专利名称：家蚕去细胞血淋巴液的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及细胞培养及细胞培养用液的制备，具体是一种家蚕去细胞血淋巴液的制备方法。
背景技术：
血清是体外培养中使用最广泛的天然培养基，血清中含有的生长因子可促进细胞的繁殖，其中附着因子可促进细胞贴壁，同时也是矿物质、脂类和激素的来源。进行无脊椎动物的细胞原代培养需要在基础培养基中添加某些成分配成完全培养基。添加的成分通常为5% 20%的胎牛血清、水解乳蛋白以及酵母提取物等，目的是配合不同无脊椎动物细胞培养的要求。 但血清的使用一直受到多方面的质疑，主要原因是血清存在多方面的问题
血清中的主要成分诸如白蛋白、转铁蛋白已经知道得很清楚，但是其中含有的大量微
量成分对细胞的生长、分化、增殖也起到一定的刺激作用。这些成分包括营养物质(氨基酸、核苷、糖等)、肽生长因子、激素、无机物、脂类，但它们的含量和具体作用还没有完全确定。血清经常被病毒污染，这是不受操作者控制的未知因素，病毒的主要来源是疯牛病及乳牛中的大量病毒。价格昂贵是血清的最大缺点，血清的价格是培养基化学成分价格的10倍多，但是如果用指定的成分来替换血清，那么这些成分的总价格和血清相当。血清不仅对细胞的生长有促进作用，而且还起到抑制作用。尽管通常情况下，血清的主要作用是激活细胞生长，但血清的总体效应是抑制和激活作用的总和。血清的存在对于纯化物是一个主要的障碍，甚至可能影响产物的药物学效应。特别对于无脊椎动物的细胞培养，由于其营养要求和生存条件与脊椎动物有本质区别，在无脊椎动物细胞的原代培养中套用现有的脊椎动物的培养条件不能满足要求，高等动物的血清在低等动物生存环境中或许起到毒害的作用。因此，急需找到一种既容易获得又适用于无脊椎动物细胞培养的特制“血清”。目前尚无相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕去细胞血淋巴液的制备方法。家蚕的血淋巴液具有丰富的氨基酸及营养物质，在体内是维持组织生长及物质能量代谢的重要物质，用其制备成可用于细胞培养的营养物质，既能提高细胞培养的效率，还能促进家蚕细胞研究的进展。本发明依次通过下列步骤实现
(1)取2-3龄眠期家蚕，置于质量百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液中进行体表消毒5min,再用体积比浓度为75%的乙醇消毒5min,用无菌水冲洗干净后,将家蚕放置在无菌吸水纸上吸干水分；
(2)将家蚕用无菌针头刺破腹足取血，获得家蚕血淋巴液；(3)在获得的家蚕血淋巴液中按10-20g/L加入维生素C;
(4)4°C下以12000g离心20min，取离心后上清液，4°C、PBS缓冲液中透析24小时，然后更换PBS缓冲液，再重复两次；
PBS 缓冲液:0. 01mol/L, pH 值 6. 2，渗透压 320 mOsm/kg
(5)将上清液分别通过0.45 y m、0. 22 y m和0. I y m孔径的一次性针头过滤器过滤除
菌，真空密封包装即得家蚕去细胞血淋巴液。所得家蚕去细胞血淋巴液低温(_20°C)保存及运输，保质期6个月。使用方法如 下
本发明所得家蚕去细胞血淋巴液为体外细胞培养用液，是一种在基础培养基基础上添加的外援活性物质。使用前，4°C条件下缓慢解冻，按照不同比例添加到基础培养基中。适用于昆虫细胞培养。本发明的优点是
本发明以家蚕血淋巴液为材料制备一种应用于昆虫细胞培养的营养物质。通过维生素C抑制血淋巴液中酪氨酸氧化酶的活性，使血淋巴液在与外界接触时不会氧化变黑，其中的主要营养物质成分及含量不会发生变化，也不会影响细胞培养。与血清相比，家蚕血淋巴液更适合昆虫的细胞培养，而且价格低廉。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发明，而不构成对本发明的限定。实施例I
(1)家蚕体表消毒
于无菌操作台内，取2龄眠期健康家蚕200头，置于质量百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液中进行体表消毒5min，再用体积比浓度为75%的乙醇消毒5min，用无菌水将残留的次氯酸钠及乙醇冲洗干净后，将家蚕放置在无菌吸水纸上吸干水分；
(2)家蚕血淋巴液的制备
将家蚕用无菌针头刺破腹足取血，获得家蚕血淋巴液；
(3)抗氧化处理
在获得的家蚕血淋巴液中按10g/L加入维生素C;
(4)去细胞处理
