专利名称：人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法。
背景技术：
神经干细胞的发现是神经科学领域的重大突破，为神经发育和神经组织移植等研究领域开辟了广阔前景。神经干细胞是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。一般认为神经干细胞主要存在于哺乳动物胎脑的纹状体、小脑半球、脑室区等，成年哺乳动物脑的侧脑室壁和海马等区。有关哺乳动物胚胎阶段和成年动物在特定脑区存在神经干细胞已不断得到证实，但对人类神经干细胞的研究尚少。本实验采用无血清培养和单细胞克隆技术尝试从人胚中脑中分离得到具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，并采用免疫荧光染色予以鉴定。
发明内容
本发明提供一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，从人胚中脑中分离培养并鉴定神经干细胞。其是利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚皮层中分离具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代，贴壁分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。具体的，本发明的人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法的实施步骤如下Sl 原代中脑神经干细胞的分离培养取胚龄10 13周水囊引产的新鲜人胚胎，在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B27(l 50)和EGFO0ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/ F12(l 1)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为IX 105/ml，将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37°C，5% (X)2条件下静置培养。S2 原代细胞的传代培养原代克隆形成后用0.25%胰酶371消化15 30min (也可机械切割分离或吹打)，制成单细胞悬液，用含B27和EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1 X 106/ml浓度传代接种于培养瓶，在37°C，5% CO2条件下静置培养，直至次代克隆球的产生。平均5 7d传代一次。S3 细胞诱导分化将不同代数的神经球(Pc^PnPyP3)体外培养7d后种植入多聚赖氨酸包被的含胎牛血清培养基(DMEM/F12+B27+10% FBS)培养皿中，体外!3h，10d，14d进行免疫细胞化学染色。S4 免疫细胞化学染色
1、以间接免疫荧光法检测刚贴壁池神经球中神经巢蛋白(Nestin蛋白)表达，及检测神经球体外分化14d后，分化细胞中神经微丝(NFneurofilament)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、Galc (半乳糖脑苷)的表达。所用一抗为抗NestinlgG、抗NF IgG、抗GFAPIgG、抗 Galc IgG，二抗为FITC荧光二抗。2、用SABC组织化学染色试剂盒检测在神经球分化IOd后，分化细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。SABC法细胞染色具体染色步骤参照染色试剂盒说明。S5 细胞计数免疫细胞化学染色TH(+)的细胞代表多巴胺能神经元，苏木精复染，兰色细胞核数代表总细胞数。倒置显微镜下(20 X)对分化的细胞随机选择4个独立视野计数TH(+)细胞及总细胞数。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法的步骤流程示意图。
具体实施例方式如图1所示的本发明的人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法的步骤流程示意图，所述方法是通过以下步骤具体实现Sl 原代中脑神经干细胞的分离培养取胚龄10 13周水囊引产的新鲜人胚胎，在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含B27(l 50)和EGF(20ng/ml)、bFGFQOng/ml)的DMEM/ F12(l 1)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为lX105/ml，将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37°C，5% (X)2条件下静置培养。S2 原代细胞的传代培养原代克隆形成后用0.25%胰酶371消化15 30min (也可机械切割分离或吹打)，制成单细胞悬液，用含B27和EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1 X 106/ml浓度传代接种于培养瓶，在37°C，5% CO2条件下静置培养，直至次代克隆球的产生。平均5 7d传代一次。S3 细胞诱导分化将不同代数的神经球(Pc^PnPyP3)体外培养7d后种植入多聚赖氨酸包被的含胎牛血清培养基(DMEM/F12+B27+10% FBS)培养皿中，体外!3h，10d，14d进行免疫细胞化学染色。