专利名称：一种阿维菌素菌种选育方法
技术领域：
本发明属于生物发酵医药技术领域，特别是涉及一种阿维菌素菌种选育方法。
背景技术：
阿维菌素是由阿佛曼链霉菌生产的一组由十六元大环内酯与一个二齐墩果糖所构成的一类杀虫抗生素，其在防治农业病虫害和畜牧业寄生虫病中有独特效果，已在我国大量使用，并是我国出口的第二大杀虫剂品种。目前，在我国阿维菌素菌种育种中，其性能的优劣由摇瓶培养发酵液生产抗生素效价的高低来判定。现有技术中阿维菌素筛选自然选育流程如下选择出发株、制备分离平 板培养基、制备单孢子悬浮液、涂布分离培养、挑单菌落接斜面、摇瓶初筛(摇瓶培养、HPLC法检测)、初筛留种、接复筛斜面、摇瓶复筛(摇瓶培养、HPLC法检测)、复筛留种、性状考察和高产菌种复筛留种。上述方法存在着流程繁琐、选育周期长、工作量大、需要专用设备(恒温振荡器)、能耗大、成本高、筛选效率低等缺陷。因此，在实际生产中，本着“初筛以量为主、复筛以质为主”的筛选原则，尽可能地放大初筛数量，使初筛的手段尽可能地快速、简单；但现行工艺从单菌落培养到菌种性能的初筛检测还是需35天左右，缓慢又繁琐；并且，在此期间菌种培养恒温室、摇瓶培养恒温振荡器均处于在线使用状态，设备及功能间的利用率低、菌选耗时长，对于阿维菌素菌种选育工作来说，筛选工作依然处于低效率状态。因此，提供一种快速初筛方法对于阿维菌素的生产来说具有非常重要的意义。抑菌圈测定抗生素效价方法是传统的快速初筛测定法。其原理是待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制试验菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对试验菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成试验菌不能生长的抑菌圈。方法是将待检测菌种的单菌落琼脂块移至含有试验菌(多采用短小芽孢杆菌)的琼脂块培养基上，在适宜温湿度下培养一段时间后取出，用游标卡尺来分别测定各抑菌圈的直径，直径大小反映了琼脂块产抗生素能力的大小，以此判断、择优选取。由于阿维菌素没有抑菌活性，其自身不能分泌抑制试验菌生长的物质或分泌某种对试验菌有毒的物质，当其转入含试验菌的培养基上就会被试验菌所抑制甚至杀灭，所以阿维菌素菌选过程中效价的检测不能采用抑菌圈法。
发明内容
本发明目的在于提供一种有效缩短阿维菌素菌种选育周期，提高筛选效率，降低筛选成本的菌种选育方法。本发明采用琼脂块培养初筛流程选育法，过程为生产菌种斜面培养，制备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，同时进行挑取单菌落点种于固体培养基平板上及挑单菌落进行斜面培养，待点种菌落培养成熟后，用HPLC法检测产素能力作为初筛效价，挑取与初筛效价高的斜面菌落摇瓶复筛，复筛摇瓶效价HPLC法检测，高产菌株复筛留种，高产菌株性能考察，最终留种。上述工艺具体来说为挑选生产使用的阿维菌素斜面一瓶，制备成单孢子悬浮液，梯度稀释后按一定体积注入分离培养基中，涂步均匀，按照菌种工艺培养至5 7天(菌落成型、表面有孢子分泌)，用灭菌牙签选取各型单菌落(菌落形态要有记录)点种于点种优化培养基上，点种培养平皿倒置于恒温培养室培养10 12天，培养温度28± 1°C ;分离平皿倒置于恒温培养室继续培养2天左右，认真观察菌落的生长变化。待分离培养基上单菌落生长成熟，挑取单菌落制备斜面；待点种培养基上单菌落生长成熟，用接种铲铲下单菌落、用适宜溶剂提取后经HPLC做初筛检测；待斜面生长成熟，铲下并用适宜溶剂提取后经HPLC做初筛检测。在试验过程中认真观察各阶段菌株的生长情况、统计HPLC检测结果、分析各数据统计表之间的相关性，得到以下发明效果本发明可以有效缩短阿维菌素的选育周期、提高筛选效率、节约筛选成本；琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。本发明的效果与传统的阿维菌素摇瓶初筛选育方法相比，本发明可以将筛选周期缩短近半个月，并且琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。
具体实施方式
