自身遏制性乳杆菌菌株的制作方法

专利名称：自身遏制性乳杆菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其具有在环境中受限制的生长和生存力。更特别地，本发明涉及一种只能在含有胸腺嘧啶核苷的培养基中存活的重组乳杆菌。由于这种对胸腺嘧啶核苷的严格依赖性，在此重组菌株中迅速诱导胸腺嘧啶核苷缺陷致死。一个优选的实施方案是一种乳杆菌，其只能在存在胸腺嘧啶核苷的宿主生物体中存活，但是在所述宿主生物体体外缺乏此培养基化合物时不能存活。进一步地，可以用预防性和/或治疗性分子转化所述乳杆菌菌株，从而可以将所述乳杆菌菌株用于治疗疾病，例如但不限于炎性肠病。
背景技术：
长久以来在各种工业发酵过程中乳酸细菌都得到了广泛的应用。它们通常被认为是安全的，这使得它们在生产商业上重要的蛋白质时成为潜在有用的生物体。事实上，在乳球菌属(Lactococcus)物种中已经成功地生产出了一些异源蛋白质，例如白介素-2(Steidler et al.，1995)。然而，并不希望这些经过遗传修饰的微生物在环境中存活并且扩散。
为了避免意外地释放经过遗传修饰的微生物，已经施行了用于安全操作的特殊指南和用于物理遏制(physical containment)的技术要求。尽管这在工业发酵中也许是有用的，但是所述物理遏制通常认为是不够的，还采取了另外的生物遏制(biological containment)措施以降低所述经过遗传修饰的微生物在环境中存活的可能性。在物理遏制是困难的甚至是不可能的情况下，生物遏制是极其重要的。所述情况例如是将经过遗传修饰的微生物用作活疫苗时或者是将其作为载体输送治疗性化合物时。这些应用已经在例如WO 97/14806中得到描述，其公开了通过重组非侵入性或非病原性细菌将生物活性肽例如细胞因子输送至对象中。WO 96/11277描述了通过给予一种编码治疗性蛋白质的重组细菌将治疗性化合物输送给动物一包括人。Steidler et al.(2000)描述了通过给予分泌白介素-10的重组乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)治疗大肠炎。这种输送对于治疗被疾病侵袭的人或动物体内的疾病可能的确是极其重要的，但是当所述重组细菌进入未被疾病侵袭的对象体内时也许会成为有害及病原性微生物，因此需要一种避免所述微生物意外扩散的有效的生物学遏制措施。
尽管可以用乳球菌获得足够的治疗，但是其主要缺点是所述细菌不能建群以及需要持续进行药物治疗以确保效果。建群的菌株例如乳杆菌可以具有这样的优点可以用一次给药或有限数次的给药得到相似的效果。然而，与乳球菌的情况相似，需要一种严格的生物学遏制系统以避免所述细菌在环境中的传播。
基于宿主对在外部环境中不存在或以低浓度存在的特殊生长因子或营养成分的严格要求，用于宿主生物体的生物学遏制系统可以是被动的；或者，基于宿主中所谓“自杀性遗传元件”，所述生物学遏制系统可以是主动的，其中所述宿主在外部环境中被一种由基因编码的细胞杀伤功能杀死，所述基因处于仅在特定环境条件下才表达的启动子控制之下。
在微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已经熟知被动生物学遏制系统。这些大肠杆菌菌株在例如US4100495中公开。WO 95/10621公开了乳酸细菌抑制子突变体及其在乳酸细菌中作为遏制手段的应用，但是在这种情况下，所述遏制处于质粒水平，而不是处于宿主菌株水平，并且其稳定所述宿主菌株中的质粒，但是对于被遗传修饰的宿主菌株自身并不提供遏制。
一些作者已经描述了主动自杀系统。这种系统包含两个元件致死基因和在非许可条件下启动所述致死基因表达的控制序列。WO95/10614公开了一种在胞浆中具有活性的截短的和/或突变的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶作为致死基因的应用。WO96/40947公开了基于一种必需基因和/或一种致死基因的表达而具有环境限制活性(environmentally limited viability)的重组细菌系统，其中所述必需基因当细胞处于许可环境时表达，当细胞处于非许可环境时不表达，所述致死基因的表达对于细胞是致死性的，并且所述致死基因当细胞处于非许可环境时表达，但是当细胞处于许可环境时不表达。WO 99/58652描述了基于relE细胞毒素的生物学遏制系统。然而，大多数系统是针对大肠杆菌(Tedin et al.，1995；Knudsen et al，1995；Schweder et al.，1995)或假单胞菌(Pseudomonas)(Kaplan et al.，1999；Molina et al.，1998)精心设计的。
