一株可降解三乙胺的索氏菌、选育方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株可降解三乙胺的索氏菌、选育方法及应用。从南京市某污水处理厂长期处理含三乙胺废水的二沉池污泥中分离、筛选得到了三乙胺特效降解菌株T12，经鉴定为索氏菌（Thaurea?sp.），命名为（Thaurea?sp.）T12，GenBank登陆号为KF019186，菌株已于2013年10月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC?NO:M2013477。该菌株为国内外第一株可用于三乙胺废水处理的索式菌，和其他三乙胺降解菌株相比，该菌株具有高效的三乙胺降解能力、很好的适应能力及耐受性能，在高浓度三乙胺废水的处理中具有良好的应用前景。
【专利说明】—株可降解三乙胺的索氏菌、选育方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境有机污染物生物处理【技术领域】，具体涉及一株降解三乙胺的细菌、选育方法及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
【背景技术】
[0002]三乙胺(TEA)有广泛的用途，在化工行业中被用作溶剂和催化剂，在有机合成材料中作为原料，三乙胺有毒并具有强烈的氨臭味。在一些工业废水中三乙胺含量很高，严重威胁环境和人类的健康。因此，将三乙胺从环境中去除是非常重要的。目前，三乙胺的去除方法主要分为三类:物理法、化学法和生物降解法。但由于物理化学法处理三乙胺废水成本高，通常会有二次污染。因此，一般更倾向于用生物降解法处理三乙胺。
[0003]生物降解法是一种有效去除有机物的方法，因为成本低、有完全降解的可能性。目前，用生物法处理三乙胺的研究少之甚少，能降解三乙胺的纯菌株包括假单胞菌属RA1，分支杆菌属RA2和节杆菌属R4，它们能以三乙胺作为唯一的碳源和氮源。然而，至今并未出现关于索氏菌sp.)降解三乙胺的报道。此外，目前已报道的大部分三乙胺降解菌对三乙胺的耐受浓度低(小于100mg/L)，降解速率慢，难以满足实际工程应用的要求。降解效率高、对三乙胺耐受浓度高、能适应真实环境的的新型、高效降解菌的筛选具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对目前三乙胺降解菌株对三乙胺耐受浓度低、处理效率低、菌株种类较为单一等不足，提供一株可高效降解三乙胺的新型菌株sp.) T12。
`[0005]本发明的另一目的在于提供一株可高效降解三乙胺的新型菌株{Thaurea sp.)T12的选育方法。
[0006]本发明还有一个目的是提供(Saarea sp.) T12在含三乙胺废水处理领域的应用。
[0007]实现本发明目的技术解决方案是:本发明从南京市某污水处理厂长期处理含三乙胺废水的二沉池污泥中分离、筛选得到了三乙胺特效降解菌株T12，经鉴定为索氏菌(.Thaurea sp.)，命名为(Jhaurea sp.)T12，GenBank 登陆号为 KF019186，菌株已于 2013 年10月17日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 2013477。该菌株为国内外第一株可用于三乙胺废水处理的索式菌。
[0008]一株可高效降解三乙胺的新型菌株(Saareasp.)T12的选育方法，包括以下步骤:
(I)菌株的驯化:取10 mL长期用来处理三乙胺的污泥水与200 mLMSM无机盐液体培养基混合，放入500 mL锥形瓶中，150转/分转速、30°C摇床培养6h，过滤弃去沉淀，将滤液按接种量5%转接到含100 mg/L三乙胺的MSM无机盐液体培养基中，150转/分转速、30°C培养48h后，重复该过程直至三乙胺基本去除，然后再以7 d为一个驯化周期，三乙胺按100mg/L浓度差递增，驯化4个周期后得到菌悬液；
(2)菌株的分离:将所得的菌悬液用无菌水按10倍逐级稀释到IO6-1O9倍，涂布于以三乙胺为唯一碳氮源的MSM无机盐固体培养基上,放入培养箱中30°C倒置培养,随时观察菌株的生长情况，72h后挑取单菌落，在含400 mg/L三乙胺的MSM无机盐固体培养基中进行划线分离纯化，重复数次，得到单菌落，并进行斜面保存；
