专利名称：特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体及用于诊断疟疾的组合物。
背景技术：
疟疾的症状包括头痛、肌痛、发热、呕吐等等。然而，基于这些症状并不能诊断疟疾，因为它们并不是疟疾特有的症状。典型地，疟疾通过显微镜检查来诊断，但是，由于该方法需要昂贵的设备和熟练的操作人员，因此并不适用于疟疾流行地区的初步诊断。免疫层析诊断分析提供了潜在的替代方法。然而，基于抗原-抗体反应，典型免疫层析便携式诊断试剂盒可随其储存环境而在诊断准确度方面发生变化。在疟疾爆发的情形下根据初步诊断作出的初步应对措施对疟疾的后续治疗具有重大影响，因此，便携式诊断试剂盒必须具有良好的性能。
pLDH是一种必需酶，该必需酶是在疟疾寄生虫的整个生命周期中可检测的，并且该必需酶参与疟疾寄生虫的新陈代谢。全部四种疟疾寄生虫具有这种酶，所述酶具有高度保守的氨基酸序列。目前大多数可用的便携式疟疾诊断试剂盒均基于PLDH的抗体并且可用于诊断所有四种疟疾。适体为一种结合于特异性标靶的单链DNA (ssDNA)或单链RNA (ssRNA)。得益于适体对特异性标靶的高亲和性和高稳定性，最近它们被广泛地研制并活跃地应用于疾病的治疗以及诊断疾病的传感器中。适体的合成可相对容易，并且可使用细胞、蛋白甚至小的有机物质来作为它们的标靶，这使新的检测方法得以发展。此外，因为适体与先前研制的抗体相比具有更良好的特异性和稳定性，发现适体可在各种领域中广泛应用，包括治疗方法、药物递送系统、诊断用的生物传感器的研制等等。为诊断用途而研制的抗体使用免疫系统来制备，因此它们具有制备时间相对长、成本相对高的缺点。此外，与适体、DNA或RNA相比，上述为诊断用途而研制的抗体是具有较低稳定性的蛋白，这可阻碍高度敏感的传感器的研制。由于大多数疟疾流行的地区是炎热且潮湿的，基于抗体的诊断系统显示出低准确性。因此，需要一种可克服现有技术面临的问题的疟疾诊断系统。
发明内容
本发明提供特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体、包含所述DNA适体的用于诊断疟疾的组合物，以及使用所述DNA适体的疟疾诊断试剂盒。然而，本发明将要实现的技术目标并非仅限于上面提及的目标，本领域技术人员可从下列给出的描述中清楚地理解其他目标。本发明一方面提供特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的适体，所述特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的适体具有SEQ ID NO 1的碱基序列或SEQ ID NO 2的碱基序列。
本发明另一方面提供用于诊断疟疾的组合物，所述组合物包含特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体。本发明又一方面提供用于疟疾的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒使用特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体。本发明的一种实施方式中，本发明的DNA适体与SEQ ID NO :I的碱基序列或SEQID NO :2的碱基序列具有70%的序列同源性或高于70%的序列同源性。由于在特异性和稳定性上比常规用于诊断疟疾的抗体更加优越，本发明的特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体可制成生物传感器，所述生物传感器以高敏感度和高准确度测定PLDH水平，这大大有助于疟疾的诊断准确性。
本发明的上述内容及其他目的、特征及其他优势将从下列结合附图的详细描述中得到更清晰的理解，其中图I显示由SDS PAGE测得的pvLDH蛋白的表达；图2显示由凝胶过滤(Superdex200柱)纯化的pvLDH蛋白的分离；图3为显示ssDNA适体与pvLDH的结合强度的图，所述结合强度根据pvLDH的特异性适体的选择，通过UV分光仪检测；图4显示由Mfold程序预测的所选择的SEQ ID NO l(a)的ssDNA和SEQID NO 2(b)的ssDNA的二级结构。图5显示由EMSA(电泳迁移率变动分析)测得的SEQ ID NO 1的适体和SEQ IDNO 2的适体结合于间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH和恶性疟原虫乳酸脱氢酶pfLDH的能力(以SYBR 绿染色，泳道I :pvLDH，泳道2 :适体#2，泳道3 :适体#2+pvLDH，泳道4 :适体#1，泳道5 :适体#l+pvLDH,泳道6 pfLDH,泳道7 :适体#2，泳道8 :适体#2+pfLDH,泳道9 适体#1，和泳道10 :适体#l+pfLDH)；图6显示由EMSA(电泳迁移率变动分析)测得的SEQ ID NO 1的适体和SEQ IDNO 2的适体结合于间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH和恶性疟原虫乳酸脱氢酶pfLDH的能力(以考马斯蓝染色，泳道I :pvLDH，泳道2 :适体#2，泳道3 :适体#2+pvLDH，泳道4 :适体#1，泳道5 :适体#l+pvLDH，泳道6 pfLDH,泳道7 :适体#2，泳道8 :适体#2+pfLDH，泳道9 :适体#1，泳道 10 :适体 #l+pfLDH)；图7显示所预测的SEQ ID NO 1的适体的二级结构；图8显示适体突变子的碱基序列，所述适体突变子用于实施例的突变分析，其中，突变碱基被标出；以及图9显示由EMSA(电泳迁移率变动分析)测得的适体突变子的能力(泳道I : pvLDH，泳道2 :适体#1,泳道3 :适体#l+pvLDH，泳道4 :环I突变子，泳道5 :环I突变子+pvLDH,泳道6 :茎突变子，泳道7 :茎突变子+pvLDH，泳道8 :环2突变子，泳道9 :环2突变子 +pvLDH)ο