一种令人感兴趣的方式是将胸苷酸合酶基因中的突变用作遏制系统。具有这种突变的原核细胞和真核细胞都不能在低浓度的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶中生长，并且对此饥饿应答而经历细胞死亡。这一现象已知为胸腺嘧啶缺陷致死(thymineless death)(Goulian et al.，1986；Ahmad et al.，1998)。Fu和Xu(2000)描述了使用来自干酪乳杆菌(Lactococcus casei)的thyA基因作为选择标记的用于嗜酸乳杆菌(Lactococcus acidophilus)的基于此突变的遏制系统。所使用的thyA突变体已经通过自发突变和三甲氧苄二氨嘧啶选择而选择出。这种突变易于发生回复突变，使用另一种乳杆菌物种的thyA基因以通过所述标记基因的重组(inrecombination)避免所述回复突变。事实上，thyA突变的回复突变是一个问题，尤其是当培养基中缺乏胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷时，所述突变会以高频率回复，从而菌株逐渐丧失其遏制性质。对于可接受的生物学遏制，需要一种非回复性突变体。
非回复性突变体可以通过基因破坏(gene disruption)获得。在乳球菌中已经描述了基于这种基因破坏的遏制系统(Steidler et al.，2003)。然而，尽管干酪乳杆菌的thyA基因已经被克隆并且通过定向诱变被突变，但是其仅在大肠杆菌中进行了测试，并且从来没有在乳杆菌菌株中被用于基因置换。尽管本领域技术人员已知转化乳杆菌的技术，但是在乳杆菌中thyA的基因破坏从未成功，很明显这是非显而易见的。
令人惊讶的是，我们在乳杆菌中构建出了thyA的基因破坏。更加令人惊讶的是，我们发现这种基因破坏突变体的存活是严格胸腺嘧啶核苷依赖性的，并且所述突变体不能通过向培养基中加入胸腺嘧啶得到拯救。后者是尤其令人惊讶的，因为通常认为thyA突变体可以通过向培养基中加入胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶得到拯救(Fu and Xu，2000；Ahmad et al.1998)。这种菌株的存活力在缺乏胸腺嘧啶核苷时(即使存在胸腺嘧啶)迅速降低，因此，当需要生物学遏制时这是一种理想的宿主菌株。迅速的胸腺嘧啶核苷缺陷致死的诱导(其比前面描述的乳球菌菌株还要迅速)和所述菌株不能被胸腺嘧啶拯救的事实使其成为一种理想的用于向活体动物(包括人)体内输送预防性和/或治疗性分子的菌株。
发明详述本发明的目的是提供一种合适的乳杆菌生物学遏制系统。
本发明的第一个方面是一种乳杆菌物种的分离的菌株，其包括缺陷的重组胸苷酸合酶基因(thyA)，从而所述菌株的存活严格依赖于胸腺嘧啶核苷的存在。优选地，所述缺陷的重组基因被置于染色体中并且通过基因破坏失活。如本文所用，基因破坏包括通过插入DNA片段破坏、通过缺失所述基因或其一部分破坏、以及通过用另一个DNA片段替换所述基因或其一部分破坏，并且所述破坏通过重组DNA技术诱导而不是通过自发突变诱导。优选地，基因破坏是用另一个功能性基因替换所述基因或其一部分。优选地，所述缺陷的重组胸苷酸合酶基因是非回复性突变基因。
如本文所用，非回复性突变体是指回复突变频率低于10-8，优选地，所述回复突变频率低于10-10，更优选地，所述回复突变频率低于10-12，更优选地，所述回复突变频率低于10-14，最优选地，所述回复突变频率不能使用本领域技术人员已知的常规方法检测出。优选地，所述乳杆菌物种是唾液乳杆菌(Lactococcus salivarius)。更优选地，所述乳杆菌是唾液乳杆菌唾液亚种(Lactococcus salivarius subsp.salivarius)菌株UCC118。非回复性thyA突变体可以认为是一种主动遏制的形式，因为其对胸腺嘧啶核苷饥饿应答而经历细胞死亡(Ahmad et al.，1998)。
与以前描述的所有thyA突变体相反，所述突变体不能被胸腺嘧啶拯救，并且即使胸腺嘧啶存在于培养基中，其仍会经历细胞死亡。如本文所用，不能被拯救是指所述菌株不能在向含有除胸腺嘧啶核苷之外的所述菌株生长所需的全部必需化合物的培养基中添加一定浓度的胸腺嘧啶的情况下生长。优选地所述突变体将会经历胸腺嘧啶核苷缺陷致死，即使胸腺嘧啶浓度为25μg/ml，更优选地30μg/ml，更优选地40μg/ml，更优选地50μg/ml，最优选地100μg/ml。所述突变体进一步的特征是在培养基中缺乏胸腺嘧啶核苷时存活力迅速降低。优选地，在缺乏胸腺嘧啶核苷时存活力的初始降低为在16小时中降低2log单位的菌落形成单位(colony forming units，cfu)，更优选地，所述初始降低为在12小时中降低2log单位cfu，最优选地，所述初始降低为在8小时中降低2log单位cfu。所述存活力的初始降低表示为当所述菌株在清除胸腺嘧啶核苷的MRS培养基中维持在37℃时，相对于在时间0时的菌落形成单位，在时间X后的cfu(此处分别为16、12或8小时)。
