一种利用微生物共发酵c5和c6生产乙醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用微生物共发酵C5和C6生产乙醇 的方法。
【背景技术】
[0002] 诸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源特别是生物燃料受 到越来越多的关注，并带来巨大的商机和社会意义。
[0003] 根据际能源署（IEA)的相关定义，常规生物燃料包括糖基和淀粉基乙醇、油料作物 基生物柴油、可直接利用的植物油以及通过厌氧消化制得的沼气；先进生物燃料技术指还 处于研发、中试或示范阶段的转化技术，通常称为第二代技术或第三代技术。这一类别包括 用动物脂肪和植物油炼制的加氢植物油（HV0)，以及用含木质纤维素生物质生产的生物燃 料，比如乙醇、费托液和合成天然气。
[0004] 乙醇是清洁的可再生液体燃料，许多国家已经开始使用添加了一定比例乙醇的汽 油一汽油醇，以代替汽油的消耗。这种新型燃料既能缓解石油的消耗速率，又可以减少汽车 尾气污染，具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起开始推广使用汽油醇，目前汽油 醇占汽油类燃料总消耗量的约20%，并处于逐年增长的势头。
[0005] 目前国内外生产乙醇所使用的主要原料是玉米等粮食作物。随着世界人口的不断 增长，粮食日益短缺，因此从长远来看，粮食作物不是生产乙醇的理想原料。同时，每年有大 量的农林业废弃木质纤维材料(如玉米秸杆等）用焚烧等的方式不当处理，不仅造成了原料 的浪费，而且污染了环境。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，在农业废弃木 质纤维材料中三者的含量大约是：纤维素占30~40%，半纤维素占20~30%，木质素占10~ 25%。其中葡萄糖是纤维素的主要组成单元，木糖是半纤维素的主要组成单元。在植物纤维 材料水解液中木糖占30%左右，是继葡萄糖之后自然界最丰富的糖分，因而利用葡萄糖木 糖共发酵生产乙醇原材料丰富，具有广阔的市场前景。
[0006] -般而言，用含木质纤维素的生物质进行生物燃料的生产属于先进生物燃料技术 范畴。利用含木质纤维素原料生产乙醇通常采用生物化学转化的工艺，包括预处理、水解、 发酵和回收等步骤。经过预处理，增加了酶和纤维素材料的可接近性，从而提高原材料的可 利用性；水解(包括酶解）以后，半纤维素主要分解为C5糖，而纤维素主要分解为C6糖。由 于半纤维素的无定型结构，其更容易被水解为C5糖。在预处理阶段和酶解阶段，会得部分 发酵抑制物，例如甲酸、乙酸、糠醛等。
[0007] 但是，相应面临的困境是，自然界中能高效产醇的微生物通常只能利用葡萄糖等 六碳糖生产乙醇，不能利用木糖；而少数能利用木糖产醇的微生物，产醇能力低下，这限制 了对自然界中木质纤维素的有效利用。通过代谢工程对微生物进行改造，并利用其代谢转 化C5糖主要经过以下反应：木糖还原酶依赖NADPH将木糖还原为木糖醇，木糖醇再在木糖 醇脱氢酶作用下转化为木酮糖；再经木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，然后进入磷酸 戊糖途径（PPP)。PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成 丙酮酸，丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶脱羧还原为乙醇。
[0008] 在基因工程技术的推动下，研究人员获得了一批可以利用木糖代谢生产乙醇的重 组发酵微生物。然而，在实际的工业化生产中，尤其是大规模产业化阶段，生产中转化率过 低，成为限制这一技术发展的难点之一。
【发明内容】
[0009] 因此，本发明的目的在于克服现有技术中微生物共发酵C5糖和C6糖产乙醇过程 中对发酵供给的差异性消耗需求，并导致实际生产中转化率过低的缺陷，从而提供一种能 够高效利用微生物共发酵C5糖和C6糖生产乙醇的发酵工艺。
[0010] 为此,本发明提供一种利用微生物共发酵C5和C6生产乙醇的方法，包括如下步 骤：
[0011] 1)、将所述微生物扩大培养，得到扩大培养液；
[0012] 2)、将所述扩大培养液按5-20%接种至发酵培养基中，控制反应温度25_38°C、 pH5. 0-7. 0进行发酵生产，控制所述发酵生产过程中进行间歇式供氧，通气量0. 01-0. 5mL/ L/min，通气时间为0. 5h，间隔时间为5-6h，得到发酵液；
[0013] 3)、分离所述发酵液获得乙醇。
[0014] 所述步骤2)中，控制发酵过程中空气通气量为0. 1-0. 2mL/L/min，通气时间0. 5h， 间隔时间为5-6h。
[0015] 所述扩大培养是指将培养所述微生物得到的种子液接种至扩大培养基中，通过至 少一级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，在所述扩大培养步骤中，通过调节扩 大培养过程中的供氧浓度实现对所述微生物的扩大培养。
[0016] 前述发酵步骤中，所述间歇式供氧方式，即为每通气0. 5h后停止通气5_6h。
[0017] 所述通气量单位mL/L/min，是指单位时间内单位体积发酵液通入的空气体积，即 每分钟内每升发酵液中通入的空气体积（mL量)。
[0018] 使用一级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
[0019] 将所述种子液按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐中， 控制温度 25-35°C、ρΗ4-6· 5、转速 180-220rpm、通气量 0· 08-0. 5L/L/min，扩大培养 6-12h ; 随后调整转速40-100rpm、通气量0. 18-0. 5L/L/min，扩大培养至所述微生物浓度达到 0· 1-0. 5X109f/mL。
[0020] 使用二级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
[0021] 1)将所述种子液按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐 中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速180-220rpm、通气量0. 08-0. 5L/L/min，进行扩大培养 至所述微生物浓度达到0. 2-0. 3 X IO9个/mL ;