具体实施方式
为了研制作为pLDH抗体的替代物的适体，将pLDH在细菌表达系统中表达，纯化，并用于通过SELEX (配体指数富集法系统演化)技术来选择DNA适体，随后分析所述DNA适体的序列和结构，从而达到本发明的目的。更详细来说，本发明提供特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体，所述DNA适体具有SEQ ID NO I的喊基序列或SEQ ID NO 2的喊基序列。另外，本发明提供一种用于诊断疟疾的组合物，所述组合物包含特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶PLDH的DNA适体。除了所述DNA适体之外，本发明的组合物还可包含药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述载体、赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、对羟基苯甲酸甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。当配制成剂型时，所述组合物还可包含典型的过滤器、增稠剂、粘合剂、崩解剂、 表面活性剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、芳香剂、乳化剂和/或防腐剂。另外，本发明提供用于疟疾的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒使用特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶PLDH的DNA适体。优选地，本发明的DNA适体具有SEQ ID NO : I的碱基序列或SEQ ID NO : 2的碱基序列，但不限于所述碱基序列。如果DNA适体与SEQ ID NO : I的碱基序列或SEQ ID NO 2的碱基序列具有70%的同源性或70%以上的同源性，那么该DNA适体落入本发明的范围内。根据本发明的DNA适体具有三个必需区(i)环1(5’ -TTCCNTNGN-3’)，(ii)富含G-C的莖，及(iii)环2(5’-AGT-3’)。当具有这三个区时，任何DNA适体可用于本发明中，即使其他区可能与SEQ ID NO I的喊基序列或SEQ ID NO 2的喊基序列的相应区不同。pLDH的例子包括pvLDH(间日疟原虫乳酸脱氢酶)、pfLDH (恶性疟原虫乳酸脱氢酶)、pmLDH(三日疟原虫乳酸脱氢酶)和poLDH(卵形疟原虫乳酸脱氢酶)，但并不仅限于此。通过以下实施例可更好地理解本发明，以下实施例是为了举例说明，并无意限制本发明。实施例实施例I :间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH基因克隆合成用于扩增pvLDH基因的具有BamHl的限制性位点的5’弓丨物(CCCGGATCCATGACGCCGAAAATTGT)和具有Xhol的限制性位点的 3’ 引物(CCCCTCGAGTTAAATGAGCGCCTTCATCCTTTTAGTCT)。在存在 i_pfu 聚合酶的条件下，使用这些引物对间日疟原虫的基因组DNA进行扩增。PCR按照下列步骤进行35个循环1) 94°C使模板双链变性，持续30秒，2) 56°C使模板双链与所述引物退火，持续30秒，以及3)72°C延伸新链，持续I分钟。用限制性内切酶消化所扩增的pvLDH基因，连接到包含(His) 6_标签的pET28a载体上，并转化至BL21(DE3)E. coli内。实施例2 pvLDH蛋白的表达371下，在1^仏111^3 Bertani)培养基中培养用所述pvLDH基因转化的BL21 (DE3)细胞，直至0D_ (光密度)达到O. 6。然后，通过在存在O. 2mM IPTG (异丙基-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷)的条件下，18°C培养细胞16小时来诱导所述蛋白表达。由SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)来确定所述蛋白的表达。通过离心进行收集之后，用卩85(101111磷酸钠，1501111似(1，？!1 7.4)洗涤所述细胞一次。SDS-PAGE结果在图I中显示。