以前描述的乳杆菌thyA突变体与其他thyA突变体相似，通常都可以通过向培养基中加入胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷拯救。然而，特别是在胸腺嘧啶和/或胸腺嘧啶核苷的浓度不能被小心地控制的情况下，对培养基中的胸腺嘧啶核苷的严格依赖性是对于生物学遏制的一个重要优点。作为非限制性实例，这可能就是使用大量培养基的工业发酵中出现的情况，所述大量培养基可能被痕量胸腺嘧啶污染。进一步地，本发明揭示了这种菌株在其被用作动物体内(包括人体)的输送载体的情况中是特别有用的。当这种被转化的菌株通过例如口服给予动物(包括人)时，其在消化道中存活，并且产生可能有益于所述动物的同源和/或异源蛋白质，例如但非限于人白介素-10。所述突变体不能被胸腺嘧啶拯救的事实提供了一种更好的遏制手段，特别是当用于不能控制粪便中的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的残余浓度的人体和动物体时。
因此，本发明的另一方面是本发明的乳杆菌菌株作为生物学遏制菌株在输送预防性和/或治疗性分子中的应用。优选地，所述输送在不能严格控制胸腺嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶浓度的情况下需要生物学遏制，所述情况例如但不限于将所述预防性和/或治疗性分子输送至动物体(包括人体)以预防或治疗疾病。如本文所用，不能严格控制胸腺嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶浓度的情况是指对所述浓度没有直接的控制，例如通过主动和受控添加或移除胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷而对所述浓度的控制。优选地，所述胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷缺陷条件是通过天然过程产生的，例如由肠中胸腺嘧啶核苷吸收而导致的胸腺嘧啶核苷耗竭。作为非限制性实例，WO 97/14806和WO 98/31786中已经公开了所述预防性和/或治疗性分子的输送。预防性和/或治疗性分子包括但不限于多肽例如胰岛素、生长激素、促乳素(prolactine)、降钙素、1组细胞因子(group 1 cytokines)、2组细胞因子(group 2 cytokines)、3组细胞因子(group 3 cytokines)、神经肽和抗体，以及多糖例如来自病原性细菌的多糖抗原。
在一个优选的实施方式中，一种乳杆菌菌株的thyA基因，优选唾液乳杆菌的thyA基因，被破坏并且被功能性的人白介素-10表达盒取代，所述菌株可用于输送白介素-10。所述白介素-10表达单位优选地但不限于是人白介素-10表达单位或编码人白介素-10的基因。因此，一个优选的实施方案是本发明的一种乳杆菌菌株在输送人白介素-10中的应用。输送所述分子的方法和治疗疾病例如炎性肠病的方法在Steidler et al.的WO 97/14806和WO 00/23471以及Steidler et al.(2000)中被详细解释，所述文献通过引用并入本文。本发明表明本发明的菌株令人惊讶地与对照菌株以同样的速度通过消化道，并且显示其存活力的丧失与对照菌株的确没有差别。然而，所述菌株一旦被分泌至环境中，例如在粪便中，就不能存活。特别令人惊讶的是所述缺失突变体可以在肠内特别是在回肠内存活，因此可用作被生物学遏制的输送菌株，而其仅依赖于胸腺嘧啶核苷。
本发明的另一方面是一种药物组合物，其包括本发明的乳杆菌物种thyA破坏突变体。作为非限制性实例，所述细菌可被包囊以促进其输送至肠。本领域技术人员已知包囊的方法，所述方法公开于例如EP0450176。
本发明的另一方面是本发明的菌株在制备药物中的应用。优选地，所述药物用于治疗克隆病(Crohn’s disease)和炎性肠病。
附图简述

图1全部菌株唾液乳杆菌菌株在相关之处由其菌株编号(UCC118，TGB078，TGB092)表示。
A组UCC118 thyA(阴影线)和hIL-10(黑线)之间的基因交换示意图。大小为1Kb的用于同源重组的靶DNA(灰色)位于UCC118的染色体上和非复制型红霉素(Em)抗性标记阳性质粒上，其分别在thyA和hIL-10的上游和下游均存在。UCC118染色体DNA(粗黑线)位于靶DNA上游及下游侧翼。在UCC118中引入所述非复制型质粒后(1)，将转化混和物在存在Em的情况下温育，这使得可以对在靶的上游或下游的同源重组事件进行选择(2)，所述事件通过使用1F/1R或2F/2R寡核苷酸的PCR区分。在不存在Em和存在50μg/ml胸腺嘧啶核苷的情况下重复生长使得发生第二次重组(3)，其可由组合的1F/1R和2F/2R PCR检测。Em阴性、1F/1R 2F/2R PCR阳性克隆具有所希望的遗传结构(4)。
