专利名称：一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酒精发酵，特别涉及一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株及其应用。
背景技术：
酵母菌是发酵工业中非常重要的微生物细胞工厂，其应用涉及到食品(如白酒、 啤酒、其他果酒、面包等)、生物化工产品(乙醇、谷胱甘肽、麦角甾醇等)、疫苗 等蛋白质药物、工业用酶制剂等多个产业中。在这些生物转化过程中，酵母细胞会受 到不同程度的环境胁迫，其中由于原料预处理或代谢副产物-乙酸引起的酸胁迫使酵 母菌的生长和代谢活性受到抑制，导致发酵速度和产率降低。改良酵母细胞的酸胁迫 耐受性对提高上述发酵过程的发酵效率，降低生产成本有重要意义。
当前，由于石油、天然气和煤炭等化石能源用量的急增，能源紧缺已成为世界性 问题，能源多元化发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点。以燃料乙 醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。近年 来，以淀粉质或糖质为原料生产燃料乙醇发展迅速， 一定程度缓解了能源紧缺，但却 引发了粮食安全问题。木质纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可 发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于 缓解石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产，促进农业生产与消费的 良性循环和可持续发展等方面具有积极作用。
酿酒酵母是以糖质和淀粉质为原料的乙醇发酵最经典的菌株。由于其对工业化生 产条件具有较高的适应性，对多种抑制因子和高渗透压具有一定耐受性，而且乙醇产
量也具有竞争性，因此在发酵木质纤维素水解物生产乙醇方面也具有明显的优势。而 且利用酿酒酵母发酵纤维素水解物生产乙醇可以很好地与以甘蔗糖和淀粉为底物的 乙醇发酵工艺整合起来，降低纤维素乙醇的成本。但在降解木质纤维素为可发酵糖的 过程中，以及微生物发酵过程中均会产生许多抑制微生物生长和发酵的物质，严重影
响乙醇的产率，其中乙酸在木质纤维素水解物中最高含量可达0.5%，它能延长酵母菌 的延滞期，降低酵母菌的生长和发酵速度，导致发酵周期的延长和乙醇产量的降低。 提高酵母细胞的酸耐受性，使其在胁迫条件下具有良好的发酵性能是酵母菌成功应用 于纤维素乙醇生产的必须条件。最终实现纤维素乙醇生产中酵母发酵层面的低能耗、 低消耗、低成本和乙醇高产率，产生巨大经济效益的同时，也带来良好的社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酿酒酵母菌株。
本发明提f共的酿酒酵母(6^cc/ 3/YM7yces cereK/w'ae) R8-10-2已于2009年8 月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址 为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCW.3226。
菌株R8-10-2具有典型的酿酒酵母形态特征细胞为椭圆形，多边芽殖。菌落凸 起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度3(TC， pH为5.0。
该菌株具有典型的酿酒酵母生理生化特征，能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海 藻糖，缓慢发酵棉子糖；不能发酵半乳糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖和淀粉等。
本发明的另一 目的在于提供酿酒酵母R8-10-2在酒精发酵中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种生产乙醇的方法，是将上述的酿酒酵母R8-10-2 置于发酵培养基中，发酵培养得到乙醇。
上述发酵培养基包括有机物，所述有机物是玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、 甘薯淀粉糖化液和糖蜜中的至少一种。
上述每升发酵培养基是由如下物质组成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g尿 素，0.5-lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为100 — 300g的 玉米淀粉糖化液，其余为水。