I、仪器与材料I. I 仪器漩涡混合器、台式低速离心机、安捷伦高效液相色谱仪。I. 2 材料:出发菌株(挑选生产使用菌株阿佛曼链霉菌Streptomyces avermitilis,),分离(斜面)培养基、点种培养基、种子摇瓶培养基、发酵摇瓶培养基；丙酮(分析纯)、甲醇(分析纯)、无水甲醇(色谱纯)，有机滤膜。I. 2. I 培养基I. 2. I. I分离(斜面)培养基(g / L):可溶性淀粉10、(NH4)2S042. 5,NaCLO. 6,MgSO4. 7H201. 2,K2HPO4. 3H203. 0、CaC033.0、琼脂粉20;PH7. 2 7. 4，用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。I. 2. I. 2 点种培养基(g / L)1#---可溶性淀粉 10、(NH4)2S042. 5,NaCLO. 6、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203.0、CaC033. 0、琼脂粉 20;PH7. 2 7. 4，用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。2#玉米淀粉70、黄豆饼粉8. O、花生饼粉10、酵母粉5. O、酵母膏4. 0、CaC033.0、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、琼脂粉 20;PH7. O 7. 2，用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。3#玉米淀粉70、黄豆饼粉8. O、花生饼粉10、酵母粉5. O、酵母膏3. O、玉米浆 2. 2、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、琼脂粉 20;PH7. O 7. 2，用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。4#玉米淀粉25、黄豆饼粉8. O、花生饼粉10、酵母粉5. O、酵母膏5. O、玉米浆 4. 0、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、琼脂粉 20;
PH7. O 7. 2，用蒸馏水配制，121°C灭菌30min。I. 2. I. 3摇瓶种子培养基(g / L):玉米淀粉25、黄豆饼粉8. O、花生饼粉10、酵母粉5. O、酵母膏5. O、玉米浆4. O、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025 ；PH7. O 7. 2，用自来水配制，121°C灭菌30min。I. 2. I. 4摇瓶发酵培养基(g / L):玉米淀粉70、黄豆饼粉8. O、花生饼粉10、酵母粉5. O、酵母膏3. O、玉米浆2. 2、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025 ；PH7. O 7. 2，用自来水配制，121°C灭菌30min。
2、方法2. I培养方法2. I. I分离平皿的制备挑选大生产使用的生长饱满的工作细胞库斜面，加入15ml无菌水，用接种环刮取孢子，将其悬浮在无菌水中，制成混合均匀的孢子悬浮液。用灭菌的滤纸进行过滤，收集过滤孢子液，并进行10-1 10-6梯度稀释，取10-5、10-6稀释液O. I O. 15ml注入于分离培养基平板上，用三角耙耙匀，倒置于恒温培养室28±1°C培养7 9天。2. I. 2点种平皿的制备取培养至第5 7天的上述分离平板，用肉眼筛选出饱满、均匀、分泌孢子量大、形态规整或经验型产抗能力差的单菌落，在背面标记序号；并在点种培养基背面标记相应的序号(I个分离单菌落对应2个点种菌落序号；分别用3-1、3-2标示)，用灭菌过的牙签轻轻点种于相应序号位置标记处的点种培养基上，点种培养平皿倒置于恒温培养室28± 1°C培养10 12天；分离平皿倒置于恒温培养室28± 1°C继续培养2天左右，认真观察菌落的生长变化。2. I. 3斜面制备用点种肉眼筛选方法选取优质单菌落和点种后带序号的单菌落，用接种环挑取单菌落接种于斜面培养基上，倒置于恒温培养室28土 1°C培养7 9天。