B组亲代菌株唾液乳杆菌UCC118和得到的菌株唾液乳杆菌TGB078以及唾液乳杆菌TGB092的详细描述。TGB092携带乳酸乳球菌thyA启动子(PthyA，GenBank AF462070)。
图2唾液乳杆菌UCC118 thyA(阴影线)和hIL-10(黑线)之间的基因交换的PCR鉴别，其产生菌株唾液乳杆菌TGB078和唾液乳杆菌TGB092。全部菌株由其菌株编号(UCC118，TGB078，TGB092)表示。A组显示了不同PCR反应的示意图。B组显示了相关分子量大小间隔的琼脂糖凝胶电泳数据。两组中的数字1-8均表示不同的PCR反应。
PCR1在UCC118中，而不是在TGB078和TGB092中检测到thyAPCR2在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中检测到hIL10PCR3在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中检测到与靶区域外的上游基因组DNA相连的hIL10。大小的差别是由于hIL-10启动子区域的差别所致，如图1B中所详示的。
PCR4在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中检测到与靶区域外的下游基因组DNA相连的hIL10。
PCR5在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中检测到与靶区域外的上游基因组DNA相连的hIL10。大小的差别是由于hIL-10启动子区域的差别所致，如图1B中所详示的。
PCR6在TGB078和TGB092中，而不是在UCC118中检测到与靶区域外的下游基因组DNA相连的hIL10。
PCR7在UCC118中，而不是在TGB078和TGB092中检测到与靶区域外的上游基因组DNA相连的thyA。
PCR8在UCC118中，而不是在TGB078和TGB092中检测到与靶区域外的下游基因组DNA相连的thyA。
图3唾液乳杆菌UCC118、唾液乳杆菌TGB078和唾液乳杆菌TGB092的Southern印迹杂交。全部菌株由其菌株编号(UCC118，TGB078，TGB092)表示。完整染色体DNA用Qiagen Dneasy组织试剂盒根据制造商描述制备，其中在方案第一步中调整为细菌细胞壁用溶菌酶消化。DNA制备物用EcoRI切割，并与Roche DIG标记的DNA分子量标记VII一起通过1.2％琼脂糖凝胶分离。所述DNA转移至尼龙膜并使用DIG标记的thyA和hIL-10探针显示。全部DIG标记和检测根据制造商(Roche)描述进行。UCC118对thyA探针而不是hIL-10探针显示了适当大小的信号。TGB078和TGB092对thyA探针未显示信号，但是对hIL-10探针显示了适当大小的信号。后者的大小差异是由于TGB078和TGB092启动子结构中的差异所致，如图1所示出的。
图4唾液乳杆菌UCC118、唾液乳杆菌TGB078和唾液乳杆菌TGB092产生IL-10。全部菌株由其菌株编号(UCC118，TGB078，TGB092)表示。全部菌株的单菌落接种在补充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRS中并且在37℃温育40小时。离心收集细菌，在补充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的BM9(缓冲的M9生长培养基)中重悬，并在37℃温育5小时。通过ELISA(Becton Dickinson)确定培养基上清中的IL-10。
图5唾液乳杆菌UCC118、唾液乳杆菌TGB078和唾液乳杆菌TGB092在缺乏胸腺嘧啶核苷的情况下的存活。全部菌株由其菌株编号(UCC118，TGB078，TGB092)表示。每毫升培养基的菌落形成单位(CFU)相对时间作图。
图6与乳酸乳球菌MG1363及其ThyA突变体Thy12相比，唾液乳杆菌UCC118、唾液乳杆菌TGB078和唾液乳杆菌TGB092在缺乏胸腺嘧啶核苷的情况下的存活。
每一种所示菌株的18个菌落接种于87mlA)MRSΔT(无胸腺嘧啶核苷的MRS，通过将全部胸腺嘧啶核苷转变为胸腺嘧啶而酶促制备)，在唾液乳杆菌UCC118(wt)或唾液乳杆菌TGB092(thyA缺陷)的情况下；B)GM17ΔT(无胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶的GM17，通过在GM17中使用thyA缺陷的乳酸乳球菌对胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶进行细菌耗竭、过滤及高压灭菌，以及重新加入葡萄糖制备)，在乳酸乳球菌MG1363(wt)或乳酸乳球菌Thy12(thyA缺陷)的情况下。
均分悬浮物并向每种悬浮物中的任一半加入胸腺嘧啶核苷至1μM。
