快生型Frankia氏菌菌株的选育方法
【专利摘要】本发明公开了快生型Frankia氏菌菌株的选育方法，包括以下几步：先将沙棘老根瘤消毒，然后再转入到事先制备的诱变培养基中，然后匀浆制成菌悬浮液，其中，所述诱变培养基的磷、硼、镁和水解络蛋白含量较高；在第一步中制备的菌悬浮液中添加诱变剂处理50min，然后再转入20W紫外灯下照射300s；将所述第二步中经过诱变处理的菌悬浮液利用96孔板发酵培养；利用快速生物测定法进行高通量筛选，然后通过3轮复筛，获得突变株，所述突变株比出发菌株的繁殖速度快4～12倍，所述突变株为快生菌。本发明公开的选育方法，是基于诱发突变的原理获得快生型Frankia氏菌，该方法简单易操作，能够将慢生型Frankia氏菌诱变驯化成快生菌，填补了现有技术中难以获得快生型Frankia氏菌的空白。
CGMCC No9769
20141015
【专利说明】快生型Frankia氏菌菌株的选育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种菌株选育方法，具体涉及一种快生型Frankia氏菌菌株的选育方法。
【背景技术】
[0002]分子态氮(N2)在大气同温层中含量占78%，但植物不能利用，需要将它们转化为NH4+或N03_后植物才能吸收利用。地球上将分子态氮(N2)转化为NH4+的生物只有微生物中的3类菌群:自生固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌，它们都属于原核生物；自生固氮菌和联合固氮菌固氮效率很低，共生固氮菌又包括豆科植物根瘤细菌和非豆科植物放线菌Frankia 氏菌。
[0003]Frankia菌的固氮效率最高，占共生固氮总量的80%以上，例如:与桤木共生结瘤固氮量为85-300kgN2/hm2/y，红枝桤木为140-209，秋桤木为40-157，木麻黄为229，沙棘为47-179，马桑为150，而根瘤细菌的固氮量只有13.3kgN2/hm2/y，前者固氮能力高于后者3-10倍以上。所以，研究弗兰克氏共生固氮菌，开发出新型微生物肥料更具有巨大的生态、环保和经济效益。
[0004]但是，近百年来，Frankia菌人工培养未获得成功。直到1978年美国科学家CalIaham第一次从香厥木根瘤中获得Frankia菌,并人工培养成功后，正式给Frankia菌的研究开发开辟了道路。
[0005]然而，近30多年来无数科学家用多种培养基，培养方法，分离培养后才发现，Frankia菌是一类“慢生型”菌群。在人工平板培养基上培养40天左右才能用放大镜看到白色微小的菌落，要想得到几克供研究的菌粉，十分费时、费事、费力、困难很大。因此，目前国内外科学界对Frankia氏菌的研究仍然停留在生态、分类、系统、生理、生化、遗传、质粒、引物探针、分子杂交等理论方面，而应用研究几乎尚属一片空白，更谈不上批量发酵应用于生产了。
[0006]因此，现在需要一种方法，将“慢生型”菌，诱变驯化为“快生菌”。
【发明内容】
[0007]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种能够将慢生型Frankia氏菌诱变驯化成快生菌的选育方法。
[0008]为达到上述目的，本发明的技术方案如下:
快生型Frankia氏菌菌株的选育方法，包括以下几步:
第一步，制备菌悬浮液:先将沙棘老根瘤消毒，然后再转入到事先制备的诱变培养基中，然后匀浆制成菌悬浮液，其中，所述诱变培养基的磷、硼、镁和水解络蛋白含量较高；第二步，诱变处理:在第一步中制备的菌悬浮液中添加诱变剂处理50min，然后再转入20W紫外灯下照射300s ；
第三步，发酵培养:将所述第二步中经过诱变处理的菌悬浮液利用96孔板发酵培养； 第四步，筛选:利用快速生物测定法进行高通量筛选，然后通过3轮复筛，获得突变株，所述突变株比出发菌株的繁殖速度快4?12倍，所述突变株为快生菌。
[0009]优选的，还包括对所述快生菌进行摇床培养筛选，将获得的所述快生菌接种到筛选培养基上，放置在转速140?200rpm/min的摇床上，培养温度为24?30°C，培养10天，所述快生菌菌株繁殖系数又提高了 I?1.5倍，干菌体得率为2.54%。
