照组为31.20%, 3.79g/L (参见图1，图2)。
[0028]发酵后菌体的细胞油脂含量、花生四烯酸在总油中的含量测定方法 I)发酵菌渣制备:
摇瓶发酵结束后，发酵液用布氏漏斗进行抽虑，剪布氏漏斗口径大小的滤纸铺在漏斗里面，将发酵液倒入漏斗进行抽虑，滤纸下面垫上一层同等大小的纱布较好；抽干的菌体会形成菌饼，从滤纸上撕下来，用手或工具将其撕成小碎块，放入烘箱105°C两个小时，烘干，计算干重W。将烘干的菌体放入研钵进行研磨，磨成细小的颗粒状发酵菌渣。
[0029]2)索氏提取:
称取上述研磨的颗粒(粉末)l_2g，取精确值W0，用滤纸包住，系上棉绳，放入烘箱105°C烘至恒重(大约半小时)，称滤纸包重量Wl ;将烘后的滤纸包放入索氏提取器内，用石油醚进行索氏提取，8-10小时后取出，105°C烘干(大约半小时)，称纸包重量W2。油脂％=(W1-W2) / W0*100%
3)气相检测:
对样品进行甲酯化处理，称取研磨发酵菌渣0.1g左右，加入0.5%氢氧化钾甲醇溶液Iml，60 °C水浴30分钟，每五分钟摇匀一次，加入三氟化硼甲醇溶液Iml，60 °C水浴30分钟，每五分钟摇匀一次，取出后，加入2ml正己烷，混匀后加入Iml饱和氯化钠，反应完毕。4000r/min离心五分钟，取上层进行气相检测。
[0030]气相色谱条件，DB-23ms(3(X0mX(X25_X(X25ym)石英毛细管色谱柱柱；柱温程序:90 °C保持Imin,以9 °C / min升至240 °C，保持5min ;载气:氮气；流速:约2.0mL / min ;进样口温度:250°C ;进样模式:分流进样(分流比1:10);进样量:lyL;检测器温度:280°C。
[0031]实施例2
I)紫球渣残渣制备同实施例1。
[0032]2)摇瓶种子培养方法同实施例1。
[0033]3)摇瓶发酵培养:将种子液按5%_10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% - 60%条件下摇床培养8_14d，摇床转速为180_250rmp ;在发酵5d时对不同发酵瓶分别一次性添加紫球藻菌渣30 g/L,45 g/L和60 g/L，另有未添加紫球藻残渣做对照组，PH 7.0-7.5，每组实验平行发酵瓶为3个，发酵结束后得未分离花生四烯酸油脂发酵产物；
所述发酵培养基为葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0034]至发酵结束时发酵液中细胞油脂百分含量及花生四烯酸产量分别通过索式提取法和气相检测法测定经计算分别达到32.40%，4.68 g /L ；34.30%，5.65g/L ；33.70%，5.38g/L,对照组为31.30%，3.85g/L (参见图3，图4)。
[0035]检测方法同实施例1。
[0036]实施例3
I)紫球藻菌渣制备同实施例1。
[0037]2)摇瓶种子培养方法同实施例1。
[0038]3)摇瓶发酵培养:摇瓶发酵培养将种子液按5%_10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% - 60%条件下摇床培养8_14d，摇床转速为180_250rmp ；在1d时对不同发酵瓶分别一次性添加紫球藻残澄30 g/L、45 g/L和60 g/L，另有未添加紫球藻残渣做对照组，PH 7.0-7.5，每组实验平行发酵瓶为3个，发酵结束后得花生四烯酸油脂发酵产物；
所述发酵培养基为葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0039]至发酵结束时发酵液中细胞油脂百分含量及花生四烯酸产量分别通过索式提取法和气相检测法测定，经计算分别达到29.90%，4.30g/L ；32.40%，5.05g/L ；31.20%，4.80g/L,对照组为31.60%, 3.84g/L (参见图5，图6)。
[0040]检测方法同实施例1。
[0041]通过以上实施例可以看出，在发酵过程的起始、5d和1d分别一次性加入30 g/L、45 g/L和60 g/L的紫球藻残渣，可使细胞油脂含量及花生四烯酸的产量有较大提高。其中，发酵5d时一次性加入45 g/L紫球藻残渣促使花生四烯酸产量达到最高。
[0042]对比例I
I)紫球藻渣制备同实施例1。
[0043]2)摇瓶种子培养方法同实施例1。
[0044]3)摇瓶发酵培养:摇瓶发酵培养将种子液按5%_10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% - 60%条件下摇床培养8_14d，摇床转速为180_250rmp，pH 7.0-7.5，；在发酵起始、5d、1d时对不同发酵瓶分别一次性添加紫球藻残渣45 g/L，另有未添加紫球藻残渣的对照组。发酵结束后得未分离花生四烯酸油脂发酵产物；
所述发酵培养基为葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0045]在发酵不同时间添加45g/L的紫球藻残渣测得的细胞油脂百分含量和花生四烯酸产量分别达到 33.40%，4.58g/L ；34.20%, 5.63g/L ；32.60%, 5.12g/L，对照组为 29.80%，
3.92g/L (参见图 7)。
[0046]通过对比例和实施例可以看出，添加紫球藻残渣所得花生四烯酸产量比未添加的花生四烯酸产量提高35%以上。
【主权项】
1.一种添加紫球藻提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将紫球藻于淡水中培养，抽滤，真空干燥24-48h，研磨成粉末状； (2)高山被孢霉摇瓶种子培养 无菌条件下，取适量高山被孢霉孢子或菌丝涂布于PDA培养基中，置于26-30°C培养5-8d，刮取适量孢子至含有摇瓶种子培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% — 60%条件下摇床培养36h-48h，摇床转速为180-250rmp/min ； 所述PDA培养基原料为葡萄糖15-25g/L，马铃薯100_200g/L，琼脂粉10_20g/L，K2PO40.2-0.6 g/L，MgSO4 0.1-0.3 g/L，pH 7.0-7.5 ； 所述种子培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5 ； (3)摇瓶发酵培养 将高山被孢霉种子液按5%-10%的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，25-30°C，湿度30% - 60%条件下摇床培养8-14天，摇床转速为180-250rmp/min ;在发酵O — 10天内一次性添加紫球藻粉末10-60g/L，pH 7.0-7.5，发酵结束后收集菌体，经处理采用油脂提取方法得花生四烯酸。
2.根据权利要求1所述的一种添加紫球藻提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法，其特征在于步骤(3)中，所述紫球藻菌渣的最佳添加量为30-60g/L，最佳加入时间为5-6天。
【专利摘要】本发明公开了一种添加紫球藻提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法，它是一种向发酵培养基中添加紫球藻残渣提高花生四烯酸产量的方法。将高山被孢霉（Mortierella alpina）于培养基丰富的PDA平板培养后，取孢子接入种子培养三角瓶培养36h-48h，将种子液5%-10%接入发酵培养基中进行发酵继续培养，在发酵培养过程中添加经过处理的紫球藻菌渣，经实验证明，此方法可明显提高高山被孢霉产花生四烯酸产量，具有操作简单、降低发酵成本、减少污染处理和等优势，易于在工业化中应用。
【IPC分类】C12R1-645, C12P7-64
【公开号】CN104805139
【申请号】CN201510123157
【发明人】孙立洁, 凌瑞, 陈祥松, 袁丽霞, 王纪, 姚建铭, 吴金勇
【申请人】湖北产业技术创新与育成中心, 嘉必优生物工程（武汉）有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年3月20日