(3)菌株的筛选:挑取分离所得到的单菌落，分别接种于含400mg/L三乙胺的MSM无机盐液体培养基中，摇床培养56 h，测定培养基中三乙胺浓度变化，并选取培养基中三乙胺浓度显著降低的单菌落。
[0009]一株可降解三乙胺的索氏菌的应用，将上述培养得到的菌株T12制备成种子液，用于三乙胺的废水处理中，废水pH值为7-8，废水中三乙胺浓度不大于400mg/L。
[0010]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
本发明所提供的(raa?rmSp.)T12，可以以三乙胺为唯一碳源、氮源进行生长。本发明直接采用以三乙胺为唯一碳源和氮源的培养基进行三乙胺降解菌的富集，并采用以三乙胺为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，筛选过程迅速快捷，在该培养基上杂菌较少，减少了复筛的工作量。
[0011]三乙胺废水的应用研究表明，筛选得到的(Saareasp.)Τ12，可在56h内实现浓度为400mg/L的三乙胺废水的处理，三乙胺降解率分别达到100%。在三乙胺浓度为0_400mg/L的范围内，(Saareasp.)T12可正常生长并实现三乙胺的完全降解。在pH为7.0-8.0的范围内，(.Thaureas\>.) T12对三乙胺有较好的降解。低浓度(200mg/L)易降解碳源乙酸钠的加入可对三乙胺降解起促进作用。和其他三乙胺降解菌株相比，该菌株具有高效的三乙胺降解能力、很好的适应能力及耐受性能，在高浓度三乙胺废水的处理中具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明菌株的扫描电镜照片(a 8000倍，b20000倍)。
[0013]图2是本发明菌株似sp.)T12的生长曲线、对三乙胺的降解曲线、降解过程中氨氮的释放的变化情况。
[0014]图3是本发明废水中三乙胺浓度对菌株(Saaraa sp.)Τ12的生长和三乙胺降解的影响。
[0015]图4是本发明废水pH对三乙胺降解的影响。
[0016]图5是本发明废水中易降解碳源的存在对三乙胺降解的影响。
[0017]图6为本发明菌株(TXatfreasp.) T12的16S rDNA序列表。
【具体实施方式】
[0018]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0019]实施例1:三乙胺降解菌(Saara3sp.)T12的驯化、筛选分离及其对三乙胺的降解性能
⑴菌株的驯化分离取10 mL污泥水(取自于南京市某污水处理厂用于长期处理三乙胺废水的污泥)与200mL MSM无机盐培养基混合，放入500 mL锥形瓶中，150 rpm转速、30°C摇床培养6h，过滤弃去沉淀。将滤液(接种量5%)转接到三乙胺浓度为100 mg/L的MSM无机盐液体培养基中，150转/分转速、30°C培养48h后，三乙胺基本去除，然后重复该过程2次。以7 d为一个驯化周期，三乙胺以100 mg/L浓度差从100 mg/L递增至400 mg/L，驯化4个周期后，直至三乙胺几乎去除后，将所得的菌悬液用无菌水以数量级10倍逐级稀释IO6-1O9倍，涂布于以三乙胺为唯一碳氮源的MSM无机盐固体培养基上,放入培养箱中30°C倒置培养,随时观察菌株的生长情况，72h后挑取单菌落，在三乙胺浓度为400 mg/L的MSM无机盐固体培养基中进行划线分离纯化(重复4次)，得到单菌落，并进行斜面保存。
[0020]MSM无机盐培养基的组成如下:0.76g KH2PO4, 3.06g Na2HPO4.12H20，0.05g CaCl2,
0.2g MgSO4.7H20, IOmL 微量元素溶液 YK-1, 1000mL 蒸馏水。
[0021]其中微量元素溶液YK-1 为:0.2g/L FeSO4.7H20,0.5g/L EDTA,0.0OlgZnSO4.7Η20，0.003g MnCl2.4Η20，0.03g H3BO4,0.02g CoCl2.7Η20，0.0Olg CuCl2.2H20,
0.002g NiCl2.6H20，0.003g Na2MoO4.2H20, 1000mL 蒸馏水
(2)菌株的筛选