上述每升发酵培养基优选是由如下物质组成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素， lg磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖为200g的玉米淀粉糖化液， 其余为水。
上述发酵培养基的pH自然。
上述发酵培养的条件是在30 — 37。C条件下、培养30_36小时，溶氧控制在0-0.5 mg/L。
本发明的又一目的在于提供一种用于发酵上述的酿酒酵母R8-10-2的培养基。 本发明提供的每升培养基是由如下物质组成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g
尿素，0.5-lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为100 — 300g
的玉米淀粉糖化液，其余为水。
上述1L发酵培养基优选是由如下物质组成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，
lg磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖为200g的玉米淀粉糖化液，
其余为水。
实验证明在3(TC下，培养基含0.5%(体积百分比)乙酸条件下，酿酒酵母R8-10-2发酵产生的乙醇产量为89.6g/L;在37。C下，培养基含0.5% (体积百分比)乙酸条件 下，酿酒酵母R8-10-2发酵产生的乙醇产量为88.9g/L。
酿酒酵母是淀粉质、糖质和生物质原料产乙醇的经典优势菌种，酸胁迫是酵母细 胞在乙醇发酵过程中细胞活性和代谢活性的重要限制因素。提高酵母菌的酸胁迫耐受 性将改善酵母细胞在乙醇发酵过程中的活力和发酵性能，进而提高乙醇产量，縮短发 酵时间，降低生产成本。本发明利用新的基因组改组策略提高了酿酒酵母的酸胁迫耐 受性，获得酸胁迫条件下乙醇产量提高的、遗传稳定的酿酒酵母重组菌，该酿酒酵母 重组菌对发酵条件和发酵培养基没有特殊要求，而且能够适应较宽的发酵温度范围 (30-37°C)，可以降低发酵过程中的冷却成本，可直接应用于目前的酒精生产工艺 中，应用前景广阔。
图1为出发菌株R8及耐高浓度乙酸的酿酒酵母R8-10-2在不同温度下的乙酸耐 受性比较
图2为酸胁迫条件下出发菌株R8及耐高浓度乙酸的酿酒酵母R8-10-2在3(TC下 的发酵性能比较
图3为酸胁迫条件下出发菌株R8及耐高浓度乙酸的酿酒酵母R8-10-2在37"下 的发酵性能比较
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1耐高浓度乙酸的酿酒酵母(5"accAaro/^cas c&rew'w'ae) R8-10-2的获
得
一、出发菌株R8的获得
以酵母菌完全培养基YPD为基础对酿酒酵母菌(5"3cc力arov^ces cerew'w'ae) R8 (购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，CGMCC2. 1151) 的乙酸抗性、乙醇抗性、高渗透压抗性，最高生长温度和乙醇产量等指标进行考察， 发现:R8在3(TC时最高能抗17y。(体积百分比)乙醇、0. 4%(体积百分比)乙酸、14g/100ml 氯化钾，最高生长温度为42。C， 30。C发酵200g/l葡萄糖乙醇产量为93.2g/1，以R8 作为本研究的出发菌株。
二耐高浓度乙酸的酿酒酵母(&ccAgro/z jres cerew'w'se) R8-10-2的获得 1、耐乙酸高产菌株的单倍体菌株R8-10的分离
5按常规方法对酿酒酵母菌R8进行生孢培养和单倍体分离。分别测定单倍体菌株 的交配型、乙酸耐受性和乙醇产量，从中选出乙酸耐受性和乙醇产量高的单倍体菌株
R8-10。
2、 对单倍体菌株R8-10进行化学诱变
用硫酸二乙酯对单倍体菌株R8-10进行诱变，在含0. 5%乙酸(体积百分比)的YPD 平板上筛选突变菌株，从中选出遗传稳定性高、在3(TC最高能抗0.55。/。乙酸(体积百 分比)的突变株，作为基因组改组的亲株。
3、 原生质体融合及融合菌株筛选
制备乙酸抗性突变株的原生质体，各菌株原生质体等量混合，在PEG4000介导下 进行融合，在含0.6。/。乙酸(体积百分比)的YPD平板上筛选融合菌株。测定融合菌株的 乙酸抗性、遗传稳定性和乙醇产量，从中筛选出5株遗传稳定的、在3(TC最高能抗 0.63%乙酸(体积百分比)、乙醇产量高的融合菌株。
4、 基因重组