实施例3 pvLDH蛋白的纯化为了将在细菌细胞BL21(DE3)中表达的pvLDH蛋白分离至高纯度，在裂解缓冲液(20mM Tris,500mM NaCl,0. 5mM β -巯基乙醇，5%丙三醇，IOmM咪唑，pH 8.0)中裂解所述细胞并由超声波分解法破碎所述细胞15分钟。以12，OOOrpm的速度离心40min，从细胞碎片中分离上清液蛋白。Ni-NTA对(His)6_标签氨基酸残基的亲和性用于将蛋白分离至高纯度。就这点而言，FPLC (快速蛋白液相色谱)与Ni-NTA柱联合使用，随后将包含pvLDH的上清液上样于Ni-NTA柱。因为蛋白的(His)6-标签与咪唑竞争，所以用洗脱缓冲液(20mM Tris,500mMNaCl,0. 5mM β -巯基乙醇，5%丙三醇，400mM咪唑，pH 8.0)洗脱结合于柱的靶蛋白。
为了获取更纯的蛋白，使包含pvLDH的部分流经与FPLC联合的离子交换柱MonoQ，从而根据P〗来分离蛋白。因为pvLDH并不结合于柱,通过使用Superdex200柱的凝胶过滤，对不结合的部分进行体积排阻色谱分析。结果在图2中显示。实施例4 :用SELEX寻找pvLDH的适体<4-l>ssDNA (单链DNA)文库的构建构建含有90条序列的文库，每条序列两端具有用于PCR扩增和克隆的引物序列，并且所述引物序列之间具有40个碱基的随机DNA序列(5’-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3，)。此外，还使用5’ 弓丨物(5，-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3’)、3’ 弓丨物(5’ -GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’)和生物素-结合的3’引物(5’ -生物素-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’ )来进行PCR扩增及ssDNA的制备。本发明所使用的所有寡核苷酸均由Bionics (韩国)合成并进行PAGE纯化。〈4_2> 将 pvLDH 固定至 Ni-NTA 磁珠将所纯化的pvLDH固定至磁珠Dynabead(Invitrogen公司，挪威)上,使His-标签结合于其钴包被的表面。就这点而言，通过如下方式将蛋白固定于所述磁珠上凭借外部磁体用结合缓冲液(20mM Tris, 50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH8. 0)洗涤20 μ L 的磁珠并用含有500pmol蛋白的100 μ L结合缓冲液孵育该磁珠。<4-3>选择pvLDH的特异性适体为了选择pvLDH的特异性适体，实施了一种使用磁体的特异性分离方法。首先，将所述ssDNA文库(Inmol)溶解于100 μ L的结合缓冲液中，90°C孵育3min，然后4°C孵育一小时，使得ssDNA形成最稳定的构象。然后，使该文库与固定于磁珠上的pvLDH蛋白反应一小时，伴随轻柔搅拌。然后，用结合缓冲液洗涤磁珠两次，从而除去仍然未与固定至所述磁珠的pvLDH结合的ssDNA。然后，从与ssDNA结合的蛋白中分离ssDNA。在此情况下，用洗脱缓冲液(20mMTris,50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,0· 01 %吐温 20，300mM 咪唑，pH 8. O)洗脱 ssDNA 和与其结合的蛋白。在乙醇中沉淀ssDNA洗脱液，将得到的沉淀物溶解于60 μ L的蒸馏水中，然后用作PCR扩增的模板,所述PCR扩增在存在i-pfu聚合酶(Intron Biotechnology公司，韩国)的条件下，使用5’引物和生物素-结合的3’引物进行。为了分离用于选择的ssDNA，在偶联缓冲液(5mM Tris-HCl,O. 5mM EDTA，IM NaCl，O. 005%吐温 20，pH 7.5)中用链霉亲和素包被的磁珠孵育生物素-结合的PCR产物持续一小时，然后用100 μ L的IOOmMNaOH孵育5分钟，只有ssDNA被分离出来。使用外部磁体获得ssDNA。在后续的重复选择中使用第一次选择的ssDNA。就严格选择而言，ssDNA的量和pvLDH的浓度在后续的重复选择中逐渐下降。在选择的过程中，ssDNA与pvLDH的结合通过检测重复选择中洗脱的ssDNA的浓度来监测,所述监测使用UV分光仪(Biochrom LibraS22分光仪)。结果在图3中显示。<4-4>适体的序列分析和结构分析使用未修饰的5 ’引物和3 ’引物，通过PCR对第10次重复选择中的ssNDA进行扩增并克隆至pENTR/T0P0(T0P0 TA克隆试剂盒，Invitrogen公司，美国)，随后转化至E. coliTOPlO (Invitrogen公司，美国)中。然后使用小量提取试剂盒(GeneAll公司，韩国)来纯 化包含ssDNA的克隆并对其进行碱基测序(Genetech公司，韩国)。由此,确定ssDNA序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，并在下表I中列出。为了分析所选择的ssDNA的结构相似性，使用Mfold程序(http://mfold.bioinfo. rpi. edu/cgi-bin/dna-forml. cgi)对所选出的ssDNA序列的二级结构进行分析。如图4和图5所示，发现它们具有共同的序列及结构。表I