挑取分离所得到的单菌落，分别接种于三乙胺浓度为400mg/L、以三乙胺为唯一碳源和氮源的无机盐液体培养基中，摇床培养56 h ;测定培养基中三乙胺浓度变化，如果培养基中三乙胺浓度显著降低，即可表明三乙胺发生了降解。在分离得到的单菌落中，命名为T12的菌株降解性能最为优异，因此选取该菌株作后续的鉴定。
[0022]⑶菌株的鉴定
对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该菌的种属。
[0023]-X形态、生化特征:T12菌落呈白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润。该菌株细胞呈短杆状，表面光滑，长度约2.5-3.6 um。T12为革兰氏阴性菌。好氧，最适降解pH范围为
7.0-8.0，最适生长温度为30-35°C。图1中为T12的扫描电镜照片。
[0024]f分子生物学鉴定:以T12菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，T12的16S rDNA基因序列见图6所示的序列表。将菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库(GenBank登陆号为KF019186)，与GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，?\2与Thaurea sp.PIV-1、Thaurea sp.Sgz-1和TXaareasp.R-25071等菌株的同源性最高,序列相似度高达99%以上。
[0025]根据T12的形态学、生化测试以及分子生物学分析，T12鉴定为索氏菌{Th蕭册sp.),命名为 ijhaurea sp.) T12。
[0026](4)菌株对三乙胺的降解及在三乙胺废水处理中的应用
将三乙胺降解菌株T12接种至添加已灭菌的LB培养基中，30°C条件下以150转/分的转速摇床培养，进行T12的富集培养，待菌体进入对数生长期后期(约48h)，将所得菌体用5000Xg的转速离心分离10分钟，撇去上清液，采用涡旋震荡的方法将菌体重新悬浮于无菌液体MSM，离心。重复洗涤过程三次后，将菌体重新悬浮于无菌液体MSM无机盐培养基中(调节加入的MSM量，控制菌悬浮液OD6tltl约为0.5)，得到种子液。
[0027]配制加入300mg/L三乙胺的液体MSM作为模拟废水，将上述种子液加入模拟三乙胺废水中，30°C条件下以150转/分的转速摇床培养，观测降解过程中废水中三乙胺浓度、氨氮浓度以及细菌生长情况，实验结果如图2所示。由图2可知，300mg/L三乙胺可于40h内几乎完全降解；伴随着三乙胺的降解，细菌生物量显著增长，三乙胺降解过程中，三乙胺结构中的氮以氨氮的形式释放出来，最终浓度达到35.41mg/L,是理论氨氮释放值的85.9%,
本实施例说明分离得到的sp.) T12可以利用三乙胺为唯一碳源和氮源进行生长繁殖，并可实现三乙胺的矿化。
[0028]实施例2:废水中三乙胺浓度对三乙胺降解性能的影响
配制MSM无机盐液体培养中含三乙胺浓度分别为50、75、100、200、300、400和500 mg/L的溶液作为模拟废水，将(Saarea sp.) T12种子液以4%的接种量接入模拟废水。由图mOJhaurea sp.) T12可实现三乙胺浓度高达400mg/L的模拟废水中三乙胺的完全降解。在三乙胺浓度分别为50、75、100、200、300和400 mg/L时，分别在16h、20h、28h、36h、40h和56h内实现模拟废水中三乙胺的完全去除。伴随三乙胺的降解，细菌浓度同步增长。由于三乙胺的毒性和难降解特性，在高浓度条件下，尽管可以实现三乙胺的完全降解，其降解速率显著下降。
[0029]本实施例说明虽然sp.) T12可实现高浓度三乙胺的完全降解,但处理效率有待改进。
[0030]实施例3:废水pH值对三乙胺降解性能的影响
配制MSM无机盐液体培养中三乙胺浓度为300mg/L，初始pH为5.0,6.0,6.5,7.0,7.5、
`8.0和9.0的溶液作为模拟废水，将{Thaurea sp.) T12种子液以4%的接种量接入模拟废水。由图4所示，在初始pH为7.0-8.0的条件下，{Thaurea sp.) T12可实现三乙胺的高效率降解；在初始pH为9.0-10.0的条件下，三乙胺的降解比较缓慢，而在pH为5.0-6.0的条件下，三乙胺降解更为缓慢，延迟期较长。