将所有悬浮物均分至适当数量的小瓶中，并将这些小瓶在37℃(乳杆菌)或30℃(乳球菌)温育。仅开启小瓶一次，通过将适当的稀释液重复三次铺板确定每毫升菌落形成单位(cfu)。在此实验过程中，所有thyA缺陷菌株达到0cfu(即在用100μl 1∶1稀释液铺板的培养皿中，3个培养皿上有0个菌落)。TGB092在24h和48h后达到接近0cfu(当用100μl 1∶1稀释液铺板时，每个培养皿上最多只有1个菌落)，并且在使用0μM和1μM胸腺嘧啶核苷时分别在96h和72h后达到0cfu。
图7在存在胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的情况下野生型乳杆菌和ThyA突变体在29小时后的生长测量UCC118、TGB078和TGB092在MRS、含有200μM胸腺嘧啶核苷的MRS(MRSTd)或含有800μM胸腺嘧啶的MRS(MRSTm)中的600nm光密度(OD600)。MRS、MRSTd和MRSTm在37℃生长29小时后的OD600是0.000。
图8在存在浓度增加的胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的情况下，2种不同的乳杆菌ThyA突变体的生长曲线。
24小时的OD600相对于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的浓度作图。当在相同的浓度范围测量时，UCC118在24小时的OD600达到完全饱和，而不依赖于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶浓度。
图9在存在浓度增加的胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的情况下，2种不同的乳杆菌ThyA突变体的生长曲线在低浓度的详细情况。
24小时的OD600相对于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的浓度作图。当在相同的浓度范围测量时，UCC118在24小时的OD600达到完全饱和，而不依赖于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶浓度。
图10唾液乳杆菌UC118在不同浓度的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶中的生长(24小时的OD600)，显示所述突变体的缺乏生长不是由于胸腺嘧啶毒性所致。
实施例实施例中的材料和方法培养基除非另有说明，乳杆菌菌株在MRS(Merck)中培养。
本文所用特殊培养基是BM91升pH8.5的50mM CO3--缓冲液，补充有6g Na2HPO4/3g KH2PO4/1g NH4Cl/0.5g NaCl/1 mmol MgSO4/0.1mmol CaCl2/0.5％葡萄糖/0.5％酪胨(difco)MRSΔT(移除胸腺嘧啶核苷的MRS)MRS粉末(Merck)溶解于适当体积(基于生产商的说明)的蒸馏水。所得溶液加热至100℃，持续1分钟，并使其冷却至室温。每毫升加入1.2单位胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(SIGMA)。所得溶液在37℃温育20小时并接着进行高压灭菌。
菌株唾液乳杆菌UCC118(Dunne et al.，2001)用作受体菌株以构建thyA突变体。
实施例1thyA突变体的构建唾液乳杆菌thyA突变体的构建基本上如对乳酸乳球菌所描述的(Steidler et al.，2003)进行，同时进行一些修改。图1简述了所述构建。对唾液乳杆菌唾液亚种菌株UCC118的thyA区域进行测序，包括编码序列的上游和下游序列。了解这些序列对于对任何乳杆菌菌株通过下述途径进行遗传工程操作都是极其重要的，因为该策略将会利用在thyA 5’末端的1000bp区域和3’末端的1000bp区域内(“thyA靶”)进行的双重同源重组。
在菌株UCC118中，thyA基因被编码一种蛋白质的合成基因置换，所述蛋白质具有一个在乳杆菌中有功能的分泌信号，所述分泌信号与具有与hIL-10成熟部分相同的氨基酸序列(其中位点2的脯氨酸被丙氨酸置换)的蛋白质融合，所述合成基因与乳酸乳球菌thyA启动子(PthyA，GenBank AF462070)可操纵地连接。启动子与hIL-10基因的任何组合称为hIL-10表达盒。
通过电穿孔在1.5kV，25mF，400Ω，2mm间隙长度条件下进行转化。
基本上如Biwas et al.(1993)所述，通过同源重组进行thyA置换。如下所述得到thyA靶的质粒衍生形式的适当的置换。
所述策略涉及辅助质粒(helper plasmid)(携带氯霉素选择标记)，其已被预先导入靶乳杆菌菌株中，并涉及载体质粒(carrier plasmid)(携带红霉素抗性标记)，其编码侧翼具有染色体thyA基因的上游及下游序列的hIL-10表达盒，如上所述。