[0010]优选的，所述筛选培养基成分包括以下几种:磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钙、丙酸盐、水解络蛋白、马铃薯糖化液、微量元素液、维生素、Fe-Na-EDTA盐、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7.2。
[0011]优选的，所述诱变培养基成分包括以下几种:磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钙、硼酸盐、水解络蛋白、蔗糖、微量元素液、维生素、Fe-Na-EDTA盐、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7.2。
[0012]优选的，第一步中将沙棘老根瘤用0.l%HgCl2真空渗入法消毒。
[0013]优选的，第二步中所述的诱变剂为含有2.5mg/mL亚硝基胍的诱变剂。
[0014]优选的，第二步中用紫外灯照射时，紫外灯离着菌悬浮液的距离为25cm。
[0015]本发明的有益效果是:
其一、本发明公开的选育方法，是基于诱发突变的原理获得快生型Frankia氏菌，该方法简单易操作，能够将慢生型Frankia氏菌诱变驯化成快生菌，填补了现有技术中难以获得快生型Frankia氏菌的空白。
[0016]其二、本发明方法，采用2.5mg/mL亚硝基胍为诱变剂，突变效率高，并且配合培养基培养，快生型Frankia氏菌的获得率较高。
[0017]其三、本发明公开的选育方法，能够高效的获得快生型Frankia氏菌，为开发关于Frankia氏菌新型微生物肥料奠定了好的基础，具有很好的生态环保和经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1是本发明培养20h的MFzSs(将原编号改为现编号，以便和菌种保藏编号一致)菌菌落。
[0020]图2是本发明MFz8#菌的菌丝体。
[0021]图3是本发明MFz8#菌丝与泡囊。
[0022]图4是本发明MFz8#菌丝与孢子。
[0023]其中，菌丝是生长发育体，泡囊是固氮结构，含有固氮酶，孢子是繁殖体。
【具体实施方式】
[0024]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]实施例1
先根据诱变培养基的配方制备诱变培养基，诱变培养基成分包括以下几种:磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钙、硼酸盐、水解络蛋白、蔗糖、微量元素液、维生素、Fe-Na-EDTA盐、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7.2。
[0026]根据筛选培养基的配方制备筛选培养基，筛选培养基成分包括以下几种:磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钙、丙酸盐、水解络蛋白、马铃薯糖化液、微量元素液、维生素、Fe-Na-EDTA盐、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7.2。
[0027]然后根据诱变培养和摇床培养筛选包括以下两大步，具方法，包括以下几步: 第一步，制备菌悬浮液:先将沙棘老根瘤用0.1%取(:12真空渗入法消毒，然后再转入到上述制备的诱变培养基中，然后匀浆制成菌悬浮液。
[0028]第二步，诱变处理:在第一步中制备的菌悬浮液中添加含有2.5mg/mL亚硝基胍的诱变剂，处理50min，然后再转入20W紫外灯下照射300s，紫外灯离着菌悬浮液的距离为25cm0
[0029]第三步，发酵培养:将所述第二步中经过诱变处理的菌悬浮液利用96孔板发酵培养。
[0030]第四步，筛选:利用快速生物测定法进行高通量筛选，然后通过3轮复筛，获得突变株，所述突变株比出发菌株的繁殖速度快4?12倍，所述突变株为快生菌。
[0031]第五步，对所述快生菌进行摇床培养筛选，将获得的所述快生菌接种到筛选培养基上，放置在转速140?200rpm/min的摇床上，培养温度为24?30°C，培养10天，所述快生菌菌株繁殖系数又提高了 1.2倍，干菌体得率为2.54%。
[0032]本实施例中，以标号为MFz8的菌株为例，MFz8号菌株繁殖系数提高了近12倍(如图 1、2)。