制备上述5株菌的原生质体，进行亚硝基胍诱变和原生质体融合，在含0.67%乙 酸(体积百分比)的渗透保护平板YPDS (含lmo1/1山梨醇的YPD培养基)上筛选基因 组改组菌株。通过乙酸抗性、遗传稳定性和乙醇产量测定，筛选出5株遗传稳定的、 在3(TC最高能抗0. 65-0. 7%乙酸(体积百分比)、乙醇产量高的酵母重组菌株。
提取上述5株酵母菌的总DNA，通过电击转化的方法(Bio-RadGene-Pulser， 1.5 kV， 50uF， 200Q， 3mSec)将上述DNA转化到乙醇产量最高的菌株细胞中，使不同的 基因组DNA之间发生重组，在含0. 75%乙酸(体积百分比)的YPD平板上筛选重组菌株， 共获得18个能够在3(TC最高抗0. 8%乙酸(体积百分比)的重组菌。
5、 性能检测获得耐高浓度乙酸的酿酒酵母(&cc力ara/^ces cerew'she) R8-10-2 通过遗传稳定性分析和乙醇发酵实验筛选到遗传稳定的、耐高浓度乙酸、乙醇产
量高的酿酒酵母R8-10-2，该菌株在3(TC能够抗0.8y。乙酸(体积百分比)，在37。C能 抗0.6%乙酸(体积百分比)(图l)。已于2009年8月14日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 3226。
菌株R8-10-2的形态特征菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度 3CTC， pH为5.0。
该菌株具有典型的酿酒酵母生理生化特征，能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海
藻糖，缓慢发酵棉子糖；不能发酵半乳糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖和淀粉。
实施例2、菌株R8-10-2与菌株R8在不同温度下和不同乙酸浓度条件下的发酵能 力分析一、菌株R8-10-2与菌株R8在3(TC发酵
原始出发菌株R8和酿酒酵母R8-10-2在YPD (2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，2g/100ml葡萄糖)培养基中，3(TC培养18小时，按10% (体积百分比)接种量转接于50mlYPD中，3(TC摇床培养20小时，该菌液即为种子液。按10% (体积百分比)接种量接于装有100ml乙醇发酵培养基EFM (6g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氢钾，L5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，200g葡萄糖，溶于水，定容至1升，自然pH，接种前不加乙酸，或加入乙酸，使之终浓度为0.5% (体积百分比))的250ml的摇瓶中，3(TC摇床(150rpm)培养6小时，然后密闭瓶口，在3(TC摇床(60 rpm)厌氧培养，不同时间取样测定细胞生物量、发酵液中乙醇含量和残糖量。实验重复3次，每次接种4个摇瓶。
其中，生物量测定方法如下取5ml发酵液测定0D6。。，然后5000rpra离心5分钟，分别收集细胞和上清液，上清液4'C保存备用。酵母细胞用蒸馏水洗一次后，称重获得细胞湿重，然后在65。C干燥至恒重，称重获得细胞干重，生物量为g干细胞/l发酵液。
发酵液中乙醇含量用气相色谱法测定，具体如下(1)色谱条件岛津2010气
相色谱仪，毛细管色谱柱DB-5(25. 0mX0.25mmX 0.25 um);柱温130 。C、检测器温度:180 。C 、进样器温度:180 。C;载气氮气1. Oml/min，分流比5:1 、氢气流量:45ml/min、空气流量500ml/min、尾吹气20ml/min;进样量O. 5 (il。
(2)乙醇标准曲线用色谱纯无水乙醇分别配制浓度为0. 1%、 0. 2%、 0. 5%、 1. 0%、 1. 5%、 2. 0%的乙醇水溶液，上述色谱条件下进样0.5^1，获得对应的峰面积，每个浓度设三个重复，以峰面积平均值为纵坐标，乙醇浓度为横坐标绘制标准曲线，获得峰面积(Y)和乙醇浓度(x)的函数关系式Y=55.324x+0.0158。
(3)样品测定将4"C保存的发酵液上清适当稀释，如上进样0.5^1，测定乙醇对应的峰面积，按如上函数公式计算样品中乙醇浓度。发酵液中残糖按二硝基水杨酸(DNS)法测定，具体如下(1)溶液的配制1克二硝基水杨酸溶于20ml 2M氢氧化钠和50ml水中，再加入30克四水合酒石酸钾钠，加水定容至100ml，存放在避光密闭的容器中，即为DNS溶液。(2)标准曲线的绘制配制浓度在l-10mM的葡萄糖标准溶液各lml，加入lml DNS溶液，沸水浴10min后，各管加入蒸馏水4ml， 540nm处测定吸光度，每一浓度做三个平行，求平均值，绘制吸光度相对于葡萄糖浓度的标准曲线，获得0054。和葡萄糖浓度(函)之间的函数关系式OD54(T0.1951x葡萄糖浓度(mM)。