辅助质粒pTGB019是pVE6007的一种修饰形式。为了构建pTGB019，通过使用寡核苷酸GCGAAGCTTCAAATAGGGGTTCCGCGC和GCGACTAGTGGGAAAACTGTCCATACCC进行PCR扩增从pKD20中产生一个3221bp插入体并用HindIII和SpeI进行切割。所述片段编码在大肠杆菌阿拉伯糖启动子控制下的Redγ、β和exo基因，并被连接到HindIII-SpeI切开的pVE6007中。然而，这个表达系统显示在唾液乳杆菌中并不是功能性的。使用Western印迹检测，向携带myc标签标记的形式的各种RED重组酶基因的菌株中加入阿拉伯糖未显示任何表达；同样，使用通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行的细胞内蛋白质分析，携带pTGB019的乳杆菌也没有显示任何一种RED基因的表达。相反，所述插入体会使得与pVE6007相比，辅助质粒pTGB019在乳杆菌中的复制更加不稳定。
所述载体质粒被电穿孔导入具有pTGB019的乳杆菌菌株中。两个质粒不能稳定地共存。现在仍不清楚整合机制是如何发挥功能的。将电穿孔混和物铺板至含有10μg/ml红霉素和200μM胸腺嘧啶核苷的固体琼脂MRS培养皿中并在42℃温育24小时。
所述载体质粒不能在乳杆菌中复制。因此将红霉素抗性转移至特定菌株的唯一途径是在第一次同源重组发生时进行，所述同源重组在thyA靶的5’1000bp或3’1000bp进行。通过PCR检测红霉素阳性克隆以检测这种同源重组的发生，如图1所示。
一部分红霉素阳性克隆仍携带pTGB019。这些克隆被用于分离显示第二次交换的克隆。将适当的稀释液在42℃铺板至MRS固体琼脂培养皿上，筛选不能在无胸腺嘧啶核苷的MRS中生长的、具有上游及下游重组的以及不存在thyA基因的红霉素和氯霉素敏感克隆。
在thyA靶的3’1000bp或5’1000bp进行的第二次同源重组获得所希望的菌株。通过在不存在红霉素和存在50μg/ml胸腺嘧啶核苷的情况下进行重复生长选择第二次重组。用PCR检测克隆，如图1所示。
得到的菌株称为TGB078(人IL-10)和TGB092(可操纵地连接至thyA启动子的人IL-10)。
实施例2鉴别thyA-和IL-10+乳杆菌通过PCR初步确认thyA-和IL-10+携带hIL-10插入体的乳杆菌菌落由PCR检测初步确认，如图2所示。使用了几组引物以检测thyA(图2.1)、检测IL-10(图2.2)、检测IL-10的侧翼序列(图2.3-6)、以及检测thyA的侧翼序列(图2.7&8)。
结果很清楚地显示在突变菌株TGB072和TGB092中，thyA的编码序列已经被人IL-10序列置换。
表1使用的引物通过Southern印迹确认乳杆菌具有thyA-和IL-10+性质为了确认在基因组的其他位置不存在thyA或IL-10拷贝，用Southern印迹检测整合。从不同的乳杆菌菌株中制备基因组DNA。基因组乳杆菌DNA用EcoRI消化并进行Southern印迹。所述印迹用地高辛标记的探针检测以鉴别thyA(thyA探针，通过PCR引物对1获得)或hIL-10(hIL-10探针，通过PCR引物对2获得)。如同基于PCR结果所预测的，对于突变体，thyA探针信号呈阴性，印迹上的hIL-10探针信号呈阳性，而对于亲代菌株，thyA探针信号呈阳性，hIL-10信号呈阳性。结果总结于表2。
表2PCR片段的预期长度实施例3thyA-和IL-10+乳杆菌产生人IL-10为了评价hIL-10分泌，将每种菌株的单一菌落在补充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRS中生长。在37℃生长40小时后，离心收集细菌并重悬于补充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的缓冲的M9(BM9)。得到的悬浮液在37℃温育5小时，然后通过ELISA(Becton Dickinson)确定人IL-10的量。结果示于图4。包含人IL-10编码序列的两种菌株均产生IL-10，但是当人IL-10编码序列与乳酸乳球菌thyA启动子可操纵地连接时产量高很多。尽管hIL-10的产量低于所描述的乳酸乳球菌的产量(Steidler et al.，2003)，其产量对于在体内有效地治疗慢性肠炎而言仍是足够高的。
实施例4缺乏胸腺嘧啶核苷时的存活测试了两种突变菌株及亲代菌株在无胸腺嘧啶核苷的培养基中的存活。存活用作为时间的函数的每毫升培养基菌落形成单位(CFU)表示。结果示于图5和图6。
所有菌株的单一菌落接种于补充了25μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRSΔT中，在37℃温育20小时。离心收集细菌，用1V MRSΔT洗两次，重悬于1V MRSΔT中，在MRSΔT中以1∶20稀释并在37℃温育。在相应时间点通过在补充了50μg/ml胸腺嘧啶核苷的MRS固体琼脂培养皿上铺板确定每毫升CFU。
