专利名称：一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株的制作方法
技术领域：
一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明涉及ー种高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，该菌株生长速度快、产量高，对于花生四烯酸的エ业化
生产有着重要意义。
背景技术：
花生四烯酸系统名为全顺式Λ-5，8，11，14-二十碳四烯酸，属于η-6系列的多不饱和脂肪酸，是该系列多不饱和脂肪酸的代谢枢纽。作为人体中含量最多、分布最广的多不饱和脂肪酸，花生四烯酸具有显著的生理药理作用。研究表明花生四烯酸在促进脑部发育、降血脂、抗炎和抗脂质氧化等方面具有很好的生物活性。基于花生四烯酸的这些重要作用，它已经广泛应用于食品、医药等方面。近年来又有人指出花生四烯酸的代谢产物在预防、治疗肿瘤方面也具有广泛的应用前景。花生四烯酸广泛的存在于动物、微生物 中。目前花生四烯酸的主要来源包括深海鱼油、动物组织等，但是其含量低、提取成本高严重阻碍了花生四烯酸的エ业化生产。利用发酵法生产花生四烯酸具有含量高、周期短、提取容易的优点，受到国内外学者的青睐。据文献报道1979年Lizuka (((Production ofarachidonic acid by a hydrocarbon-utilizing strain of Penicillium cyaneumJi,Applied Microbiology and Biotechnology, 1979, 2 (7)，173-180)最先利用應cyaneu进行了微生物发酵生产花生四烯酸的研究。后经研究发现显微藻类、部分细菌、酵母菌和藻状菌纲中的耳霉属iConidiobolus \被孢霉属iMortierella)，毛霉属iMucor)，根霉属iRhizopus \枝霉属(Masporangium)等都能发酵生产花生四烯酸,尤其以高山被孢霉研究最多(《微生物发酵生产花生四烯酸的研究进展》，中国油脂，2004，9 (29)，7-40)。丝状真菌高山被孢霉菌丝体内富含花生四烯酸等多不饱和脂肪酸，其花生四烯酸含量高、提纯方便，被公认为是生产花生四烯酸的优良菌株。
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花生四烯酸结构式
专利CN101113410A介绍了ー种高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株及其应用。专利JP2008113671、专利US5658767A、沈以凌(《高山被孢霉发酵生产花生四烯酸条件的研究》，食品科技，2OO9, 2 (34)，35_38)和 Totani(《The filamentous fungus Mor ti erellaalpina,high in arachidonic acid)), Lipids, 1987, 22,1060 - 1062)等也报道了利用高山被抱
霉发酵产生花生四烯酸的研究。但在已有的报道中，由于受菌种优劣、发酵条件、提取方式等因素的影响，花生四烯酸的产量良莠不齐，发酵周期也不尽相同。1997年chen(《Optimization of ArachidonicAcid ProauctionDy Mortierella alpina^u]i-H4 Isolate》， Journal of the AmericanOil Chemists’ Society, 1997，5 (74)，569-578)等经低温筛选得到一株花生四烯酸产生Ialpina 辟，摇瓶发酵5天后其花生四烯酸产量达到3. 9g/L。专利CN101113410A，提供了一株高山被孢霉歷其通过摇瓶发酵6. 5天后，花生四烯酸产量提高到IOg/L0 Jin 等(《A novel two-step fermentation process for improved arachidonic acidproduction by Mortierella alpinaj), Biotechnol Lett, 2008, 30 (6), 1087 - 1091)利用菌株I alpina 采用こ醇胁迫及两步发酵法生产花生四烯酸，经5L发酵罐发酵7天后，花生四烯酸产量可达19. 8g/L。
本发明从江苏省无锡市惠山树林的土壌中筛选得到了性状稳定、发酵周期短、30°C下可高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株(iforiiereBaJN168。具有很好的エ业应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，得到了性状稳定，产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，可通过固态或液态发酵生产花生四烯酸。本发明的技术方案一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，命名为高山被孢霉(Mortierella alpina) JN168,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO M2012073。其 18S rDNA 序列为 SEQ ID N0:1。该菌株主要代谢产物为花生四烯酸。该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。于江苏省无锡市惠山树林，选取落叶覆盖较密的土地，去除表层土，用取样铲垂直铲取10厘米深处土壤装入取样盒。称取Ig左右土样于50mL离心管中加入9mL去离子水溶解，取ImL溶解液加入到装有9mL去离子水的离心管中，依次类推制成10' 10_2，10_3，10_4各种梯度的菌悬液，取10_2，IO-3, IO-4三个梯度进行平板涂布，放置在30°C的生化培养箱中倒置培养。分离用培养基为:马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂20g、水1000mL、青霉素20mg，pH自然。30°C恒温。待单菌落长出后，挑取单菌落用苏丹黑B染色，脂肪颗粒被染成蓝紫色，挑选脂肪颗粒多且染色较深的菌株进行摇瓶复筛。收获摇瓶培养的菌丝体抽滤，冷冻干燥至恒重，研磨菌丝体，用索式提取法提取油脂，对提得的油脂进行MS-GS联用分析脂肪酸组成。反复采用以上的方法，经过多次筛选得到花生四烯酸高产菌株#alpinaJN168。本发明涉及到的菌种有如下特征し高山被抱霉紛ァびぽ^ムalpina JN168培养条件
