专利名称：地顶孢霉及分离培养方法和发酵工艺方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌及培养方法，确切地说是一种中国新记录虫草菌种地顶孢霉(Acremonium terricola、CGMCC0346)及分离培养方法和发酵工艺方法。
在21世纪的可持续发展战略中，生物多样性的合理开发利用对支持社会经济发展极为重要。目前，生物多样性的保护受到空前重视，世界各国投入了大量的人力物力，致力于生物多样性的研究和保护工作。在生物多样性的研究和利用中，微生物的生物多样性在目前尚研究得不够，但却又非常重要的研究领域。其中，真菌的物种多样性又更是“重”中之“重”。因为，真菌是很多制药工业、食品工业的“原料库”、“基因库”。近年来，美、英、日等发达国家有远见的药物学家和制药公司都已将注意力从放线菌等转移到真菌上来，其中“虫草”又因其独有的药理价值，更引人“瞩目”。
虫草类资源开发，不仅有重要的社会价值，而且有可观的经济效益。由于不同的虫草含有不同的生物活性物质，且药理作用不同，因而一种新虫草菌种的发现，往往意味着一种新的生物产品的产生。
本发明的目的在于提供一种具有食品、药品开发用途的中国新记录微生物纯培养物——地顶孢霉及其分离培养方法和发酵工艺方法。
所述发明目的是通过下述方案实现的。
CGMCC0346是从采自安徽祁门牯牛降自然保护区的古尼虫草小孢变种[Cordyceps gunnii var.minor]的内菌核被感染的昆虫虫体上分离出的一株产生孢梗束的丝孢菌，在中国属首次发现。
1、CGMCC0346为中国新记录种，其特征在于A、在MA培养基上，CGMCC0346的培养形态为25℃培养10天，菌落圆形，直径13～21mm，白色，中部粉状，边缘绒状，有时形成孢梗束，背面淡黄棕色；B、在察氏培养基上，CGMCC0346的培养形态为25℃培养10天，菌落园形，直径21～22mm，形成孢梗束，白色，边缘淡红色，背面奶油色至赭黄色。其显微形态为菌丝无色，光滑、具隔膜，宽1.5μm；瓶梗直接从菌丝上长出，锥形，多单生，10.8～19.8×1.8～2.9μm；分生孢子无色、光滑，形成干燥的链，长纺锤形，两端尖，3.6～5.8×0.9～1.4μm，长径比(L/D)3～3.5。
上述的CGMCC0346，其特征在于所述的MA培养基为麦芽汁30g，琼脂15g，水1000ml。
上述的CGMCC0346，其特征在于上述的察氏培养基为NaNO32g，K2HPO32g，KCL 0.5g，MgSO44g，FeSO40.01g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml。
2、一种分离培养CGMCC0346的方法，其特征在于2.1、在超净工作台中，在无菌条件下，用无菌水将长有虫草子座的新鲜虫尸冲洗三次；2.2、用无菌手术刀片将长有虫草子座的新鲜虫尸小心切开，在此操作过程中不要碰破昆虫背血管；2.3、从切开部位内，取出小米粒大小的虫尸块，接种于灭菌的SDAY培养基平皿上；2.4、将接种后的培养基平皿置于18℃光照培养箱的自然光下培养14～16天；2.5、待长出菌落后，用接种针取少量菌丝转接于另一SDAY培养基平皿中；2.6、将转接后的培养基平皿置于18℃光照培养箱的自然光下培养，直至长出单一纯化的菌落；2.7、将纯化的菌种点植于灭菌的、直径为9cm、每皿具有15ml MA培养基液的平皿上，25℃培养10天；或将纯化的菌种点植于灭菌的、具有察氏培养基液的平皿上，25℃培养10天。
一种分离培养CGMCC0346的方法，其特征在于所述的SDAY培养基，为葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，琼脂20g，水1000ml。
一种分离培养CGMCC0346的方法，其特征在于所述的MA培养基为芽汁30g，琼脂15g，水1000ml。
一种分离培养CGMCC0346的方法，其特征在于所述的察氏培养基为NaNO32g，K2HPO32g，KCL 0.5g，MgSO44g，FeSO40.01g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml。
3、一种地顶孢霉的发酵工艺方法，其特征在于3.1、将纯化的菌种接种于SDAY培养基斜面，24～26℃下培养7天，待产生大量的孢梗束后，即可作为液体摇瓶菌种；
3.2、将上述二支斜面菌种接种到一只内装液体培养基200ml的500ml三角瓶内，接种量5～10％，在24～26℃下，置于旋转式摇床上150～160r/m振荡培养24～26小时，即得到一级种子罐的液体种子；3.3、在50升塔板式发酵罐内加入液体培养基30升，并加入0.03％消泡剂泡敌，在14.71×104Pa压力下，保压30分钟，消毒冷却后，在24～26℃将摇瓶种子接入培养，通气量1∶0.5，并在4.903～7.0845×104Pa下保压，并经48～60小时通气培养。
一种CGMCC0346的发酵工艺方法，其特征在于所述的SDAY培养基为葡萄糖40g，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml。