[0031]本实施例说明sp.) T12的降解三乙胺的最佳pH值条件为中性至弱碱性；在PH为7.0-8.0的范围内，三乙胺降解速率相对较高；较高或较低pH条件则不利于三乙胺的降解。
[0032]实施例4:废水中易降解碳源的存在对三乙胺降解性能的影响
配制MSM无机盐液体培养中含三乙胺浓度为300mg/L，外加乙酸钠浓度分别为200、500和1000mg/L的溶液为模拟废水，将(Jhmrea sp.) T12种子液以4%的接种量接入模拟废水。由图5所示，200mg/L葡萄糖的加入有助于提升三乙胺的降解速率；500mg/L、1000mg/L乙酸钠的加入则延缓了三乙胺的降解，且随着外加乙酸钠浓度的增高，延缓作用加剧。
[0033]本实施例说明低浓度的易降解碳源的存在有利于{Thaurea sp.) T12的生长，从而促进了三乙胺的降解过程；高浓度的易降解碳源的存在消耗了氧气和营养元素，对三乙胺的降解产生竞争性抑制。
【权利要求】
1.一株可降解三乙胺的索氏菌，其特征在于它于2013年10月17日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2013477，命名为索氏菌T12，其分类命名为iThaurea sp.)，GenBank登陆号为 KF019186。
2.根据权利要求1所述的可降解三乙胺的索氏菌，其特征在于所述的索氏菌菌落特征为:呈白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，该菌株细胞呈短杆状，表面光滑，长度为2.5-3.6um，革兰氏阴性。
3.一株可降解三乙胺的索氏菌的选育方法，其特征在于包括以下步骤: (1)菌株的驯化:取10mL长期用来处理三乙胺的污泥水与200 mL MSM无机盐液体培养基混合，放入500 mL锥形瓶中，150转/分转速、30°C摇床培养6h，过滤弃去沉淀，将滤液按接种量5%转接到含100 mg/L三乙胺的MSM无机盐液体培养基中，150转/分转速、30°C培养48h后，重复该过程直至三乙胺基本去除，然后再以7d为一个驯化周期，三乙胺按IOOmg/L浓度差递增，驯化4个周期后得到菌悬液； (2)菌株的分离:将所得的菌悬液用无菌水按10倍逐级稀释到IO6-1O9倍，涂布于以三乙胺为唯一碳氮源的MSM无机盐固体培养基上,放入培养箱中30°C倒置培养,随时观察菌株的生长情况，72h后挑取单菌落，在含400 mg/L三乙胺的MSM无机盐固体培养基中进行划线分离纯化，重复数次，得到单菌落，并进行斜面保存； (3)菌株的筛选:挑取分离所得到的单菌落，分别接种于含400mg/L三乙胺的MSM无机盐液体培养基中，摇床培养56 h，测定培养基中三乙胺浓度变化，并选取培养基中三乙胺浓度显著降低的单菌落。
4.如权利要求3所述的可降解三乙胺的索氏菌的选育方法，其特征在于所述的MSM无机盐培养基组分组成如 下:0.76g KH2PO4,3.06g Na2HPO4.12Η20、0.05g CaCl2,0.2gMgSO4.7H20、IOmL微量元素溶液YK-1、1000mL蒸馏水，其中微量元素溶液YK-1为:0.2g/L FeSO4.7Η20、0.5g/L EDTA、0.0Olg ZnSO4.7Η20、0.003g MnCl2.4Η20、0.03g Η3Β04、0.02gCoCl2.7Η20、0.0Olg CuCl2.2Η20、0.002g NiCl2.6Η20、0.003g Na2MoO4.2Η20、1000mL 蒸馏水。
5.一种利用权利要求1所述的可降解三乙胺的索氏菌在三乙胺废水治理中的应用。
6.如权利要求5所述的可降解三乙胺的索氏菌在三乙胺废水治理中的应用，其特征在于将索氏菌Τ12制备成种子液，用于三乙胺的废水处理中，废水pH值为7-8，废水中三乙胺浓度不大于400mg/L。
【文档编号】C12N1/20GK103602619SQ201310594079
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】张晋华, 于昆, 张春艳, 朱晓萌 申请人:南京理工大学