SEQ ID NO 减基序列~ GTTCGATTGGATTGTGCCGGAAGTGCTGGCTCGMC
2GAACTCATTGGCTGGAGGCGGCAGTACCGCTTGAGTTC实施例5 :适体结合于除间日疟原虫外的其他物种的LDH的能力的电泳迁移率变动分析(EMSA)进行EMSA (电泳迁移率变动分析)来检测SEQ ID NO 1的适体和SEQID NO 2的适体能否结合于除PvLDH外的其他疟疾寄生虫物种的LDH。室温下，在20 μ L的结合缓冲液中，用ΟμΜ或2. 5μΜ的pvLDH (间日疟原虫乳酸脱氢酶)或者O μ M或2. 5 μ M的PfLDH (恶性疟原虫乳酸脱氢酶)分别孵育O. 5 μ M的SEQID NO :1的适体和O. 5 μ M的SEQ ID NO :2的适体持续一小时，然后在低至(TC的温度下，在120伏特的电场中，在6%丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离持续40min，所述胶为，该过程在低至0°C的温度下进行从而防止蛋白-适体复合物的高温变性。所述胶用SYBR 绿和考马斯蓝染色，染色结果在图5和图6中显示。将图5和图6每条泳道中电泳分离的详细描述归纳于下表2中。如图5和图6所示，发现虽然SEQ ID NO :1的适体和SEQ ID NO :2的适体是通过pvLDH发掘的，但与结合于pvLDH—样，SEQ ID NO : I的适体和SEQ ID NO :2的适体也结合于pfLDH，我们认为，上述现象可归结于以下事实由于pvLDH的氨基酸序列和pfLDH的氨基酸序列之间具有90%或90%以上保守率，因此pvLDH和pfLDH在功能上非常相似。表权利要求
1.一种特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶PLDH的DNA适体，其中，所述DNA适体具有SEQID NO I的喊基序列或SEQ ID NO 2的喊基序列。
2.如权利要求I所述的DNA适体，其中，所述DNA适体与SEQID NO 1的碱基序列或SEQ ID NO :2的碱基序列具有70%的同源性或高于70%的同源性。
3.如权利要求I所述的DNA适体，其中，所述疟原虫乳酸脱氢酶pLDH选自间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH、恶性疟原虫乳酸脱氢酶pfLDH、三日疟原虫乳酸脱氢酶pmLDH和卵形疟原虫乳酸脱氢酶PoLDH及其组合。
4.一种用于诊断疟疾的组合物，所述组合物包含权利要求I所述的DNA适体。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述DNA适体与SEQID NO : I的碱基序列或SEQID NO :2的碱基序列具有70%的同源性或高于70%的同源性。
6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述疟原虫乳酸脱氢酶pLDH选自间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH、恶性疟原虫乳酸脱氢酶pfLDH、三日疟原虫乳酸脱氢酶pmLDH和卵形疟原虫乳酸脱氢酶PoLDH及其组合。
7.一种疟疾的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒使用权利要求I所述的DNA适体。
8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其中，所述DNA适体与SEQID NO : I的碱基序列或SEQ ID NO :2的碱基序列具有70%的同源性或高于70%的同源性。
9.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其中，所述疟原虫乳酸脱氢酶pLDH选自间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH、恶性疟原虫乳酸脱氢酶pfLDH、三日疟原虫乳酸脱氢酶pmLDH和卵形疟原虫乳酸脱氢酶PoLDH及其组合。
全文摘要
本发明公开了一种特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体、含有所述DNA适体的用于诊断疟疾的组合物以及使用所述DNA适体的用于疟疾的诊断试剂盒。由于在特异性和稳定性上比常规用于诊断疟疾的抗体更为优越，根据本发明的特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体可制成以高敏感度和高准确度测定pLDH水平的生物传感器，这大大有助于疟疾的诊断准确性。
文档编号C12Q1/68GK102816763SQ20121001510
公开日2012年12月12日 申请日期2012年1月17日 优先权日2011年6月7日
发明者潘沧一, 全伟政, 李成焕 申请人:浦项工科大学校产学协力团