(3)样品测定取4"C保存的发酵液上清lml或适当稀释后取lml，加入lml DNS溶液，沸水浴10min后，各管加入蒸馏水4ml，540mn处测定吸光度，每个样品做三个重复，求0054。平均值，按上述函数公式计算样品中葡萄糖浓度。
发酵结果见图2，图2中，A为不含乙酸条件下的发酵性能，B为发酵培养基中含 0.5%乙酸时的发酵性能；实心符号为重组酿酒酵母R8-10-2的发酵性能指标(麗、參、 ▲)，空心符号是原始出发菌株R8的发酵性能指标(□、〇、△)，其中(■、 □) 表示发酵液中剩余糖浓度，(參、〇)表示生物量(细胞干重)，(▲、 △)表示乙 醇产量。
在发酵培养基中不含乙酸的条件下，结果如图2A所示，耐酸重组的酿酒酵母 R8-10-2和原始出发菌株R8的发酵性能变化趋势基本一致，但在糖利用率、细胞生物 量和乙醇产量方面略优于原始出发菌株，重组菌株在3(TC发酵200g/l葡萄糖48小时， 糖利用率为99%，糖醇转化率为理论值的98.5%，乙醇产量为94. 5g/L;当在含0. 5% 乙酸的培养基中发酵时，结果如图2B所示，重组菌株的发酵性能明显优于原始出发 菌株，发酵200g/l葡萄糖60小时，糖利用率为93.5%,比原始出发菌株R8提高了 31%; 乙醇产量为89. 6g/L，比原始出发菌株R8提高了 30%。
其中，糖利用率是发酵开始发酵液中糖量减去发酵结束发酵液中残糖量的差与原 始糖量比值的百分数；糖醇转化率是乙醇产量和消耗的糖的比值，再除以0.51 (0.51 为lg葡萄糖最多可以转化为0.51g乙醇)。
二、菌株R8-10-2与菌株R8在37。C发酵
原始出发菌株R8和耐酸重组的酿酒酵母R8-10-2在YPD (2g/100ml蛋白胨， 1g/100ml酵母粉，2g/100ml葡萄糖)培养基中，3(TC培养18小时，按10% (体积百 分比)接种量转接于50mlYPD中，37。C摇床培养20小时，该菌液即为种子液。按10% (体积百分比)接种量接于装有lOOnil乙醇发酵培养基EFM (6g酵母粉，10g蛋白胨， 5g尿素，lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，200g葡萄糖，溶于水， 定容至1升，自然pH，接种前不加乙酸，或加入乙酸，使之终浓度为0.5% (体积百 分比))的250ml的摇瓶中，37。C摇床(150rpm)培养6小时，然后密闭瓶口，在37 'C摇床(60 rpm)厌氧培养，实验重复3次，每次接种4个摇瓶，不同时间取样测定
细胞生物量、发酵液中乙醇含量和残糖量。标准曲线的获得方法，以及生物量、发酵 液中残糖和乙醇含量的测定方法和计算公式同实施例2。
发酵结果如图3所示，图3中，A为不含乙酸条件下的发酵性能，B为发酵培养 基中含0. 5%乙酸时的发酵性能；实心符号为重组酿酒酵母R8-10-2的发酵性能指标 (■、參、▲)，空心符号是原始出发菌株R8的发酵性能指标(□、〇、△)，其 中(■、 □)表示发酵液中剩余糖浓度，(參、〇)表示生物量(细胞干重)，(▲、 △)表示乙醇产量。说明书第7/8页
在不含乙酸的培养基中37'C发酵，耐酸重组的酿酒酵母R8-10-2和原始出发菌株R8的发酵性能变化趋势基本一致，但在糖利用率、细胞生物量和乙醇产量方面略优于原始出发菌株，重组菌株在37i:发酵200g/l葡萄糖40小时，糖利用率为97.3%，糖醇转化率为理论值的99%，乙醇产量为94. lg/L (图3A)。当在含0. 5%乙酸的培养基中37'C发酵时，重组菌株的发酵性能明显优于原始出发菌株，发酵200g/l葡萄糖60小时，糖利用率为93.5%，比原始出发菌株1 8提高了36%;乙醇产量为88. 9g/L，比原始出发菌株R8提高了 33% (图3B)。
实施例3、利用菌株R8-10-2生产乙醇
利用酿酒酵母(5^ccA3ra^c" cerew'w'ae) R8-10-2 (CGMCC No. 3226)发酵生产乙醇的工艺过程包括
斜面菌种—液体菌种~> 一级液体种子培养—二级液体种子培养—发酵培养—乙醇。
具体步骤如下
(1) 斜面菌种将酵母菌株R8-10-2接种于YEPD固体斜面上，在28-37。C培养48小时，放入4'C冰箱保存；
(2) 液体菌种将保存的菌株R8-10-2活化后，接一环细胞于装有150毫升YEPD液体培养基的三角瓶中，于28-37"C振荡(200rpm)培养14-20小时即为液体菌种；
