专利名称：特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum,异名 Erwinia carotovora)的检测方法，具体涉及一种特异性检测植物软腐病中此菌的PCR(聚合酶链式反应)技术。
背景技术：
植物软腐病是一类重要的植物病害，可以由真菌引起，也可由细菌引起。同一种植物的腐烂病可以由果胶杆菌属不同种的细菌引起，如马铃薯可以受到3种果胶杆菌即胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、马铃薯黑胚病菌Pectobacterium atrosepticum(异名 Pectobacterium carotovorum var. atrosepticum, Erwinia carotovora subsp. atroseptica)、禾口胃 @ 氏 lif Pectobacterium chrysanthemi (胃名 Erwinia chrysanthemi)的危害，因此造成了病原鉴定的困难。曾有人介绍过马铃薯种薯中上述3种菌的常规鉴定方法，即分离病菌后通过革兰氏染色、氧化酶试验、葡萄糖发酵、利用α-甲基-D-葡萄糖、37°C和39°C生长、蔗糖代谢产物的形成、磷酸酶的产生、红霉素敏感性、吲哚的产生、血清反应、组织浸解试验、及致病性检验进行鉴定的方法。这种方法太过于复杂、耗时。鉴定细菌种属的分子检测技术一般是用细菌16S rDNA通用引物做PCR，然后将 PCR产物测序后在NCBI网站做BLAST，根据最接近PCR产物序列的已经报告的序列来判断待测细菌的归属。不过，果胶杆菌属不同种的16S rDNA序列非常相近，以致于无法准确作出决断。本发明人亦曾试图依据已经报告的果胶杆菌16SrDNA序列来设计特异性PCR引物，结果未能成功找到特异性好的备选序列。鉴于果胶杆菌造成软腐症状的原因是产生果胶酶，为此对果胶杆菌的果胶酶基因做了尝试，以便为准确鉴定软腐细菌提供依据。
发明内容
本发明所要解决技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，解决了根据16S rDNA序列鉴定果胶杆菌属细菌特异性不好的问题，可以准确地判断植物软腐病是否由胡萝卜软腐果胶杆菌引起。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，该方法是以胡萝卜软腐果胶杆菌果胶裂解酶基因特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。该特异性引物为正向引物5，-CTATAGCGGTAATGAAG-3，(如SEQ ID No 1 所示)，反向引物5，-TTACCGACGCCAGCATAG-3，(如SEQ ID No 2 所示)。对本发明详述如下一、引物的设计发明人利用胡萝卜软腐果胶杆菌种间果胶酶基因核苷酸序列的特异性，从NCBI/ GenBank搜索并下载了胡萝卜软腐果胶杆菌的果胶酶基因碱基序列，用这些序列分别做BLAST，结果表明登录号为L32171. 1的胡萝卜软腐果胶杆菌果胶裂解酶基因的碱基序列的特异性比较好，见图1。依据登录号为L32171. 1的碱基序列，用primerBLAST工具设计PCR引物序列如下正向引物5，-CTATAGCGGTAATGAAG-3，，反向引物5，-TTACCGACGCCAGCATAG-3，，上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预计大小约为861bp。将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见图2和图3。结果表明该正向引物 BLAST得到的序列排在前面的6个序列和反向引物BLAST得到的序列排在前面的3个序列全是胡萝卜软腐果胶杆菌的序列。二、PCR 过程细菌基因组DNA的提取取胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种PCC1000菌系细菌在常用的肉汁胨细菌培养基上培养20-30h，得到单菌落，用无菌牙签挑取单菌落，洗入 ομ 1 ddH20中，99°C处理lOmin，离心后收集上清液，置于冰上备用。用上述设计的引物对对细菌总DNA进行扩增，预计扩增片段约为861bp。果胶酶基因扩增条件预变性94°C 5min ；循环参数94°C 30sec ；65°C 30sec ； 72°C 60sec ；共 30 个循环；72°C IOmin 延伸。