专利名称：新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的分组纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种新生大鼠嗅球鞘细胞的分组纯化方法， 其应用于新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化过程。
背景技术：
近年来嗅鞘细胞(olfactory ensheat hing cells, OECs)已成为脊髓损伤 (spinal cord injury, SCI)修复理论及应用基础研究领域的热点,被认为是在组织细胞移植修复SCI研究中极具应用前景的移植材料。O ECs作为移植材料，其需求量大，纯度、活性要求高，因此必须通过体外培养、纯化获得。用于O ECs纯化细胞的方法较多，各有优缺点， 在OECs细胞移植修复SCI的研究中，究竟采取何种纯化方法目前尚无定论，同时关于纯化效率比较的研究文献不多。
发明内容
本发明探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的体外培养和纯化方法，以为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。所述的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法如下SI :0ECs的取材选用新生I 2d的SD大鼠12只，用75%的酒精搽洗口鼻，浸入 75%的酒精中2min以消毒皮肤，在超净台内显露两侧嗅球，并将之取下(尽量保持其完整性)，置于盛有PBS平衡盐溶液的4°C冰浴的培养皿中，在手术显微镜下用显微外科剪仔细去除嗅球表面的毛细血管和软脑膜。S2 =OECs的分离将位于嗅球最外层的嗅神经层的嗅小球层以及少量连接的嗅神经轻轻剥下，用PBS液冲洗2遍，剪碎组织块，用浓度为O. 125%的胰蛋白酶消化液在37°C 下消化15min，经胰酶消化的组织小块移入生长培养液(20%小牛血清的DM EM/F212)中， 静置lOmin，以中和胰酶作用。离心(800r/min，3min)去除上清液，吸取管底的组织小块，生长培养液清洗2次(动作要轻，尽量不使粘连的组织小块分开)。将组织小块移入2ml的生长培养液中，再用火焰抛光后的Pasteur移液管反复吹打组织块15 20次，使之形成细胞悬液。取一滴细胞悬液滴于细胞计数板计数，用生长培养液调整细胞浓度为5X 105/ml。S3 =OECs分组纯化12只大鼠取材后均分为正常对照组、免疫吸附组、化学药物组和差速贴壁组。S4 :形态学观察将不同培养时间的OECs于倒置相差显微镜(Olympus CK40型) 下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较。S5 =OECs纯度检测各组OECs培养14d后进行的纯度检测。采用GFAP免疫酶细胞染色DAB显色，苏木素复染，倒置显微镜下观察，随机选10个视野(0. 45mm2)并计数GFA P阳性细胞的百分率。本发明通过不同的的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法实验，结果显示体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75%。 P75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。故新生大鼠嗅球OECS 的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之P75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图I所示为本发明的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法的一个实施例的步骤流程图。
具体实施例方式如图I所示的本发明的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法的一个实施例的步骤流程图，所述实施例中所使用的材料如下新生I 2d的SD大鼠，购于苏州大学医学院实验动物中心；DM EM/F212培养基购于In2vit rogen公司，胰蛋白酶、Forskolin、牛垂体提取液(B PE)、阿糖胞苷(Ara C)、 多聚赖氨酸购于Sigma公司，小牛血清购于杭州四季青公司。胶质原纤维酸性蛋白GFA P 抗体、低亲和性神经营养因子受体P75抗体、生物素化山羊抗兔IgG，偶联辣根过氧化物酶 (HRP)的SABC购于武汉博士德公司。所述的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法如下SI :0ECs的取材选用新生I 2d的SD大鼠12只，用75%的酒精搽洗口鼻，浸入 75%的酒精中2min以消毒皮肤，在超净台内显露两侧嗅球，并将之取下(尽量保持其完整性)，置于盛有PBS平衡盐溶液的4°C冰浴的培养皿中，在手术显微镜下用显微外科剪仔细去除嗅球表面的毛细血管和软脑膜。S2 =OECs的分离将位于嗅球最外层的嗅神经层的嗅小球层以及少量连接的嗅神经轻轻剥下，用PBS液冲洗2遍，剪碎组织块，用浓度为O. 125%的胰蛋白酶消化液在37°C 下消化15min，经胰酶消化的组织小块移入生长培养液(20%小牛血清的DM EM/F212)中， 静置lOmin，以中和胰酶作用。离心(800r/min，3min)去除上清液，吸取管底的组织小块，生长培养液清洗2次(动作要轻，尽量不使粘连的组织小块分开)。将组织小块移入2ml的生长培养液中，再用火焰抛光后的Pasteur移液管反复吹打组织块15 20次，使之形成细胞悬液。取一滴细胞悬液滴于细胞计数板计数，用生长培养液调整细胞浓度为5X 105/ml。S3 :三种OECs纯化方法的比较研究12只大鼠取材后均分为正常对照组、免疫吸附组、化学药物组和差速贴壁组。