吸管反复吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液，经100目不锈钢网过滤，制成单细胞悬液，经分胎蓝染色计数活细胞加入含B27和bFGF的DMEM/F12无血清培养基，调整细胞含量为1 X IO51Iir1，将细胞悬液分装于25ml细胞培养瓶，每瓶3ml,37°C,5% CO2条件下静置培养7天；52传代培养及单细胞克隆、传代将原代培养7天后的细胞克隆悬液用吸管轻柔吹打进行机械分离，制成单细胞悬液，用含化7和bFGF的无血清培养液将细胞悬液按1 X IO41Iir1 浓度传代接种于培养瓶，在37°C，5% CO2条件下静置培养7天，同时进行克隆形成实验，计数每代的克隆形成率，每7-9天机械分离传代，方法同前；采用有限稀释法，将原代克隆细胞制成的单细胞悬液，稀释到40Π1Γ1，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，选取仅有一个细胞的培养孔作记号，并动态观察；待长成单细胞克隆球后机械分离成单细胞悬液，再将一个克隆的所有细胞种至培养瓶中，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自某单个细胞的亚克隆；53克隆诱导分化分别选取部分传代及单细胞克隆的细胞种植于多个多聚赖氨酸包被的玻片上，并加入含血清培养基(DMEM/F12/B27/bFGF+5%胎牛血清)，观察其生长分化情况，分别于7天、14天行免疫荧光检测；54间接免疫荧光检测将克隆细胞滴至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁12小时后用 4%多聚甲醛固定，行Nestin抗体免疫荧光染色(抗Nestin IgG)；分别将传代及单细胞克隆的细胞种植于预置多聚赖氨酸包被玻片的含血清培养集中，于7天、14天时取出，进行 Nestin, NeuN, GFAP, CNP抗体的免疫荧光单标染色及NeuN和CNP抗体的免疫荧光双标染色。
全文摘要
本发明提出一种人胚皮层神经干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤原代细胞的分离和培养；传代培养及单细胞克隆、传代；克隆诱导分化；以及间接免疫荧光检测。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从从胚龄12周的新鲜人胚皮层中成功建立一株人胚神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。
文档编号C12N5/0735GK102533636SQ20111044787
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者陆华 申请人:陆华