该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。培养用的氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。该菌株的生长温度范围为50C -35°C，花生四烯酸最佳积累温度为30°C，菌株在pH为2-9范围内能生长且代谢产花生四烯酸，花生四烯酸最佳积累PH为6. 5。在菌种的培养过程中添加醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸镁、磷酸ニ氢钾等无机盐对花生四烯酸的产量有促进作用。2、高山被抱霉alpina JNl68的形态描述
平板培养形态alpina JN168培养2天后,平板上出现质地较薄的白色菌落，菌落呈圆形。5天之后菌落开始层层扩展，形成类似花瓣状的形态。菌落正面白色，背面浅黄色。在含有Triphenyltetrazolium chloride (氯化三苯基四氮唑,TTC)的平板上，菌落呈现红色。用苏丹黑B染色后，在显微镜下可见菌丝体内蓝紫色脂肪颗粒。
3、高山被孢霉iforiiereBa alpina JN168的18S rDNA分子生物学特征见序列表。4、可采用常规的液态发酵方法，利用上述菌种生产花生四烯酸。培养基可用含不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情況，这些营养物存在于上述的天然营养源中。该菌株在液态发酵过程中24小时后开始产花生四烯酸，80小时后花生四烯酸产量达到最大值。本发明的有益效果=JforiiereBa alpina JN168的主要代谢产物为花生四烯酸，菌丝内花生四烯酸含量达50%以上，副产物更少。花生四烯酸最佳积累温度为30°C，与其它菌种相比有着较高的发酵温度，因此发酵时间缩短为80小吋，发酵过程更易控制。培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情況，这些营养物存在于上述的天然营养源中。该菌株液态发酵产花生四烯酸的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉。用该培养基在30°C下花生四烯酸的产量可达13. Og/L。该菌株液态发酵过程中，24小时后开始产生花生四烯酸，80小时后花生四烯酸产量达到最大。生物材料样品保藏高山被孢霉(iforiiereBa a7/ i/ a)JN168,已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCCJii :中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M2012073,保藏日期为2012年03月10日。
具体实施例方式实施例I
高山被孢霉脂肪酸组成分析
发酵菌株为高山被孢霉Ioriierdh alpina JN168，采用液态发酵，采用标准PDA培养基。发酵温度30°C，7天后发酵结束。抽滤收集菌丝体，冷冻干燥至恒重，用研钵将菌丝体磨碎。取O. Ig左右烘干的菌丝体，加入到有盖的试管中。向其中加入O. 4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液5mL，在50°C水浴中保持lh，再向其中加入5mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在50°C水浴中保持lh，加入5mL正己烷抽提，最后加入2mL饱和氯化钠溶液水洗，移取上层溶液采用GC-MS联用检測。分析结果如表I所示。结果表明该菌产生的油脂中以花生四烯酸为主。色谱条件Finnigan Trace MS (美国)气相色谱-质谱仪。采用DB-MAX毛细管柱(30mX0. 25_X0. 25Mm)。起始柱温 180°C，保持 lmin，以 5°C /min 升高到 230°C，保持8min。进样ロ温度260°C，载气为氦气，流速为O. 8mL/min，分流比为10 I。质谱检测条件EI+ (70Ev)，发射电流200μΑ，离子源温度350°C，接ロ温度260°C。表I脂肪酸组成
权利要求
1.一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，其分类命名为高山被孢霉(Mortierellaalpina)m^,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M2012073。
2.根据权利要求I所述的高山被孢霉菌株，其18SrDNA序列为SEQ ID NO :1。
3.根据权利要求I所述的高山被孢霉菌株，其特征在于能代谢产生花生四烯酸。
4.根据权利要求I所述的高山被孢霉菌株，其特征在于可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。
5.根据权利要求I所述的高山被孢霉菌株，其特征在于可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。
全文摘要
一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明菌株分类命名为高山被孢霉(Mortierellaalpina)JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNOM2012073。该菌株由通过对江苏省无锡市惠山树林中的土壤进行分离筛选，得到了性状稳定，高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，可通过发酵法生产花生四烯酸。
文档编号C12N1/14GK102827780SQ20121036013
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者蔡宇杰, 丁彦蕊, 周立树, 金大勇, 朱建航, 廖祥儒, 张大兵, 李枝玲, 罗军侠 申请人:江南大学