专利名称：一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification, NASBA)技术的肠道病原体快速检测技术。具体涉及星状实时NASBA等温扩增快速检测试剂盒；还涉及所述试剂盒中使用的对于星状病毒基因组具有特异性的引物对和分子信标探针。
背景技术：
星状病毒(Astrovirus, AstV)于1975年由Appleton和Higgins使用电镜检测急性胃肠炎患儿粪便标本时被首次发现，因病毒颗粒在电镜下呈现5、6个角的特征外观，状如星形而由Madeley和Cosgrove命名为星状病毒。星状病毒是一种分布很广泛的，导致婴幼儿、老年人、免疫功能低下或缺失者急性腹泻的重要病原之一。星状病毒既可引起散发和·医源性感染，也能形成暴发，有研究发现它亦是成人腹泻的重要病原。星状病毒基因组是单股正链RNA，长度约为6. 8 kb，基因组从5’端到3’端顺序包括一个约85个核苷酸的5’非编码区(5，non-coding region, NCR),三个开放读码框架(open reading frames, ORFs)ORFIa,ORFlb和0RF2，一个约80个核苷酸的3’非编码区和一个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。病毒基因组的3’末端具有高度保守的核酸序列(主要包括3’非编码区)。ORFIa和ORFIb编码非结构蛋白=ORFIa编码一个丝氨酸蛋白酶；0RFIb编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA — dependent RNA polymerase, RDRP)。0RF2编码结构蛋白为衣壳蛋白前体。尽管与星状病毒感染有关的死亡病例十分罕见，但印度曾有过相关报道。大量研究已表明星状病毒已成为婴幼儿病毒性腹泻的第2或第3位重要病原。所以检测该病毒的感染情况对于疾病控制和临床诊断均具有重要意义。因此，一套简便快速、特异性强的星状病毒检测方法，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。目前，针对星状病毒的检测，经典的方法有电镜观察、细胞分离培养、核酸杂交、酶联免疫等。电镜观察不但敏感度低、而且价格昂贵、设备和技术条件要求甚高，无法应用于临床常规检测和大规模的流行病学调查；核酸杂交及酶联免疫检测因技术本身的限制，其灵敏度均比较低，漏检率高。随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合，基于核酸扩增的技术发展迅速，日新月异。如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是一种检测RNA类病毒的简便、准确的常规技术。但是，基于PCR的技术是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，且灵敏度仍有待提高。之后，无需电泳分析的实时荧光RT-PCR成为更快捷的一种核酸扩增和RNA病毒检测技术。该技术利用荧光探针实现对靶核酸的特异性检测，利用荧光信号的积累实现实时监测PCR扩增反应的全过程从而能实时分析检测结果。由于实时荧光RT-PCR仍需要有反转录步骤和变性、退火及延伸等三个温度点进行几十次升降温循环，每个温度点和时间也需精确设定，整个反应仍需耗时2 2. 5小时以上。近年来，一种新型的核酸扩增技术一等温扩增技术实现在恒温条件下的检测。如DNA环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA,LAMP)应用的比较广泛，也有相关专利申请，但LAMP技术需要使用4条引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，虽然提高了特异性，但针对变异大的病毒核酸分子在设计上非常困难。核酸序列依赖性扩增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)技术是另一种快速等温扩增技术，它克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA病毒的检测。与PCR不同，NASBA是在AMV反转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶等三种酶的共同协作下，在41 42°C，由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促过程。其中一条引物其5’端具有被T7 RNA聚合酶识别的启动子序列。在NASBA基础上结合分子信标(molecular beacon)探针可以建立实时NASBA (Real-time NASBA)等温扩增技术。该技术具有以下优点(1)等温扩增反应在同一恒温体系条件下进行；(2)快速高效、灵敏度高实时NASBA反应是一种无需升降温的连续快速扩增，也不需RT-PCR反应中第一阶段15 30分钟的反转录过程，整个反应时间短、单链RNA产物积累迅速，可以在 60 90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增IO9倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA。例如目前针对A型禽流感病毒所有亚型研发的NASBA/ECL检测试剂盒，其正式发表的实验数据显示，NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感10 1000倍，比常规PCR方法也敏感许多；(3)特异性高、实时检测反应不需高温变性，即使有双链DNA污染也不会被扩增，而通过分子信标探针的检测进一步提高了特异性和灵敏度，也实现了实时检测和结果分析；(4)设计简单它只需设计I对引物和I条探针来识别靶RNA的3个不同区域，对于检测变异度高的病毒核酸来说，设计上相对LAMP技术更为容易。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于实时NASBA(Real-time NASBA)技术的对星状病毒具有特异性检测作用的引物；本发明还提供了一种基于实时NASBA (Real-time NASBA)技术的对星状病毒基因组具有特异性检测作用的分子信标探针；此外本发明还提供了一种利用上述引物对和分子信标探针基于实时核酸序列依赖性扩增(Real-time NASBA)技术检测星状病毒的检测试剂盒。本发明一种星状病毒检测用引物所采用的技术方案是，本发明包括正向引物Fl和反向引物Rl，所述正向引物Fl和所述反向引物Rl的碱基序列表示如下