(I)正常对照组将O ECs细胞悬液接种于预先包被多聚赖氨酸(50yg/ml，室温下Ih)的24孔细胞培养板内，37°C、体积分数为5%的C02培养箱(Heto 2000型)中， 培养2d后换维持培养液(10 %小牛血清的DMEM/F212+20 μ mol/LForskolin+20 μ g/ml BPE+10%双抗液)，每3天换液I次。此组未经任何纯化处理。(2)免疫吸附组将OECs细胞悬液接种于预先包被p75抗体(I μ g/ml，室温下Ih) 的25cm2玻璃培养瓶内培养15min，去除含未吸附细胞的培养基，用生长培养液洗涤5次，O.125%的胰蛋白酶消化，生长培养液调整细胞浓度为5X 105/ml后重新种植于预先包被多聚赖氨酸(50yg/ml，室温下Ih)的24孔细胞培养板内，余同他组。(3)化学药物组将O ECs细胞悬液接种于预先包被多聚赖氨酸(50 μ g/ml，室温下Ih)的24孔细胞培养板内培养3d后加入作用浓度为lOymol/L的阿糖胞苷(Ara2C)以抑制成纤维细胞等分裂迅速的细胞，48h后用培养液间隔15min洗3次，以去除Ara2C，余同他组。(4)差速贴壁组将OECs细胞悬液接种于无包被处理的25cm2玻璃瓶内培养18h 后将悬液细胞液吸出，移入另一个无包被处理的25cm2玻璃培养瓶内培养36h ;重新种植于预先包被多聚赖氨酸(50μ g/ml，室温下Ih)的24孔培养板内培养2天，余同他组。S4 :形态学观察将不同培养时间的OECs于倒置相差显微镜(Olympus CK40型) 下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较。S5 =OECs纯度检测各组OECs培养14d后进行的纯度检测。采用GFA P免疫酶细胞染色DAB显色，苏木素复染，倒置显微镜下观察，随机选10个视野(O. 45mm2)并计数GFA P阳性细胞的百分率。实验结果分析如下正常对照组在接种后Ih时就开始出现细胞贴壁，呈球形，周围有云状物质分布， 很难辨认细胞的形态结构。36h时悬浮细胞大多贴壁，细胞形态虽基本可辨，视野内主要有以下两种细胞一些为扁平多角形细胞，胞体发暗，有几个伪足样结构，可能为早期的成纤维细胞；另一些为双极或三极细胞。但此时尚难以准确区分细胞类型。3d后细胞继续生长， 两种细胞形态差别逐渐增大，成纤维细胞形态不规则，折光性差而暗，分裂迅速；而O ECs 则973轮廓清晰，立体感强，其突起为双极或三极，其中以对称突起的双极细胞为主，其胞体呈长梭形，细胞核位于中央亦呈梭形，三极细胞有三个突起，胞体呈三角形，细胞核位于中央亦呈圆形，两者共同的明显特点是突起细长。GFAP免疫细胞化学染色结果进一步证明了以上结论。5d时OECs细胞密度增加，胞体较亮，突起变长；背底有许多成纤维细胞存在， 胞体较大、扁平，其立体感、折光性较差，呈地毯状平铺于底壁。多次培养中偶然可见中枢其他种类的细胞，如小胶质细胞和纤维型星形胶质细胞，但其含量极少。7d时视野内成纤维细胞已达到60%以上，至14d成纤维细胞已完全长满，部分形成多层，OECs消失。而经过纯化处理的其他3组情况则不同，细胞类型始终以OECs为多数。接种14d后视野内的OECs 纯度均值都在75%以上，其中免疫吸附组为84. 3% ±4. 2%，化学药物组平均为80. 3% ±4. 7%，差速贴壁组平均为75.6% ±4.9%。体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的 OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75%。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。故新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化过程的分组纯化方法，所述纯化过程包括OECs的取材，OECs的分离，OECs分组纯化，形态学观察以及OECs纯度检测；所述分组纯化方法为将大鼠取材后分为正常对照组、免疫吸附组、化学药物组和差速贴壁组进行纯化步骤；其中，所述免疫吸附组的纯化方法为将OECs细胞悬液接种于预先包被p75抗体(I μ g/ml, 室温下Ih)的25cm2玻璃培养瓶内培养15min，去除含未吸附细胞的培养基，用生长培养液洗涤5次，O. 125%的胰蛋白酶消化，生长培养液调整细胞浓度为5 X 105/ml后重新种植于预先包被多聚赖氨酸(50μ g/ml，室温下Ih)的24孔细胞培养板内，余同他组；所述化学药物组的纯化方法为将OECs细胞悬液接种于预先包被多聚赖氨酸(50 μ g/ ml，室温下Ih)的24孔细胞培养板内培养3d后加入作用浓度为lOymol/L的阿糖胞苷 (Ara2C)以抑制成纤维细胞等分裂迅速的细胞，48h后用培养液间隔15min洗3次，以去除 Ara2C,余同他组；以及所述差速贴壁组的纯化方法为将OECs细胞悬液接种于无包被处理的25cm2玻璃瓶内培养18h后将悬液细胞液吸出，移入另一个无包被处理的25cm2玻璃培养瓶内培养36h ;重新种植于预先包被多聚赖氨酸(50 μ g/ml，室温下Ih)的24孔培养板内培养2天，余同他组。
全文摘要
本发明提出一种新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的分组纯化方法，其应用于新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化过程，所述纯化过程包括OECs的取材；OECs的分离OECs分组纯化及比较；形态学观察以及OECs纯度检测。本发明通过不同的的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的纯化方法实验，结果显示体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。故新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。
文档编号C12N5/079GK102604893SQ201110447639
公开日2012年7月25日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者吴卫江 申请人:吴卫江