一种CGMCC0346的发酵工艺方法，其特征在于所述的液体培养基为白砂糖1.5％，蚕蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水95％，且PH6.0-7.0。
一种CGMCC0346的发酵工艺方法，其特征在于发酵罐内的液体培养基为白砂糖2.0％，蚕蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水94.5％。
本发明的菌种已按专利法实施细则第二十五条的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期1998年4月22日，保藏号CGMCC0346，并附具存活性报告书。
该菌种已用于工业发酵生产。利用该菌种生产的菌丝体胶囊，经江苏省卫生防疫站所作的功能测定，具有明显的免疫功能(细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞吞噬功能)，符合保健食品的免疫功能学评价标准。经安徽医科大学临床药理研究所测定，其菌丝体亦有抗风湿作用。由其发酵液中提取的胞外多糖，经安徽医科大学临床药理研究所测定，有明显的抗肝炎作用。在用果蝇所作的抗衰老试验中，能明显延长果蝇寿命，表现出极好的抗衰老作用。有开发为保健食品和药品的可能性。
下面对本发明作进一步地说明。
该菌由Miller于1957年首次分离自土壤，并将其归于Fusidium属中，定名为Fusidium terricola Miller，Giddens Foster。1967年Onions等将其改名为Paecilomyces terricola(Miller et al.)Onions Barron。1971年Gams将之转属到顶孢霉属(Acremonium)中，并定名为Acremonium terricola(Miller et al.)Gams。
Miller于1957年发表新种时的原始描述为在MA培养基上25℃培养10天，菌落直径12～22mm，正面粉状，白色，背面黄褐色。菌丝聚集为孢梗束，菌丝无色，瓶梗多数单生，纤细，锥形，12～20～(25)×1.2～2.0μm，顶部0.5～1.0μm，分生孢子形成干燥的长链，无色，光滑，长纺锤形，两端尖，3.8～5.4～(6.0)×0.9～1.5μm，L/D 2.8～5.0。
本次发现的CGMCC0346属中国新记录种。菌种的鉴定及新记录种的确定，主要根据其培养特性和显微形态参考有关分类文献确定。
该中国新记录种CGMCC0346的培养特性将纯化的菌种点植于灭菌(1.5Kg/cm230分钟)的MA培养基平皿上，25℃培养10天；菌落圆形，直径13～21mm，白色，中部粉状，边缘绒状，有时形成孢梗束，背面淡黄棕色。所述的MA培养基为麦芽汁30g、琼脂15g、水1000ml，所述的平皿为直径9cm的培养皿，每皿15ml培养基。将纯化的菌种点植于灭菌的察氏培养基上，25℃培养10天菌落圆形，直径21～22mm，形成孢梗束，白色，边缘淡红色，背面奶油色至赭黄色。菌丝无色，光滑、具隔膜，宽1.5μm。瓶梗直接从菌丝上长出，锥形，多单生，10.8～19.8×1.8～2.9μm。分生孢子无色、光滑，形成干燥的链，长纺锤形，两端尖，3.6～5.8×0.9～1.4μm，长径比(L/D)3～3.5。
CGMCC0346的分离培养条件为在超净工作台中，用无菌手术刀片将用无菌水冲洗三次的长有虫草子座的新鲜虫尸小心切开，在此操作过程中注意不要碰破昆虫背血管，取出小米粒大小的虫尸块，接种于灭菌(1.5Kg/cm30分钟)的SDAY培养基平皿上，置于18℃光照培养箱(自然光下)培养15天，待长出菌落后用接种针挑取少量菌丝转接于另一平皿中(SDAY培养基)同上法培养，直至长出单一纯化的菌落为止。所述的SDAY培养基为葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，琼脂20g，水1000ml；所述的平皿为直径9cm，每皿15ml培养基。
CGMCC0346的发酵工艺方法分为三步，一是一级斜面菌种培养；二是液体种子培养；三是发酵罐培养。下面分步进行说明1、一级斜面菌种培养将保藏菌种接种于SDAY培养基斜面，24～26℃下培养7天，待产生大量孢梗束后，即可作为液体摇瓶菌种。所述的SDAY培养基为葡萄糖40g，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml。
2、液体种子培养用二支斜面菌种接一只内装液体培养基200ml的500ml三角瓶，接种量5～10％，24～26℃下，置于旋转式摇床(160r/m)上振荡培养24～36小时，即可作为一级种子罐的液体种子。所述的液体培养基为白砂糖1.5％，蚕蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水95％；其pH值为6.0～7.0。