正向引物 FI : 5 ’ -TCARTCTWMTCARCGTGTCCGTA-3，；
反向引物Rl
5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGAGDATRCACGCCTCRATYTC-3’。所述反向引物Rl的5’端的25个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端23个碱基是与星状病毒0RF2互补的特异性序列，所述正向引物Fl和所述反向引物Rl的3’端的病毒核酸变异位点使用简并碱基。本发明一种星状病毒检测用分子信标探针所采用的技术方案是，所述分子信标探针的喊基序列表不如下
分子信标探针Pl
5，-HEX-CCAAGCAACTCAGGAAACARGGTGTCGCTTGG-DABCYL-3，，
所述分子信标探针Pl在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL，病毒核酸变异位点使用简并碱基。
本发明一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒所采用的技术方案是，所述试剂盒至少包括2 X实时NASBA反应液和5 X酶混合液，所述2 X实时NASBA反应液包含有如上所述的正向引物Fl和反向引物Rl以及分子信标探针P1。所述2 X实时NASBA反应液包括如表I所示的组分
表I 2 X实时NASBA反应液
权利要求
1.一种星状病毒检测用引物，其特征在于，包括正向引物Fl和反向引物R1，所述正向引物Fl和所述反向引物Rl的碱基序列表示如下 正向引物 FI : 5 ’ -TCARTCTWMTCARCGTGTCCGTA-3，； 反向引物Rl 5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGAGDATRCACGCCTCRATYTC-3’。
2.根据权利要求I所述的一种星状病毒检测用引物，其特征在于所述反向引物Rl的5’端的25个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端23个碱基是与星状病毒0RF2互补的特异性序列，所述正向引物Fl和所述反向引物Rl的3’端的病毒核酸变异位点使用简 并喊基。
3.—条星状病毒检测用分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列表示如下 分子信标探针Pl 5，-HEX-CCAAGCAACTCAGGAAACARGGTGTCGCTTGG-DABCYL-3，， 所述分子信标探针Pl在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。
4.根据权利要求3所述的一条星状病毒检测用分子信标探针，其特征在于所述分子信标探针Pl的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的20个碱基是与星状病毒0RF2反义链互补的特异性序列，其中病毒核酸变异位点使用简并碱基。
5.一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒至少包括2X实时NASBA反应液和5 X酶混合液，所述2 X实时NASBA反应液包含有如权利要求I所述的正向引物Fl和反向引物Rl以及如权利要求3所述的分子信标探针P1。
6.根据权利要求5所述的一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述2X实时NASBA反应液包括如下组分
7.根据权利要求5所述的一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述5X酶混合液包括如下组分
8.根据权利要求5所述的一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。
9.根据权利要求8所述的一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为星状病毒体外转录的基因片段。
10.根据权利要求8所述的一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。
全文摘要
本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)技术的肠道病原体快速检测技术，具体提供了一种星状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其一对引物和一条分子信标探针；所述试剂盒包括含有上述引物和探针的2×实时NASBA反应液、5×酶混合液及阳性对照模板、阴性对照和空白对照;所述引物和探针序列是序列编号为SEQIDNO1～3所示的序列，能特异性扩增和检测星状病毒ORF2基因片段。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，可应用于临床和口岸的常规检测和疾病防控领域。
文档编号C12N15/11GK102965453SQ20121036034
公开日2013年3月13日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者莫秋华, 谭华, 李卫岗, 杨泽, 刘志明, 林继灿, 杜田 申请人:珠海国际旅行卫生保健中心