[0033]实施例2
实施例2中，获得快生菌后，对快生菌进行摇床培养筛选，将获得的所述快生菌接种到筛选培养基上，放置在转速160?180rpm/min的摇床上，培养温度为26?28°C，培养10天，所述快生菌菌株繁殖系数又提高了 1.5倍，干菌体得率为2.96%。
[0034]其培养结果如图3和图4中所示。
[0035]实施例2中的其它步骤以及诱变培养条件均与实施例1中的一致。
[0036]可见实施例2在其它条件不变的情况下，改变培养温度和摇床转速，对获得的快生菌培养结果也有所影响。
[0037]在交底书中，提到通过选择不同的培养基最终确定最佳的，如果可以请举出几种在实验过程中培养基的配方
说明:在Frankia慢生菌诱变到快生菌诱变培育过程中，我们探索过最少使用过将近10种培养基。以上报道的这两种诱变培养基、筛选培养基是最好的最后成功率最高的两种培养基。
[0038]该生物材料已送至“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2014年10月15日，保藏编号:9769,分类命名:Frankia brunchorst。
[0039]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【权利要求】
1.快生型Frankia氏菌菌株的选育方法，其特征在于，包括以下几步: 第一步，制备菌悬浮液:先将沙棘老根瘤消毒，然后再转入到事先制备的诱变培养基中，然后匀浆制成菌悬浮液，其中，所述诱变培养基的磷、硼、镁和水解络蛋白含量较高； 第二步，诱变处理:在第一步中制备的菌悬浮液中添加诱变剂处理50min，然后再转入20W紫外灯下照射300s ； 第三步，发酵培养:将所述第二步中经过诱变处理的菌悬浮液利用96孔板发酵培养； 第四步，筛选:利用快速生物测定法进行高通量筛选，然后通过3轮复筛，获得突变株，所述突变株比出发菌株的繁殖速度快4?12倍，所述突变株为快生菌。
2.根据权利要求1所述的快生型Frankia氏菌菌株的选育方法，其特征在于，还包括对所述快生菌进行摇床培养筛选，将获得的所述快生菌接种到筛选培养基上，放置在转速140?200rpm/min的摇床上，培养温度为24?30°C，培养10天，所述快生菌菌株繁殖系数又提高了 I?1.5倍，干菌体得率为2.54%。
3.根据权利要求2所述的快生型Frankia氏菌菌株的选育方法，其特征在于，所述筛选培养基成分包括以下几种:磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸镁lg/L、氯化钙0.025g/L、丙酸钠0.02g/L、水解络蛋白4g/L、马铃薯糖化液6g/L、微量元素液3ml、维生素2ml、Fe-Na-EDTA盐2ml、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7.2。
4.根据权利要求1所述的快生型Frankia氏菌菌株的选育方法，其特征在于，所述诱变培养基成分包括以下几种:蔗糖5g、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁lg/L、氯化钙0.05g/L、丙酸钠0.02g/L、水解络蛋白4g/L、马铃薯糖化液6g/L、微量元素液3ml、维生素2ml、Fe-Na-EDTA盐2ml、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7.2。
5.根据权利要求1所述的快生型Frankia氏菌菌株的选育方法,其特征在于，第一步中将沙棘老根瘤用0.l%HgCl2真空渗入法消毒。
6.根据权利要求1所述的快生型Frankia氏菌菌株的选育方法,其特征在于，第二步中所述的诱变剂为含有2.5mg/mL亚硝基胍的诱变剂。
7.根据权利要求6所述的快生型Frankia氏菌菌株的选育方法,其特征在于,第二步中用紫外灯照射时，紫外灯离着菌悬浮液的距离为25cm。
【文档编号】C12R1/01GK104450671SQ201410680717
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】张吉科, 张婉晖, 张小民, 张林超, 林美珍 申请人:张吉科