专利名称：耐氯菌株1号的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐氯微生物的应用。
背景技术：
普通微生物对氯离子的耐受能力有限，一般情况下氯离子浓度小于4000mg/L时，微生物可以生长，不会受到明显的抑制作用。但是，如果氯离子浓度大于4000mg/L，则氯离子对微生物的抑制甚至毒害作用随氯离子浓度的提高而急剧显现，导致普通微生物不能生存。然而在自然界中，也存在着一些特种微生物，它们在含有高浓度氯离子，甚至是极端高浓度氯离子(5000-80000mg/L)的环境中可以正常生长，这类微生物可以称其为耐氯微生物。
但是，并非所有的耐氯微生物都可以应用于含高浓度氯离子废水的处理，必须经过严格的筛选和驯化才能得到既可耐受高浓度氯离子环境、又可降解废水中高浓度有机物的特种耐氯微生物。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐氯菌株1号的应用。
本发明所提供的耐氯菌株1号，为扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1CCTCCNO.M205122，已于2005年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC NO.M205122。
一株耐氯菌株1号的应用，其特征在于所述菌株的应用为扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)B723-1 CCTCC NO.M205122应用于含高浓度氯离子废水的处理中。
所述的一株扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1应用于含高浓度氯离子废水的处理方法为挑取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1∶含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)的体积比为0.5-2∶100取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1接种于含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)中，20-40℃恒温培养，pH值为6-8，反应24-72小时。
所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；固状琼脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
本发明从皂素废水池底污泥中筛选到一株在高浓度氯离子条件下具有一定生长能力的新菌株。一株耐氯菌株1号有良好的去除皂素废水中COD的能力，能在72小时之内去除废水中的COD 51.85％。
图1-1是菌株B723-1在液体SC培养基上生长情况2-1是菌株B723-1的PCR产物琼脂糖电泳图(1核DNA，2扩增产物，MMarker)图3-1是菌株B723-1菌落形态3-2是菌株B723-1菌株电镜图片图4-1是菌株B723-1在高COD不同[Cl-]条件下降解效率图具体实施方式
一、一株耐氯菌株1号的筛选方法(一)、材料准备1、实验废水和池底污泥取自湖北省十堰方坤置业有限公司皂素废水调节池。
2、培养基SM培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
SC培养基在SM培养基中，根据实验需要加入不同浓度(9万、8万、7万、6万、5万、4万、3万、2万、1万、0.5万mg/L)的氯离子。
3、实验仪器和设备国华SHA-B恒温振荡器，SHH150G光照生物培养箱，卧式压力蒸汽灭菌器------上海医用核子仪器厂，WMX-1型微波密封消解COD速测仪/-----汕头市环海工程总公司，722S分光光度计-----上海棱光技术有限公司，光学显微镜-----Olympus有限公司，pH计等-----Hana有限公司，超净工作台，鼓风干燥箱，KYKY-1000B扫描电子显微镜，PTC200型PCR仪，电泳仪及电泳槽，凝胶紫外观测仪，DDS-11型电导仪，(二)、菌株的筛选分离与纯化1)、初筛制备初筛菌悬液称取皂素废水调节池池底底泥样1g或皂素废水调节池内污水1mL接种于高压灭菌的SM培养基中，30℃-37连续培养30天进行富集，得初筛菌悬液；取初筛菌悬液20μl涂布于固体SM培养基；在初筛平板上挑取不同形态的单菌落在液体SM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布分离，经多次(如10次)纯化、分离，最后得到不同菌落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于SM培养基中，30℃恒温培养过夜，得分离菌悬液；2)、二次筛选制备复筛菌悬液在100ml浓度为9万、8万、7万、6万、5万、4万、3万、2万、1万或0.5万mg/L的氯离子的液体SM培养基内，加入初筛分离菌的分离菌悬液50μl，30℃恒温振摇5-7天，得复筛菌悬液；取复筛菌悬液20μl涂于固体SM培养基，30℃恒温培养1-2天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；获得一株编号为菌株B723-1的菌株，即耐氯菌株1号。
所述的SM培养基为蛋白胨10g牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
经过多次筛选和分离纯化，最后得到一株菌株B723-1，即耐氯菌株1号。耐氯菌株1号在加入不同浓度氯离子的液体SM培养基上生长情况如图1-1所示。
二、耐氯微生物菌株鉴定1、对耐氯性能较强的菌株B723-1的鉴定对耐氯性能较强的菌株B723-1进行了生理生化的鉴定以及16S rRNA分子的鉴定，从分子水平确定耐氯菌株的种属。
16S rDNA序列分析主要按照以下步骤1)提取细菌核DNA，a)集菌用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养18小时，取其菌悬液1ml于1.5ml的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。
b)加STE 1ml洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。
c)加600μlTE，剧烈振荡重悬细菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d)加等体积酚氯仿抽提三次。