(3) —级液体种子培养将液体菌种按体积比10%的接种量接入装有1000毫升发酵培养基(每升发酵培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为100g的玉米淀粉糖化液，其余为水，pH自然)的三角瓶中，于28-37。C振荡(200rpm)培养14-20小时即为一级液体种子培养物；
(4) 二级液体种子培养将一级种子培养液按体积比10%的接种量接入装有100升发酵培养基(每升发酵培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为150g的玉米淀粉糖化液，其余为水，pH自然)的种子培养罐，在28-37"C搅拌(100-500rpm)培养14-20小时，溶氧控制在3-4mg/1，即为二级液体种子培养物；
(5) 发酵罐发酵将二级种子培养液按体积比20%的接种量接入装有500升发酵发酵培养基(每升发酵培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为200g的玉米淀粉糖化液，其余为水，pH自然)中，在28-37。C搅拌(100- 200rpm)培养，溶氧低于0.5 mg/L， 20-36小时后得到发酵醪。
9在上述工艺条件下，发酵醪乙醇含量为91.2g/1，糖利用率为98.7%，糖醇转化率为理论值的94%。
权利要求
1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)R8-10-2，CGMCC №.3226。
2、 权利要求1所述的酵母菌株R8-10-2在酒精发酵中的应用。
3、 一种生产乙醇的方法，是将权利要求l所述的酵母菌株置于发酵培养基中， 发酵培养得到乙醇。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基包括有机物，所 述有机物是玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液和糖蜜中的至少一种。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述1L发酵培养基是由如下 物质组成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g尿素，0.5-lg磷酸二氢钾，1.5g七水 硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为100 — 300g的玉米淀粉糖化液，其余为水。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述1L发酵培养基优选是由如下 物质组成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g 氯化钙，总还原糖为200g的玉米淀粉糖化液，其余为水。
7、 根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养的条件是 在30 — 37。C条件下、培养30 — 36小时，溶氧为0-0.5 mg/L。
8、 一种用于发酵权利要求l所述酵母菌株的培养基，其特征在于所述1L发酵 培养基是由如下物质组成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g尿素，0.5-lg磷酸二 氢钾，1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖为100 — 300g的玉米淀粉糖化液， 其余为水。
9、 根据权利要求8所述的培养基，其特征在于所述1L发酵培养基优选是由如 下物质组成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氢钾，1.5g七水硫酸镁， 0.5g氯化钙，总还原糖为200g的玉米淀粉糖化液，其余为水。
全文摘要
本发明公开了一种耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株。该菌株R8-10-2已于2009年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3226。利用该菌株进行发酵，在30℃下，培养基含0.5％(体积百分比)乙酸条件下，R8-10-2发酵产生的乙醇产量为89.6g/L；在37℃下，培养基含0.5％(体积百分比)乙酸条件下，R8-10-2发酵产生的乙醇产量为88.9g/L。
文档编号C12N1/18GK101633896SQ20091009184
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者何秀萍, 莹 卢, 张博润, 郭雪娜 申请人:中国科学院微生物研究所