如同所显示的，500分钟之后CFU减少了超过2log单位。在不到1000分钟后CFU减少3log单位。这些结果远远优于Steidler et al.(2003)在乳酸乳球菌中获得的结果，即需要大约两倍的时间才能得到CFU减少2log单位，需要50小时才能得到CFU减少3log单位。
重要的是应当注意这些结果是在存在胸腺嘧啶的情况下得到的。事实上，通过将胸腺嘧啶核苷转变为胸腺嘧啶的酶处理从培养基中移除了胸腺嘧啶核苷。虽然有剩余浓度的胸腺嘧啶，但是胸腺嘧啶核苷饥饿诱导的死亡仍是极为迅速的，这表明所述菌株不能被胸腺嘧啶拯救。
实施例5乳杆菌ThyA突变体不能被胸腺嘧啶拯救唾液乳杆菌UCC118(thyA野生型)、TGB078和TGB092(两者都是thyA缺陷型)在MRS、含有200μM胸腺嘧啶核苷的MRS(MRSTd)或含有800μM胸腺嘧啶的MRS(MRSTm)中生长。
在37℃生长29小时后测量600nm光密度。
得到的数据(图7)显示UCC118达到相似的光密度，与生长培养基无关。MRS中的胸腺嘧啶核苷浓度限制了TGB078和TGB092的生长。当向MRS中加入200μM胸腺嘧啶核苷，TGB078和TGB092达到与UCC118相同的光密度。向MRS中加入800μM胸腺嘧啶不能支持TGB078和TGB092生长至更高的光密度。
如同图7中可见的，MRS含有相当量的胸腺嘧啶核苷。胸腺嘧啶核苷可被胸腺嘧啶核苷磷酸化酶转变为胸腺嘧啶。因此用胸腺嘧啶核苷磷酸化酶消化MRS产生MRSΔT。将唾液乳杆菌UCC118(thyA野生型)、TGB078和TGB092(两者都是thyA缺陷型)在MRSΔT中培养，其中加入不同浓度的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶。在37℃生长24小时后，培养物达到饱和。在24小时的OD600相对于胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶浓度作图(图8和图9)。
这些结果显示两种thyA缺陷菌株都可以利用外源胸腺嘧啶核苷而非胸腺嘧啶生长，然而野生型生长不受添加胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影响(图10)，证明缺乏生长不是由于胸腺嘧啶毒性。
参考文献-Ahmad，S.I.，Kirk，S.H.and Eisenstark，A.(1998)thymine metabolismand thymineless death in prokaryotes and eukaryotes.Annu.Rev.Microbiol.52，591-625.
-Biswas，I.，Gruss，A.，Ehrlich，S.D.et al.(1993)High-efficiency geneinactivation and replacement system for gram-positive bacteria.J.Bacteriol.175，3628-3635.
-Dunne C，O’Mahoney L，Murphy L，Thronton G，Morrissey D，O’Halloran S，Feeney M，Flynn S，Fitzgerald G，Daly C，Kiely B，O’Sullivan GC，Shanahan F(2001).In vitro selection criteria forprobiotic bacteria of human origincorrelation with in vivo findings.Am.J.Clin.Nutr.73 suppl，386S-392S.
-Fu，X.and Xu，J.G.(2000)Development of a chromosome-plasmidbalanced lethal system for Lactococcus acidophilus with ThyA gene asselective marker.Microbiol.Immunol.44，551-556.
-Goulian，M.，Bleile，B.M.，Dickey，L.M.，Grafstrom，RH.，Ingraham，H.A.，Neynaber，S.A.，Peterson，M.S.and Tseng，B.Y.(1986).Mechanism of thymineless death.Adv.Exp.Med.Biol.195 Pt B，89-95.-Kaplan，D.L.，Mello，C.，Sano，T.，Cantor，C.and Smith，C.(1999).Streptavadin-based containment system for genetically engineeredmicroorganisms.Biomol.Eng.31，135-140.
