专利名称：耐氯菌株3号的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐氯菌株3号的基因，它是松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3的16S rRNA基因。其中，松鼠葡萄球菌B723-3已由中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏日期是2005年10月24日，保藏号是CCTCC NO.M205121。通过经典表型鉴定和16S rRNA核苷酸序列分析相结合的方法，对耐氯菌株3号进行了生理生化和16S rRNA分子水平的鉴定，由此确定它为松鼠葡萄球菌，同时将它的16S rDNA序列于2005年4月27日提交国际Genbank进行了登记，登记号为AB212276。
背景技术：
自然界中，存在着一些可以在含有高浓度甚至是极端高浓度氯离子的环境中正常生长的微生物。经过研究发现，这些微生物并非都可以应用于含高浓度氯离子废水(氯离子浓度为5000-80000mg/L)的处理，只有对其经过严格的筛选和驯化后得到的耐氯微生物才能做到。耐氯微生物既可耐受高浓度氯离子环境，又可降解废水中高浓度的有机物。筛选耐氯微生物的首选取样点就是所要处理的废水中，因为在废水中存在着一定数量的微生物，这些微生物对废水环境有较好的适应能力。初筛选出来的耐氯微生物经过驯化后，即可作为耐氯微生物菌株应用到废水处理实践中。
微生物的分类方法常用的有经典分类方法和分子生物学分类法。经典分类方法主要指依据形态特征(Morphological characteristics)、培养特征(Cultural characteristics)及生理生化特征(Physiological characteristics)等分类的方法。分子生物学分类法，又称分子分类方法，是指在分子水平上对生物个体的核酸及蛋白质进行研究，并据此对生物个体进行分类的方法。由于16S rRNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分类方法采用。
目前，16S rRNA序列分析的方法主要有两种一种是16S rRNA提纯后用反转录酶和保守引物进行测序，另一种是扩增16S rRNA基因对应的DNA序列，然后将PCR产物回收后直接测序。它们是研究rRNA同源性最直接可靠的方法。
耐氯菌由于具有耐氯特性，其形态、胞壁、细胞内蛋白、脂肪酸等大分子组成在有盐存在的情况下会发生不同程度的改变，在菌株鉴定过程中，仅从形态上很难判断它们的归属，而从生理特征和化学特征上鉴定又十分费时费力，对于大量的分离菌株更是如此。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过16S rRNA序列分析方法，快速对耐氯菌株3号进行分子水平的鉴定，确定其为松鼠葡萄球菌。该菌株是新发现的能够在高浓度氯离子环境下生存的耐氯菌株，它有助于降解废水中的有机物。
本发明所采用的技术方案如下提供松鼠葡萄球菌B723-3CCTCC NO.M205121的16S rRNA基因，其全长1484个核苷酸。
本发明基因序列，通过提取细菌核DNA，16S rRNA基因的PCR扩增，PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析而获得。
本发明具有快速、简便的优点。所提供的基因序列已获得国际Genbank的认可，并且给予了登记，这必将有助于推动我国废水处理事业的发展。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供的CCTCC NO.M205121菌株的基因，其16S rDNA全序列全长1515个核苷酸。
采用BLAST分析法，将松鼠葡萄球菌B723-3CCTCC NO.M205121的菌株的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与松鼠葡萄球菌的同源性为99.0％，由此可以从分子水平确定本菌株是松鼠葡萄球菌。同时，结合经典分类方法所获得的形态及生理生化特征，最终确定本菌株是松鼠葡萄球菌。
本菌株的菌落形态特征菌落菌斑较大(5mm)、呈米黄色、规则圆形、缘齐、不透明表面光滑、微凸，粘稠。生理特征球形，直径0.5～1.5μm，单个、成对或不规则堆状，革兰氏阳性。主要生化特征兼性厌氧，化能异养菌，接触酶阳性，氧化酶阴性，产生精氨酸双水解酶和脲酶等，从D-纤维二糖、D-岩糖、D-甘露醇、D-核糖、果糖、蔗糖产酸，不运动，不生孢，最适生长温度30～37℃。
本发明采用提取细菌核DNA、16S rRNA基因的PCR扩增、PCR产物的回收，以及16SrDNA的全序列测定和分析步骤，来获取CCTCC NO.M205121菌株的16S rDNA基因全序列。
上述步骤具体如下(1)提取细菌核DNAa.集菌用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养18小时，取菌悬液1ml于1.5ml的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。
b.加STE 1ml洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。
c.加600μlTE，剧烈振荡重悬细菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d.加等积体酚氯仿抽提三次。
e.小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心10min，彻底弃上清。
f.DNA沉淀用70％乙醇洗一次，风干后溶于20μlTE备用。
TE缓冲液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0。
STE缓冲液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0。
(2)16S rRNA基因的PCR扩增在50μL反应体积中加入1μL模板DNA，0.1μg；0.5μL P1和P2，终浓度为0.5μM；1μLdNTP，每种NTP0.2mM；0.5μLTaq聚合酶，2U；5μL 10×PCR缓冲液。
PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。
PCR扩增的引物是P1正向引物为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。
(3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。
(4)16S rDNA的全序列测定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR扩增30个循环，其条件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应；然后，在AppliedBiosystem 373ADNA测序仪上测序；然后采用BLAST软件，将测得的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为松鼠葡萄球菌株的基因全序列。
在PCR测序时，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
本实施例中，未具体说明本发明菌株的筛选和驯化等内容。其详情可参阅由本申请人同日申请的“耐氯菌株3号及其筛选方法”和“耐氯菌株3号的应用”两项发明专利文献内容。