e)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心10min。彻底弃上清。
f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，风干后溶于20μlTE备用。
TE缓冲液10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，STE缓冲液0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)，2)16S rDNA基因的PCR扩增，PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。
P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(终浓度为0.5μM)，1μLdNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。
3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。
4)16S rDNA的全序列测定和分析PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。
2、16S rDNA序列测定本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1484bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图2-1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。
<110>中国地质大学(武汉)<120>耐氯菌株1号的应用<160>1484<210>1<211>1484bp<212>DNA<213>扩展短杆菌(Brevibacterium linens)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1Taccttgtta cgacttagtc ccaatcacca gtcccaccct agacggcccc ctccacaagg60gttgggacac cggcttcggg tgttaccgac tttcgtgact tgacgggcgg tgtgtacaag120gcccgggaac gtattcaccg cagcgttgct gatctgcgat tactagcgac tccgacttca180cgtagtcgaa ttgcagacta cgatccgaac tgagactggc tttaagggat tcgcttaccc240tcacgggttc gcctctctct gtaccagcca ttgtagcatg cgtgaagccc aagacataaa300gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccgagt tgaccccggc agtctcctat360gagttcccac catcacgtgc tggcaacata gaacgagggt tgcgctcgtt gcgggactta420acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtaca ccagctccaa480agagaagaac tgtttccaga acggtccagt gtatgtcaag ccttggtaag gttcttcgcg540ttgcatcgaa ttaatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag600ttttagcctt gcgaccgtac ttccccaggc ggggcactta atgcgttagc tacggcgcgg660aagaacgtgg aatgtccccc acacctagtg cccaacgttt acggcatgga ctaccagggt720atctaatcct gktcgctccc catgctttcg ctcctcagtg tcagttacag cccagagtcc780gcttcgccac cgggtgttct cctgatatct gcgcatttca ccgctacacc aggaattcca840gacttcccta ctgcactcta gtcagccgta cccactgcac gcgcaacgtt aagcgttgcg900tttccacagc agacgtgacc aaccactacg agctctttac gcccaataat tccggacaac960gctcgtaccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccggtac ttcttctgca1020ggtaccgtca ctttcgcttc ttccctgctg aaagcggttt acaacccgaa ggccgtcatc1080ccgcacgctg cgtcgctgca tcagggtttc ccccattgtg caatattccc cactgctgcc1140tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cggtcgccct ctcaggccgg1200ctacccgtcg tcgccttggt aggccattac cccaccaaca agctgatagg ccgcgagccc1260atccccgatc gaaaaacttt ccaccaccca acatgcgtca ggaggtcata tccggtatta1320gacccagttt cccaggctta tcccgaaatc aggggcaggt tactcacgtg ttactcaccc1380gttcgccact catccaccaa cagcaagctg tcggcttcag cgttcgactt gcatgtgtta1440agcacgcagc cagcgttcgt cctgagccag gatcaaactc taat 1484三、菌落形态特征以及生理生化特性对菌株B723-1的菌落形态进行了仔细的观察，结果见图3-1。同时对菌表观也做了扫描电镜观察，结果见图3-2。菌株B723-1的菌落形态菌落呈乳白色(老龄菌呈橙色)、规则圆形、缘齐、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，经5M KOH处理后菌呈粉红色；生理特征幼龄菌呈不规则的杆状，0.6～1.2μm×1.5～6.0μm，单个或成对排列，常呈V形排列，老龄菌呈球状，存在典型的球杆周期，革兰氏阳性；主要生化特征严格好氧，化能异养菌，接触酶阳性，氧化酶阴性，产生精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及脲酶，从葡萄糖产少量酸，不运动，不生孢子，最适生长温度25～37℃。