三、PCR扩增产物的鉴定取5μ IPCR产物，在琼脂糖凝胶上电泳检测，并用凝胶成像系统检查，结果出现的条带与预期的大小相符。将PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司测序，测序结果经BLAST，除了 1条登录号为CP001790. 1的序列外，得到的全是胡萝卜软腐果胶杆菌的序列，见图4。本文中提及的PCR技术包含从PCR衍生的所有技术，如实时荧光PCR。与现有技术相比，本发明的优点是本方法使用的一对引物是根据胡萝卜软腐果胶杆菌71号菌系果胶裂解酶基因序列(登录号为L32171. 1)设计的，使用此对引物做PCR 检测时，可将胡萝卜软腐果胶杆菌与它属细菌准确区分，且可将胡萝卜软腐果胶杆菌与果胶杆菌属其它种区分开来，特异性高。
图1是登录号为L32171. 1的胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种果胶裂解酶基因的碱基序列BLAST结果。图2是本发明正向引物的BLAST结果。图3是本发明反向引物的BLAST结果。图4是用本发明引物作PCR的扩增产物的碱基序列的BLAST结果。图5是用本发明设计的引物对作PCR的检验结果。图中从左至右的3道电泳带依次为接种了胡萝卜软腐果胶杆菌的朝鲜蓟病株样品、未接种胡萝卜软腐果胶杆菌的无病的朝鲜蓟茎对照、和Marker。图6是4种细菌的PCR检测结果。图中从左至右的5道电泳带依次为=MarkeiN马铃薯黑胫病菌、菊欧氏菌、胡萝卜软腐果胶杆菌和凤梨泛菌。
具体实施例方式实施例一检测染病植物以朝鲜蓟根茎为例进行说明，检测引起朝鲜蓟根茎腐烂病的胡萝卜软腐果胶杆菌。将从朝鲜蓟根茎腐烂病株分离并鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌的菌种接种在无病的朝鲜蓟茎上，等初期症状显示后，从发病组织提取DNA作为PCR模板，然后用本发明引物对做PCR，PCR参数同前。PCR结果表明接种了胡萝卜软腐果胶杆菌的朝鲜蓟茎为阳性，而未接种胡萝卜软腐果胶杆菌的无病的朝鲜蓟茎为阴性，见图5。说明用此特异性引物可检测胡萝卜软腐果胶杆菌引起的病害。实施例二区分相近细菌按前述细菌DNA提取和PCR方法，检验4种细菌胡萝卜软腐果胶杆菌、马铃薯黑胫病菌、菊欧氏菌和凤梨泛菌，结果只有胡萝卜软腐果胶杆菌样品为阳性，其余3种细菌样品为阴性，见图6。由此，从理论上即L32171. 1序列BLAST和正、反向引物BLAST的结果，和从实践上即实施例一和二都证实了本发明的引物对的特异性。用这对引物做PCR检测，可将胡萝卜软腐果胶杆菌与它属细菌准确区分，且可区分胡萝卜软腐果胶杆菌与果胶杆菌属的其它种细菌。
权利要求
1.一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，其特征在于该方法是以胡萝卜软腐果胶杆菌果胶裂解酶基因特异的引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为正向引物5，-CTATAGCGGTAATGAAG-3，， 反向引物5’ -TTACCGACGCCAGCATAG-3，。
2.如权利要求1所述的特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，其特征在于所述特异性引物是根据登录号为L32171. 1的胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种71号菌系果胶裂解酶基因的碱基序列设计的，PCR产物大小为861个碱基。
全文摘要
一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)的PCR方法，是根据胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种71号菌系果胶裂解酶基因的碱基序列(GenBankL32171.1)序列设计一对引物，BLAST结果表明这对引物的特异性好。用这对引物做PCR检测时不仅可将它属细菌排除，且可区分胡萝卜软腐果胶杆菌与果胶杆菌属的其它种细菌，特异性高。
文档编号C12Q1/04GK102559901SQ20121001515
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者王晓丽, 高必达 申请人:湖南农业大学