-Knudsen，S.，Saadbye，P.，Hansen，L.H.，Collier，A.，Jacobsen，B.L.，Schlundt，J.And Karlstrom，O.H.(1995).Development and testing ofimproved suicide functions for biological containment of bacteria.Appl.Environ.Microbiol.61，985-991.
-Molina，L.，Ramos，C.，Ronchel，M.C.，Molin，S.and Ramos，J.L.(1998).Construction of an efficient biologically contained pseudomonasputida strain and its survival in outdoor assays.Appl.Environ.Microbiol.64，2072-2078.
-Pinter，K.，Davisson，V.J.and Santi，D.V.(1988).Cloning，sequencing，and expression of the Lactococcus casei thymydilate synthase.DNA 7，235-241.
-Schweder，T.，Hofmann，K.And Hecker，M.(1995).Escherichia coliK12 relA strains as safe hosts for expression of recombinant DNA.Appl.Environ.Microbiol.42，718-723.
-Steidler，L.，Hans，W.，Schotte，L.，Neirynck，S.，Obermeier，F.，Falk，W.，Fier，W.and Remaut，E.(2000).Treatment of murine colitis byLactococcus lactis secreting Interleukin-10.Science 289，1352-1355.-Steidler，L.，Wells，J.M.，Raeymaekers，A.，Vandekerckhove，J.，Fiers，W.And Remaut，E.(1995).Secretion of biologically active murineInterleukin-2 by Lactococcus lactis subsp.Lactis.Appl.Environ.Microbiol.61，1627-1629.
-Steidler，L.，Neirynck，S.，Huyghebaert，N，Snoeck，V.，Vermeire，A.Goddeeris，B.，Cox，E.，Remon，J.P and Remaut，E.(2003).Biologicalcontainment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinaldelivery of human interleukin 10.Nature Biotech 21，785-789.
-Tedin，K.Witte，A.，Reisinger，G，Lubitz，W.and Basi，U.(1995).Evaluation of the E.coli ribosomal rrnB P1 promoter and phage derivedlysis genes for the use in biological containment systema concept study.J.Biotechnol.39，137-148.
-Maguin，E.，P.Duwat，T.Hege，D.Ehrlich，and A.Gruss.1992.Newthermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. J.Bacteriol.1745633-5638.
-Datsenko，K.A.and B.L.Wanner.2000.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 976640-6645.
权利要求
1.乳杆菌物种(Lactobacillus sp.)的分离的菌株，其包含缺陷的重组thyA基因，其中所述菌株的存活严格依赖于存在胸腺嘧啶核苷。
2.权利要求1的乳杆菌物种的分离的菌株，其中所述乳杆菌物种是唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。
3.权利要求1或2的乳杆菌物种的分离的菌株，其中所述乳杆菌物种是唾液乳杆菌唾液亚种菌株UCC118。
4.前述任一权利要求的乳杆菌物种的分离的菌株，其进一步的特征是在缺乏胸腺嘧啶核苷时存活力的初始降低为在16小时中降低至少2 log cfu。
5.前述任一权利要求的乳杆菌物种的分离的菌株在输送预防性和/或治疗性分子中的应用。
6.权利要求5的乳杆菌物种的分离的菌株的应用，其中所述输送在不能严格控制胸腺嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶浓度的情况下需要生物学遏制。
7.权利要求5或6的乳杆菌物种的分离的菌株的应用，其中所述预防性和/或治疗性分子是白介素10。
8.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项的乳杆菌物种的分离的菌株。
9.权利要求5-7任一项的乳杆菌物种的分离的菌株在制备药物中的应用。
10.权利要求5-7任一项的乳杆菌物种的分离的菌株在制备治疗炎性肠病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组乳杆菌(Lactobacillus)菌株，其具有在环境中受限制的生长和生存力。更特别地，本发明涉及一种只能在含有胸腺嘧啶核苷的培养基中存活的重组乳杆菌。由于这种对胸腺嘧啶核苷的严格依赖性，在此重组菌株中迅速诱导胸腺嘧啶核苷缺陷致死。一个优选的实施方案是一种乳杆菌，其只能在存在胸腺嘧啶核苷的宿主生物体中存活，但是在所述宿主生物体体外缺乏此培养基化合物时不能存活。进一步地，可以用预防性和/或治疗性分子转化所述乳杆菌菌株，从而可以将所述乳杆菌菌株用于治疗疾病，例如但不限于炎性肠病。
文档编号C12N9/10GK101052705SQ200580016028
公开日2007年10月10日 申请日期2005年5月18日 优先权日2004年5月18日
发明者洛塔尔·斯泰德勒尔, 萨拜因·内瑞恩克 申请人:佛兰芒语埋葬－大学生物技术研究所Vzw, 根特大学, 国立科克大学