2. I. 4种子摇瓶将培养好的斜面菌种用接种铲铲取I. 0cm*I. Ocm接种于种子摇瓶培养基中，28±l°C、220r / min振荡培养25 30hr，观察其菌丝生长情况。2. I. 5发酵摇瓶将培养成熟的种子液按10%的接种量转接于发酵摇瓶中，28±l°C、220r / min振荡培养10天。2. 2 初筛:2.2.1液体摇瓶复筛取2. I. 5培养好的发酵液IOml于离心管中，3000r / min离心IOmin,弃去上清液。加入丙酮IOml,在镟润混合器上振荡提取5min,静置IOmin,再经3000r / min离心IOmin,得萃取液，经O. 45u有机滤膜过滤，准确吸取5. Oul样品滤液进样，利用自动高效液相色谱仪检测菌株的生产能力。2. 2. 2琼脂块培养初筛
分别将2块2. I. 2培养好的、同序号点种单菌落铲下置于同一离心管中，加IOml分析纯甲醇，在镟润混合器上充分振荡3min提取，4000r / min离心lOmin、静置IOmin后，经O. 45u有机滤膜过滤，准确吸取5. Oul样品滤液进样，利用自动高效液相色谱仪检测菌株的生产能力。3、结果与分析3. I 结果3.1.1点种培养基优化试验结果见表I点种培养基设计见I. 2. I. 2。点种菌落生长情况如下表I
权利要求
1.一种阿维菌素菌种选育方法，其特征在于采用琼脂块培养法。
2.按照权利要求I所述的阿维菌素菌种选育方法，其具体步骤为生产菌种斜面培养，制备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，同时进行挑取单菌落点种于固体培养基平板上及挑单菌落进行斜面培养，待点种菌落培养成熟后，用HPLC法检测产素能力作为初筛效价，挑取与初筛效价高的斜面菌落摇瓶复筛，复筛摇瓶效价HPLC法检测，高产菌株复筛留种，闻广菌株性能考察，最终留种。
3.按照权利要求2所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于上述挑取单菌点种于固体培养基平板上时每个单菌落点种两块。
4.按照权利要求2所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于上述单菌落点种和单菌落斜面培养是在在28土 1°C条件下培养7 9天。
5.按照权利要求2所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于上述涂布分离培养是在28±1°C条件下培养10 12天。
6.按照权利要求2所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于上述HPLC法检测产素能力是指点种固体培养基平板培养结束后，将源于同一单菌落的两块琼脂块取下置于同一离心管中，加适量甲醇，充分震荡混合，转速4000rpm离心lOmin、静置后，经O. 45um有机滤膜过滤，收集过滤液，用HPLC法测定单菌落的产素能力。
7.按照权利要求1、2、3、4或5所述的阿维菌素菌种选育方法，其特征在于用于分离培养、点种培养和斜面培养所用的培养基为琼脂块固体培养基。
全文摘要
本发明涉及一种阿维菌素菌种选育方法，采用琼脂块培养法进行初筛，即生产菌种斜面培养，制备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，同时进行挑取单菌落点种于固体培养基平板上及挑单菌落进行斜面培养，待点种菌落培养成熟后，用HPLC法检测产素能力作为初筛效价，挑取与初筛效价高的斜面菌落摇瓶复筛，复筛摇瓶效价HPLC法检测，高产菌株复筛留种，高产菌株性能考察，最终留种。本发明可以有效缩短阿维菌素的选育周期、提高筛选效率、节约筛选成本。与传统的阿维菌素摇瓶初筛选育方法相比，本发明可以将筛选周期缩短近半个月，并且琼脂块培养初筛法得到的菌种性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。
文档编号C12N1/20GK102839143SQ20121036061
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者李学兵, 崔莉, 张燕玉 申请人:宁夏启元药业有限公司