专利名称：一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用寡核苷酸探针的溶解曲线，和特定的荧光标记实现HPV亚型的分型检测方法，特别涉及一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法。
背景技术：
宫颈癌是妇女高发的恶性肿瘤之一。几乎所有的宫颈癌标本中可检出HPV DNA, HPV阴性者几乎无罹子宫颈癌之忧，因此，HPV被确认为子宫颈癌发生的必要条件。人乳头状瘤病毒(HPV)型别有80多种，按其感染部位分为皮肤型和生殖道型HPV。大约有35种型别与生殖道感染有关，约20种与肿瘤相关。依据与癌发生关系,分为低危型HPV(如6、11、42,43和44型等可引起外生殖器湿疣、宫颈上皮内低度病变等)和高危型HPV(如HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型与子宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关)。而HPV16和18型感染率最高，即HPV16占所有型别的50%，其病理类型主要为子宫颈癌鳞状上皮细胞癌；HPV18占14%，在子宫颈腺上皮细胞癌占主要地位；HPV45占8% ; HPV31占5% ;其他型别占23%。所以针对HPV分型的检测对于宫颈癌的预防十分有必要。 由于目前尚无有效的技术手段能够在体外培养HPV，所以目前为止没有有效的HPV血清学分型方法。传 统的诊断方法主要是形态学检查方法，包括巴氏涂片、液基薄层细胞检查、阴道镜等；免疫学检查，主要是酶联免疫反应。这些传统的技术手段，存在较高假阳性和假阴性率，由于这些不足，分子生物学技术被引入HPV的临床检测，它们包括，原位杂交、杂交捕获、PCR、PCR反向点杂交等技术，其中杂交捕获是目前美国FDA唯一批准可用于临床检测的试剂盒，但这些方法有个共同的缺点就是操作复杂，耗时长大大制约了临床的应用。
荧光定量PCR检测技术是1990年诞生的技术，从一开始就受到广泛的关注和应用，以荧光定量PCR仪为平台，给种革新的技术层出不穷，主要包括，sybrgreen染料法、 Taqman探针法、分子信标、FRET等技术，他们各有优缺点，和各自不同的应用领域。随着荧光定量PCR技术越来越普及，荧光定量PCR仪成为了医院检验科室不可缺少的仪器。发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法，实现对13中HPV亚型检测的目的。
本发明是通过以下的技术方案实现的
一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法，是通过以下的技术方案实现的
第一步用宫颈刷采集宫颈脱落细胞，将采集完毕的宫颈刷浸泡于3_5ml宫颈细胞保存液中；
第二步将宫颈刷在细胞保存液中充分洗涤，后丢弃，然后将细胞保存液与 lOOOOg，左右离心，去除上清，加500ul细胞裂解液(IOmMTris-Hcl PH9. 0、50mM KCL)，震荡混匀，100°C孵育5分钟后，自然冷却至室温后，lOOOOg，离心3分钟，每个25ul的荧光PCR 反应取l_5ul上清。
所述保存液是生理盐水，或者是PH7. 4的磷酸盐缓冲液。
本发明的有益效果为检测效果准确。
图1是HPV16检测结果图
图2是HPV18检测结果图
图3是HPV31检测结果图
图4是HPV33检测结果图
图5是HPV35检测结果图
图6是HPV39检测结果图
图7是HPV45检测结果图
图8是HPV51检测结果图
图9是HPV52检测结果图
图10是HPV56检测结果图
图11是HPV58检测结果图
图12是HPV59检测结果图
图13是HPV68检测结果图具体实施方式
以下结合附图，对本发明做进一步说明。
第一步用宫颈刷采集宫颈脱落细胞，将采集完毕的宫颈刷浸泡于3_5ml宫颈细胞保存液中；
第二步将宫颈刷在细胞保存液中充分洗涤，后丢弃，然后将细胞保存液与 lOOOOg，左右离心，去除上清，加500ul细胞裂解液(IOmMTris-Hcl PH9. 0、50mM KCL)，震荡混匀，100°C孵育5分钟后，自然冷却至室温后，IOOOOg,离心3分钟，每个25ul的荧光PCR 反应取l_5ul上清。所述保存液是生理盐水，或者是PH7. 4的磷酸盐缓冲液。
第三步荧光PCR反应体系参见下表I。
表I
权利要求
1.一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法，其特征在于是通过以下的技术方案实现的第一步用宫颈刷采集宫颈脱落细胞，将采集完毕的宫颈刷浸泡于3-5ml宫颈细胞保存液中；第二步将宫颈刷在细胞保存液中充分洗涤，后丢弃，然后将细胞保存液与10000g，左右离心，去除上清，加500ul细胞裂解液(IOmMTris-Hcl PH9. 0、50mM KCL)，震荡混匀，100°C 孵育5分钟后，自然冷却至室温后，IOOOOg,离心3分钟，每个25ul的荧光PCR反应取l_5ul上清。
2.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法，其特征在于所述保存液是生理盐水，或者是PH7. 4的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种人乳头瘤病毒荧光核酸扩增检测方法，首先用宫颈刷采集宫颈脱落细胞，将采集完毕的宫颈刷浸泡于3-5ml宫颈细胞保存液中，保存液可以使生理盐水，也可以是pH7.4的磷酸盐缓冲液；然后将宫颈刷在细胞保存液中充分洗涤，后丢弃，然后将细胞保存液与10000g，左右离心10分钟。去除上清，加500ul细胞裂解液(10mM Tris-Hcl pH9.0、50mM Kcl)，震荡混匀，100℃孵育5分钟后，自然冷却至室温后，10000g，离心3分钟，每个25ul的荧光PCR反应取1-5ul上清。
文档编号C12R1/93GK102994646SQ20111027823
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者潘振华, 孙朝辉 申请人:潘振华