3、发酵罐培养50升塔板式发酵罐，以培养30升液体菌种计算，在发酵罐内加入白砂糖2.％，蚕蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，接着加入水95.5％，水温大于等于95℃，并加入消泡剂泡敌如聚氧乙烯氧丙烯甘油，用量为0.03％，搅拌均匀。在14.71×104Pa压力下，保压30min，消毒冷却至24～26℃，将摇瓶种子接入培养，通气量1∶0.5，在4.903～7.0845×104Pa下保压，经48～60小时通气培养，菌丝大量生长并开始产孢即可放罐。
权利要求
1.地顶孢霉(Acremonium terricola、CGMCC0346)，为中国新记录种，其特征在于A、在MA培养基上，CGMCC0346的显微形态为菌落圆形，直径13～21mm，白色，中部粉状，边缘绒状，有时形成孢梗束，背面淡黄棕色；B、在察氏培养基上，CGMCC0346的显微形态为直径21～22mm，形成孢梗束，白色，边缘淡红色，背面奶油色至赭黄色；菌丝无色，光滑、具隔膜，宽1.5μm；瓶梗直接从菌丝上长出，锥形，多单生，10.8～19.8×1.8～2.9μm；分生孢子无色、光滑，形成干燥的链，长纺锤形，两端尖，3.6～5.8×0.9～1.4μm，长径比(L/D)3～3.5。
2.一种分离培养地顶孢霉的方法，其特征在于2.1、在超净工作台中，在无菌条件下，用无菌水将长有虫草子座的新鲜虫尸冲洗三次；2.2、用无菌手术刀片将长有虫草子座的新鲜虫尸小心切开，在此操作过程中不要碰破昆虫背血管；2.3、从切开部位内，取出小米粒大小的虫尸块，接种于灭菌的SDAY培养基平皿上；2.4、将接种后的培养基平皿置于18℃光照培养箱的自然光下培养14～16天；2.5、待长出菌落后，用接种针取少量菌丝转接于另一SDAY培养基平皿中；2.6、将转接后的培养基平皿置于18℃光照培养箱的自然光下培养，直至长出单一纯化的菌落；2.7、将纯化的菌种点植于灭菌的、直径为9cm、每皿具有15ml MA培养基的平皿上，25℃培养10天；或将纯化的菌种点植于灭菌的、具有察氏培养基的平皿上，25℃培养10天。
3.根据权利要求2所述的一种分离培养地顶孢霉的方法，其特征在于所述的SDAY培养基为葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，琼脂20g，水1000ml。
4.根据权利要求2所述的一种分离培养地顶孢霉的方法，其特征在于所述的MA培养基为麦芽汁30g、琼脂15g、水1000ml。
5.根据权利要求2所述的一种分离培养地顶孢霉的方法，其特征在于所述的察氏培养基为NaNO32g，K2HPO32g，KCL 0.5g，MgSO44g，FeSO40.01g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000ml。
6.一种地顶孢霉的发酵工艺方法，其特征在于6.1、将纯化的菌种接种于SDAY培养基斜面，在24～26℃下培养7天，待产生大量的孢梗束后，即可作为液体摇瓶菌种；6.2、将上述二支斜面菌种接种到一只内装液体培养基200ml的500ml三角瓶内，接种量5～10％，在24～26℃下，置于旋转式摇床上150～160r/m振荡培养24～26小时，即得到一级种子罐的液体种子；6.3、在50升塔板式发酵罐内加入液体培养基30升，并加入0.03％消泡剂泡敌， 在14.71×104Pa压力下，保压30分钟，消毒冷却后，在24～26℃将摇瓶种子接入培养，通气量1∶0.5，并在4.903～7.0845×104Pa下保压，并经48～60小时通气培养。
7.根据权利要求6所述的一种地顶孢霉的发酵工艺方法，其特征在于所述的SDAY培养基为葡萄糖40g，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml。
8.根据权利要求6所述的一种地顶孢霉的发酵工艺方法，其特征在于所述三角瓶内的液体培养基为白砂糖1.5％，蚕蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水95％，且pH值6.0-7.0。
9.根据权利要求6所述的一种地顶孢霉的发酵工艺方法，其特征在于发酵罐内的液体培养基为白砂糖2.0％，蚕蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水94.5％。
全文摘要
本发明涉及一种真菌及分离培养方法和发酵工艺方法,确切地说是一种中国新记录种——地顶孢霉及分离培养方法和发酵工艺方法。其特征在于:在MA培养基上,25℃培养10天即得,在察氏培养基上,25℃培养10天,也可得到;其分离培养方法的特征在于:从虫草子座的新鲜虫尸上取出虫尸块,接种于SDAY培养基上,在18℃光照培养箱中培养,待长出菌落后再进行转接,直至长出单一纯化的菌落;其发酵工艺方法为三级扩大培养,一是一级斜面菌种培养,二是液体种子培养,三是发酵罐培养。该发明在食品和药品的开发利用方面有广阔前景。
文档编号A61P1/16GK1259570SQ9911452
公开日2000年7月12日 申请日期1999年10月27日 优先权日1999年10月27日
发明者樊美珍, 李春如 申请人:樊美珍, 李春如