S4:免疫细胞化学染色1、以间接免疫荧光法检测刚贴壁池神经球中神经巢蛋白(Nestin蛋白)表达，及检测神经球体外分化14d后，分化细胞中神经微丝(NFneurofilament)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、Galc (半乳糖脑苷)的表达。所用一抗为抗NestinlgG、抗NF IgG、抗GFAP IgG、 抗Galc IgG, 二抗为FITC焚光二抗。2、用SABC组织化学染色试剂盒检测在神经球分化IOd后，分化细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。SABC法细胞染色具体染色步骤参照染色试剂盒说明。
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S5 细胞计数免疫细胞化学染色TH(+)的细胞代表多巴胺能神经元，苏木精复染，兰色细胞核数代表总细胞数。倒置显微镜下(20 X)对分化的细胞随机选择4个独立视野计数TH(+)细胞及总细胞数。实验结果及分析如下一、人胚中脑原代细胞成圆形球状，悬浮生长，经台盼蓝染色计数活细胞在80%以上，7d后细胞数目明显增加，培养瓶中可见许多悬浮生长的细胞团块成球形，称神经球。此类神经球体外NESTIN染色强阳性，并在体外能分化成NF (+)，GFAP (+)及细胞。二、原代神经球经0. 25 %胰酶37°C消化后，形成细胞悬液，10 % 30 %细胞死亡， 2 3d后，培养基中出现大量新的小神经球成桑椹样生长，并逐渐增大，形成次代神经球。三、人胚中脑神经干细胞体外分化产生TH(+)细胞随传代次数增加而逐渐减少。 在原代神经干细胞(Ptl)分化IOd后，免疫细胞化学染色示TH⑴细胞占总细胞比例约 5. 65% 士 1. 39%，体外培养7d后传代得到P1代神经干细胞，分化IOd后免疫细胞化学染色示TH⑴细胞占总细胞比例降至1.56% 士0.37%。随着体外培养时间及传代次数的增加， TH(+)细胞也迅速下降，至第三代以后TH(+)细胞少于0.01%。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，所述方法包括以下步骤51原代中脑神经干细胞的分离培养取胚龄10 13周水囊引产的新鲜人胚胎，在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液，加入含 B27(l 50)和 EGFQ0ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的 DMEM/F12(1 1) 无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整活细胞浓度为lX105/ml，将原代细胞种植于 25平方厘米培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)，37°C，5 % CO2条件下静置培养；52原代细胞的传代培养原代克隆形成后用0. 25%胰酶37°C消化15 30min或采用机械切割分离或吹打，制成单细胞悬液，用含B27和EGF、bFGF的无血清培养基将细胞悬液按1 X 106/ml浓度传代接种于培养瓶，在37°C，5% CO2条件下静置培养，直至次代克隆球的产生；平均5 7天传代一次；53细胞诱导分化将不同代数的神经球体外培养7天后种植入多聚赖氨酸包被的含胎牛血清培养基(DMEM/F12+B27+10% FBS)培养皿中，体外3h，10d, 14d进行免疫细胞化学染色；S4:免疫细胞化学染色；以及S5 细胞计数。
2.一如权利要求1所述的人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，所述免疫细胞化学染色方法包括1、以间接免疫荧光法检测刚贴壁池神经球中神经巢蛋白(Nestin蛋白)表达，及检测神经球体外分化14天后，分化细胞中神经微丝(NFneurofilament)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、Galc (半乳糖脑苷)的表达；所用一抗为抗NestinlgG、抗NF IgG、抗GFAP IgG、抗 Galc IgG，二抗为FITC荧光二抗;2、用SABC组织化学染色试剂盒检测在神经球分化10天后，分化细胞中酪氨酸羟化酶 (TH)的表达；SABC法细胞染色具体染色步骤参照染色试剂盒说明。
全文摘要
本发明提出一种人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法，从人胚中脑中分离培养并鉴定神经干细胞。其包括步骤原代中脑神经干细胞的分离培养、原代细胞的传代培养、细胞诱导分化、免疫细胞化学染色以及细胞计数。本发明利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚皮层中分离具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代，贴壁分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。
文档编号C12N5/0793GK102443570SQ20111044790
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者陆华 申请人:陆华