[0022] 2)将步骤1)中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培 养基的二级扩培罐中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速40-100rpm、通气量0. 18-0. 5L/L/ min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0. 1-0. 5) X IO9个/mL。
[0023] 使用三级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
[0024] 1)将所述种子液按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐 中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速180-220rpm、通气量0. 08-0. 5L/L/min，进行扩大培养 至所述微生物浓度达到0. l-o. 5 X IO9个/mL ;
[0025] 2)将步骤1)中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培 养基的二级扩培罐中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速40-100rpm、通气量0. 18-0. 5L/L/ min，进行扩大培养至所述微生物浓度达到0. 1-0. 5 X IO9个/mL ;
[0026] 3)将步骤2)中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养 基的三级扩培罐中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速40-60rpm、通气量0. 01-0. 2L/L/min， 进行扩大培养至所述微生物浓度达到（0. 2-0. 3) X IO9个/mL。
[0027] 使用四级的扩大培养步骤对所述微生物进行扩大培养，包括如下步骤：
[0028] 1)将所述种子液按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养基的一级扩培罐 中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速180-220rpm、通气量0. 08-0. 5L/L/min，进行扩大培养 至所述微生物浓度达到0. 1-0. 5 X IO9个/mL ;
[0029] 2)将步骤1)中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养 基的二级扩培罐中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速40-60rpm、通气量0. 18-0. 5L/L/min， 进行扩大培养至所述微生物浓度达到0. 1-0. 5 X IO9个/mL ;
[0030] 3)将步骤2)中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养 基的三级扩培罐中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速40-60rpm、通气量0. 01-0. 2L/L/min， 进行扩大培养至所述微生物浓度达到0. 1-0. 5 X IO9个/mL ;
[0031] 4)将步骤3)中得到的扩培微生物按照5-20%的接种量接种至含有所述扩大培养 基的四级扩培罐中，控制温度25-35°C、pH4-6. 5、转速40-60rpm、通气量0. 0005-0. 02L/L/ min，进行扩大培养12-24h。
[0032] 前述扩大培养步骤中，所述通气量单位L/L/min，是指单位时间内单位体积发酵液 通入的空气体积，即每分钟内每升发酵液中通入的空气体积（L)。
[0033] 所述各级扩大培养过程中，一级扩培罐为50L扩培罐，二级扩培罐为500L扩培罐， 三级扩培罐为5立方扩培罐，四级扩培罐为50立方扩培罐。
[0034] 所述各级扩大培养的过程中，所述扩大培养基彼此独立的含有玉米糖化醪、糖蜜、 葡萄糖、甜高粱茎杆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种做为碳源；含有黄豆饼粉、 玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏中的一种或几种做为氮源；并且选择性的含有尿素、无机 盐、氨基酸、微量元素和/或抑制剂。
[0035] 所述扩大培养能够为后续发酵生产乙醇步骤提供足够多的微生物数量，其中扩大 培养基是微生物获得生存的营养来源，对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影 响。
[0036] 所述扩大培养基选择性的包括蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎杆汁 或木质纤维素原料酶解液。
[0037] 作为一种优选，所述扩大培养基为蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎杆 汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且所述扩大培养基中葡萄糖的含量按重量 百分比含量为2-10%，优选含量为4-6%。
[0038] 作为另一种优选，所述扩大培养基中含有4%重量百分比葡萄糖的培养基，或者含 重量百分比为4%葡萄糖的玉米糖化醪或糖蜜。
[0039] 作为另外一种优选方案，所述扩大培养基还可以是按重量百分比稀释浓度为 10-75%的木质纤维素原料酶解液，其中所述木质纤维原料酶解液未被稀释时按重量百分比 含有葡萄糖1-12%、木糖1-7% ;优选的，葡萄糖含量为5-10%，木糖含量优选为3-6% ;更优选 的，葡萄糖含量为6-9%，木糖含量为3-5%。优选的，所述木质纤维素原料酶解液作为所述扩 大培养基时，其按重量百分比稀释浓度为20-30%。