4°C下以12000g离心20min，取离心后上清液，4°C、PBS缓冲液中透析24小时，然后更换PBS缓冲液，再重复两次；
PBS 缓冲液:0. 01mol/L, pH 值 6. 2，渗透压 320 m0sm/kg
(5)除菌处理
将上清液分别通过0. 45 y m、0. 22 y m和0. I y m孔径的一次性针头过滤器过滤除菌；
(6)保存及运输
取步骤(5 )所得去细胞血淋巴液IOOmL,真空密封包装，低温(-20 V )保存及运输，保质期6个月。实施例2(1)家蚕体表消毒
于无菌操作台内，取3龄眠期健康家蚕100头，置于质量百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液中进行体表消毒5min，再用体积比浓度为75%的乙醇消毒5min，用无菌水将残留的次氯酸钠及乙醇冲洗干净后，将家蚕放置在无菌吸水纸上吸干水分；
(2)家蚕血淋巴液的制备
将家蚕用无菌针头刺破腹足取血，获得家蚕血淋巴液；
(3)抗氧化处理
在获得的家蚕血淋巴液中按20g/L加入维生素C;
(4)去细胞处理
4°C下以12000g离心20min，取离心后上清液，4°C、PBS缓冲液中透析24小时，然后更换PBS缓冲液，再重复两次；
PBS 缓冲液:0. 01mol/L, pH 值 6. 2，渗透压 320 mOsm/kg (5)除菌处理
将上清液分别通过0. 45 y m、0. 22 y m和0. I y m孔径的一次性针头过滤器过滤除菌；
(6)保存及运输
取步骤(5 )所得去细胞血淋巴液IOOmL,真空密封包装，低温(-20 V )保存及运输，保质期6个月。 实施例3
(1)家蚕体表消毒
于无菌操作台内，取2龄眠期健康家蚕400头，置于质量百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液中进行体表消毒5min，再用体积比浓度为75%的乙醇消毒5min，用无菌水将残留的次氯酸钠及乙醇冲洗干净后，将家蚕放置在无菌吸水纸上吸干水分；
(2)家蚕血淋巴液的制备
将家蚕用无菌针头刺破腹足取血，获得家蚕血淋巴液；
(3)抗氧化处理
在获得的家蚕血淋巴液中按15g/L加入维生素C;
(4)去细胞处理
4°C下以12000g离心20min，取离心后上清液，4°C、PBS缓冲液中透析24小时，然后更换PBS缓冲液，再重复两次；
PBS 缓冲液:0. 01mol/L, pH 值 6. 2，渗透压 320 mOsm/kg
(5)除菌处理
将上清液分别通过0. 45 y m、0. 22 y m和0. I y m孔径的一次性针头过滤器过滤除菌；
(6)保存及运输
取步骤(5 )所得去细胞血淋巴液IOOmL,真空密封包装，低温(-20 V )保存及运输，保质期6个月。
权利要求
1 .一种家蚕去细胞血淋巴液的制备方法，其特征在于依次通过下列步骤实现 (1)取2-3龄眠期家蚕，置于质量百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液中进行体表消毒5min,再用体积比浓度为75%的乙醇消毒5min,用无菌水冲洗干净后,将家蚕放置在无菌吸水纸上吸干水分； (2)将家蚕用无菌针头刺破腹足取血，获得家蚕血淋巴液； (3)在获得的家蚕血淋巴液中按10-20g/L加入维生素C; (4)4°C下以12000g离心20min，取离心后上清液，4°C、PBS缓冲液中透析24小时，然后更换PBS缓冲液，再重复两次； PBS 缓冲液:O. Olmol/L, pH 值 6. 2，渗透压 320 mOsm/kg (5)将上清液分别通过O.45 μ m、0. 22 μ m和O. I μ m孔径的一次性针头过滤器过滤除菌，真空密封包装即得家蚕去细胞血淋巴液。
全文摘要
一种家蚕去细胞血淋巴液的制备方法，通过家蚕体表消毒、家蚕血淋巴液的制备、抗氧化处理、去细胞处理、除菌处理等一系列步骤实现。本发明以家蚕血淋巴液为材料制备一种应用于昆虫细胞培养的营养物质。通过维生素C抑制血淋巴液中酪氨酸氧化酶的活性，使血淋巴液在与外界接触时不会氧化变黑，其中的主要营养物质成分及含量不会发生变化，也不会影响细胞培养。与血清相比，家蚕血淋巴液更适合昆虫的细胞培养，而且价格低廉。
文档编号C12N5/07GK102827803SQ201210360170
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者朱勇, 赵诏, 徐水, 周婵, 肖欢 申请人:西南大学