CCTCC NO.M205121的菌株的16S rDNA全序列agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga60acagatgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa120cctacctata agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat aatattttga180accgcatggt tcaatagtga aagacggttt cggctgtcac ttatagatgg acccgcgccg240tattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcgacg atacgtagcc gacctgagag300ggtgatcggc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtagg360gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtctt420cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaaatttgt tagtaactga acaagtcttg480cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt540ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttc ttaagtctga600tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtgggagg gtcattggaa actggggaaa cttgagtgca660gaaaaaggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gcagaagata tggaggaacc720cccagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gatgtgcgaa agcgtgggga780tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct agtgttaggg840ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc900gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt960aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctttgaccg ctctagagat1020agagtcttcc ccttcggggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt1080cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt1140aagttgggca ctctaggttg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca1200aatcatcatg ccccttatga tttgggctac acacgtgcta caatggataa tacaaagggc1260agcgaatccg cgaggccaag caaatcccat aaaattattc tcagttcgga ttgtagtctg1320caactcgact acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat1380acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc1440cggtggagta accttttagg agctagccgt cgaaggtggg acaaatgatt ggggtgaagt1500cgtaacaagg taacc 151权利要求
1.耐氯菌株3号的基因，其特征是松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3CCTCC NO.M205121的16S r RNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下AGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACTGAACAAGTCTTGCGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAAACTTGAGTGCAGAAAAAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAAGATATGGAGGAACCCCCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC上述16S r DNA序列全长1515个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的耐氯菌株3号的基因，其特征在于采用BLAST分析法，将松鼠葡萄球菌B723-3CCTCC NO.M205121的菌株的16S r DNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与松鼠葡萄球菌的同源性为99.0％。
3.一种获取权利要求1或2所述耐氯菌株3号的基因的方法，其采用了提取细菌核DNA、16S r RNA基因的PCR扩增、PCR产物的回收，以及16S r DNA的全序列测定和分析步骤，其特征在于(1)在提取细菌核DNA的过程中，采用了如下的缓冲液，TE缓冲液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE缓冲液0.1mol/LNaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0，(2)在16S r RNA基因的PCR扩增过程中，采用了如下的扩增条件和扩增的引物PCR扩增条件为94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min，PCR扩增的引物是P1正向引物为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’，(3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水，(4)16S rDNA的全序列测定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR扩增30个循环，其条件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应；然后，在AppliedBiosystem 373A DNA测序仪上测序；然后采用BLAST软件，将测得的16S r DNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为松鼠葡萄球菌株的基因全序列，在PCR测序时，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
全文摘要
本发明涉及耐氯菌株3号的基因，它是松鼠葡萄球菌(Staphy/ococcus sciuri)B723－3的16S rRNA基因，其菌株的16S rDNA序列全长1515个核苷酸。本发明基因序列，通过提取细菌核DNA，16S rRNA基因的PCR扩增，PCR产物的回收，以及16S rDNA的全序列测定和分析而获得。本发明具有快速、简便的优点。所提供的基因序列已获得国际Genbank的认可，并且给予了登记，这必将有助于推动我国废水处理事业的发展。
文档编号C12N1/20GK1831130SQ200510019750
公开日2006年9月13日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者鲍建国, 王焰新, 刘慧 , 张彩香, 信欣, 李耀晨, 刘双, 李平, 张莉君 申请人:中国地质大学(武汉)