四、菌株B723-1为新的菌株采用BLAST分析法对菌株B723-1的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株B723-1与扩展短杆菌(Brevibacterium linens)的同源性高达99.0％。
综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株B723-1命名为扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1。查阅有关资料，尚无短杆菌属有关高浓度氯离子条件下难降解有机废水以及对其耐氯能力研究的报道。扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1为新的菌株，已于2005年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC NO.M205122。
本发明从湖北省十堰皂素废水池底污泥中筛选分离出这一株细菌，并发现其有较好降解高浓度氯离子难降解皂素废水的功能。这拓宽了人们对扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含高浓度氯离子皂素废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。
五、耐氯菌株1号的应用(一)、挑取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1∶含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)的体积比为0.5-2∶100取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1接种于含高浓度氯离子(5000-80000mg/L)废水(如混合皂素废水)中，20-40℃恒温培养(最佳温度25～37℃)，振摇速度为100-180rpm，pH值为7-8，反应24-72小时所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
(二)、菌株B723-1对皂素废水降解能力取皂素生产混合废水，稀释一定倍数，使其COD为5400mg/L，[Cl-]为2万mg/L。取皂素混合废水50ml分别加入250ml的锥形瓶中，分别加入菌株B723-1的菌悬液1ml，30℃、150rpm、pH值＝7.1-7.5，摇床振荡3d，计算菌株对废水的COD和Cl-的去除情况，菌株B723-1去除COD的效率好，为51.8％。
(三)、氯离子浓度对B723-1降解皂素废水能力的影响为了考察菌株在高浓度COD(17136mg/L)时，在不同氯离子浓度下，对COD的去除效果，在废水中加CaCl2调节氯离子浓度分别为9240.2、17988.6、25734.2、35860.4、44803.1mg/L。耐氯菌株B723-1去除效果结果如图4-1。
从图4-1可以看出，当[Cl-]＝9420mg/L时，反应时间为24h，菌株B723-1对COD的去除率可达42.16％，但是随着反应时间延长，菌株B723-1对COD的去除率不会增加，这说明废水中被生物利用的可降解物质能在很短的时间内被微生物利用，皂素废水中存在不可生物降解的物质；当9240.2mg/L＜[Cl-]＜25734.2mg/L，反应时间为24h时，菌株B723-1对COD的去除率较[Cl-]＝9420mg/L时略有下降，但随着反应时间的延长，其最终的降解效率仍然较好。这说明氯离子浓度对耐氯菌株在皂素废水中去除COD的能力在时间上存在一个延滞期。
权利要求
1.一株耐氯菌株1号的应用，其特征在于所述菌株的应用为扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1 CCTCC No.M205122应用于含高浓度氯离子废水的处理中。
2.根据权利要求1所述的一株耐氯菌株1号的应用，其特征在于所述的一株扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1应用于含高浓度氯离子废水的处理方法为挑取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1含高浓度氯离子废水的体积比为0.5-2∶100取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723-1接种于含高浓度氯离子废水中，20-40℃恒温培养，pH值为7-8，反应24-72小时。
3.根据权利要求2所述的一株耐氯菌株1号的应用，其特征在于所述的SM培养基为蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；固状琼脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
全文摘要
本发明涉及一种耐氯微生物的应用。一株耐氯菌株1号的应用，其特征在于所述菌株的应用为扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723－1 CCTCC No.M205122应用于含高浓度氯离子废水的处理中。处理方法为挑取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723－1单菌落，于SM培养基中培养过夜，按培养后的扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723－1含高浓度氯离子废水的体积比为0.5－2∶100取扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723－1接种于含高浓度氯离子废水中，20－40℃恒温培养，pH值为7－8，反应24－72小时。一株扩展短杆菌(Brevibacterium linens)B723－1应用于含高浓度氯离子废水的处理中可高效降解高浓度有机污染物，能在72小时之内去除废水中的COD 51.85％。
文档编号C12R1/13GK1792888SQ20051001975
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者鲍建国, 王焰新, 刘慧 , 张彩香, 信欣, 李耀辰, 刘双, 李平, 张莉君 申请人:中国地质大学(武汉)