一种添加紫球藻提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法
【技术领域】
[0001]
[0002]本发明涉及的是高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的工艺方法，特别是一种添加紫球藻提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法。
[0003]技术背景
[0004]花生四稀酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸，英文缩写为ARA(Arachidonic acid),又名AA，在体内发挥多重作用。首先，它是体内多种循环二十烷酸衍生物的前体，如前列腺素、前列腺环素、血栓烷素和白细胞三烯等；第二，花生四烯酸可促进神经及大脑发育，又因婴幼儿体内部分酶功能未完善，自身合成花生四烯酸能力较低，需补充外源花生四烯酸以促进神经及智力发育；第三，花生四烯酸作为结构成分与磷脂相结合；另外，花生四烯酸还具有提高视觉敏锐度、增强血管弹性、降低血液黏稠度等多种生理功能。
[0005]花生四烯酸除动物组织提取外，工业上主要由两类生物获取，一是被孢霉类发酵生产，如高山被抱霉(Mortierella alpina)、深黄被抱霉(Mortierella isabellina)、长被孢霉(Mortierella elongata)等；二是通过海洋微藻培养所得，如紫球藻(Porphyridium)、缺刻缘绿藻(Porphyridium incisa)，但此方法目前应用并不广泛，仅处于实验及试生产阶段。
[0006]作为一种高效新型的营养强化剂，卫生部在1994年正式批准，可在婴幼儿配方食品中添加花生四烯酸，并于1999年正式批准花生四烯酸作为新型营养强化剂。目前，花生四烯酸已经被世界卫生组织等国际权威机构推荐，作为营养补充添加到婴儿配方奶粉中。当前，国内外花生四烯酸产业继续呈现规模化扩大的趋势。
[0007]目前，国内外提高花生四烯酸产量水平主要是通过对高山被孢霉进行诱变育种，改善发酵工艺，利用基因工程手段改变关键酶基因等，或通过控制紫球藻培养条件来提高其不饱和脂肪酸及花生四烯酸的含量。例如“一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法”(ZL201210056137.X)就是改善菌种培养条件，促进提高花生四烯酸油脂含量的方法；“高山被孢霉突变株及其应用”(201310578616.2)就是采用生物突变技术提高高山被孢霉花生四烯酸油脂含量的方法。它们都存在操作不便，性能不稳定，不利于工业化生产。
[0008]然而却未发现现有公布将两种高产PUFAS的紫球藻与高山被孢霉相结合来提高花生四烯酸产量，此方法以高山被孢霉发酵为主体，以紫球藻残渣的加入为辅助手段，明显提升了花生四烯酸的发酵产量，降低了生产成本。
【发明内容】
[0009]
[0010]本发明的目的在于提供一种添加紫球藻提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法。
[0011]本发明包括以下步骤: 1)紫球藻培养
将紫球藻菌种接入装有含淡水的培养皿中，在低盐弱光条件下，10 - 15°C培养3 —6d后，将所得紫球藻及培养液经80目筛子进行筛滤并用蒸馏水清洗三次，用真空泵进行抽滤，真空干燥24-48h，研磨成粉末状备用；
2)高山被孢霉摇瓶种子培养
无菌条件下，取适量高山被孢霉孢子或菌丝涂布于PDA培养基中，置于26-30°C培养5-8d，刮取适量孢子至含有摇瓶种子培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% — 60%条件下摇床培养36h-48h，摇床转速为180-250rmp/min ；
所述PDA培养基原料为葡萄糖15-25g/L，马铃薯100_200g/L，琼脂粉10_20g/L，K2PO4
0.2-0.6 g/L，MgSO4 0.1-0.3 g/L，pH 7.0-7.5 ；
所述种子培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5 ；
3)摇瓶发酵培养
将高山被孢霉种子液按5%-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% - 60%条件下摇床培养8-14天，摇床转速为180-250rmp/min ;在发酵O — 10天内一次性添加紫球藻粉末10-60g/L，pH 7.0-7.5，发酵结束后收集菌体，经处理采用油脂提取方法得花生四烯酸；
所述发酵培养基为葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0012]经索式提取法和气相检测法测定，使用本发明所阐述的方法生产所得花生四烯酸的产量相对没有添加紫球藻藻残渣的花生四烯酸产量提高至少35%。
[0013]本发明的优点是:
1.明显提高了花生四烯酸产量；
2.操作简单，较易实现；
3.减少环境污染。
【附图说明】
[0014]
[0015]图1为实施例1中在高山被孢霉发酵起始加入紫球藻残渣对最后发酵结束时生物量(g/L)、细胞油脂百分含量(%)、花生四烯酸在总油中的含量(%)的影响柱状图。
[0016]图2为实施例1中在高山被孢霉发酵起始加入紫球藻残渣对最后发酵结束时细胞总油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影响柱状图。
[0017]图3为实施例2中在高山被孢霉发酵5d加入紫球藻残渣对最后发酵结束时生物量(g/L)、细胞油脂百分含量(%)、花生四烯酸在总油中的含量(%)的影响柱状图。
[0018]图4为实施例2中在高山被孢霉发酵5d加入紫球藻残渣对最后发酵结束时细胞油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影响柱状图。
[0019]图5为实施例3中在高山被孢霉发酵1d加入紫球藻残渣对最后发酵结束时生物量(g/L)、细胞油脂百分含量(%)、花生四烯酸在总油中的含量(%)的影响柱状图。
[0020]图6为实施例3中在高山被孢霉发酵1d加入紫球藻残渣对最后发酵结束时细胞油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影响柱状图。
[0021]图7为在高山被孢霉发酵不同时间加入45 g/L紫球藻残渣对最后发酵结束时细胞油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影响折线图。
【具体实施方式】
[0022]
[0023]下面通过实施例对本发明做详细说明。
[0024]实施例1
O紫球藻残渣制备:将紫球藻菌种接入装有含淡水的培养皿中，在低盐弱光条件下，10 - 15°C培养3 — 6d后，将所得紫球藻及培养液经80目筛子进行筛滤并用蒸馏水清洗三次，用真空泵进行抽滤，真空干燥24-48h，研磨成粉末状备用。
[0025]2)摇瓶种子培养:无菌条件下，取适量高山被孢霉孢子或菌丝涂布于PDA培养基中，置于26-30°C培养6-12d，然后刮取适量孢子至含有摇瓶种子培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% - 60%条件下摇床培养36_48h，摇床转速为180_250rmp ；
所述PDA培养基原料为葡萄糖15-25g/L，马铃薯100_200g/L，琼脂粉10_20g/L，K2PO4
0.2-0.6 g/L，MgSO4 0.1-0.3 g/L，pH 7.0-7.5 ；
所述种子培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0_7.5。
[0026]3)摇瓶发酵培养将种子液按5%_10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，25-300C，湿度30% - 60%条件下摇床培养8_14d，摇床转速为180_250rmp ;在发酵起始对不同发酵瓶分别一次性添加紫球藻菌澄30 g/L、45 g/L和60 g/L，另有未添加紫球藻残澄做对照组，pH 7.0-7.5，每组实验平行发酵瓶为3个，发酵结束后得未分离花生四烯酸油脂发酵产物；所述发酵培养基为葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0027]至发酵结束时发酵液中细胞油脂百分含量及花生四烯酸产量分别通过索式提取法和气相检测法测定计算分别达到31.80%，3.95g/L ；33.60%，4.61 g/L ；33.40%，4.35g/L,对