肾酶(单胺氧化酶c)的检测、分离和应用的制作方法

专利名称：肾酶(单胺氧化酶c)的检测、分离和应用的制作方法
相关申请的交叉参考根据35 U.S.C.119(e)，本申请要求2004年3月19日提交的美国临时专利申请No.60/554,552和2004年10月1日提交的美国临时专利申请No.60/615,452的优先权，这两篇专利申请在此以其全文并入参考。
联邦政府资助的研究或开发的声明本发明部分由美国政府资金资助(国立卫生研究院基金号K08DK 0291702)，因此美国政府在本发明中享有一定权利。
背景技术：
调节液体和电解质代谢是肾脏的一个主要功能。血液通过肾小球进入肾脏，肾小球过滤出细胞和蛋白质并通过称为肾小球过滤的过程产生与血浆液体具有相同离子组成的液体。然后肾小球过滤液通过一系列独特的管状区室(segment)，进行性改变其体积和离子组成。已知许多因素调节肾小球过滤，包括物理力、局部和循环激素(Brenner etal.1976)。相似地，肾小管的重吸收和分泌通过相当复杂的调节过程而被修饰。
肾脏还作为内分泌器官，因为其是红细胞生成素的主要来源，红细胞生成素是红细胞祖细胞和前体扩增和终末分化所需的红细胞量的主要决定因素(Line et al.，1985；Jacobs et al.，1985)。另外，看起来肾脏还是肾素释放最重要的部位。血液流的降低、交感神经刺激的增加、或者输送至远端小管中的钠的减少均可刺激肾素释放，肾素是将血管紧张素原分解为血管紧张素I的一种酶。肾素—血管紧张素系统是液体和电解质代谢、血压和心脏功能的关键调节物。
在肾脏进行的这许多功能中，通过红细胞生成素的发现而了解了肾脏内分泌功能的重要性。有迹象提示肾脏除了分泌肾素和红细胞生成素之外还具有复杂的内分泌功能。鉴别先前未知的由肾脏分泌的蛋白质/激素不仅提供了对肾生理学更完全的了解，还可以显著改良治疗晚期肾脏疾病(ESRD)患者的方式。
患有晚期肾脏疾病的患者用肾脏替代疗法治疗，如腹膜透析或者血液透析，或者进行肾脏移植。目前对晚期肾脏疾病患者的肾脏替代疗法如血液透析是迄今为止唯一成功的长期离体(ex vivo)器官代替疗法。尽管透析成功延长了生命，但是与这种疗法相关的发病和死亡率还是很高，大多数患者的生命质量较差(Humes et al.，1995；Wolfe etal.1999)。例如，这些患者患有高血压、心血管疾病如无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭和动脉粥样硬化迹象增加，这些病症是导致死亡的最常见因素。尽管这些病症产生的原因还不完全清楚，但通常认为所述疗法不能复制天然器官的重要功能。所述疗法使用体外“人工肾”从血液除去过量的水和可溶废物，但是不能复制天然器官重要的吸收、代谢、内分泌和免疫功能。
本领域充分证明了ESRD患者具有产生心血管疾病的显著较高的危险，这种危险看起来与增加的氧化应激相关(Oberge et al.2004)及与提高的交感神经紧张性相关(Koomans et al.，2004；Joles et al.，2004)。尽管ESRD涉及多种蛋白质/激素，但是仅鉴别和鉴定了很少的参与ESRD的因子。然而，这些因子的鉴别对于ESRD及与肾分泌的蛋白质/激素相关的血管疾病的诊断和治疗进展是关键的。因此，长久以来需要鉴别和鉴定与ESRD相关的因子。
单胺氧化酶(MAO)是含有黄素-腺苷-二核苷酸(FAD)的酶，其将生物胺转变为其相应的醛。MAO以两种同种型存在(MAO-A(SEQ IDNO11)和MAO-B(SEQ ID NO13))，它们是不同的基因产物，呈现70％以上的序列相同性和在神经递质如多巴胺、5-羟色胺和去甲肾上腺素的分解代谢中呈现不同但重叠的底物特异性(2，3)。MAO-A和MAO-B均参与许多神经学病症，并且是治疗帕金森氏病和抑郁症的靶(4)。哺乳动物MAO与线粒体外膜结合，并且具有一FAD分子，该分子通过与半胱氨酸残基的8α-硫醚键而与所述蛋白质共价结合(5)。它们以组织依赖性和年龄依赖性两种方式表达，是广泛的临床和药理学研究对象。
MAO-A和MAO-B通过羧基末端锚定在线粒体外膜(Binda et al.，2002)。它们具有重叠的底物特异性，使神经递质如肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺发生分解代谢，并且被巴吉林和氯吉兰(clorgyline)特异性抑制。多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)，另一种已知含有FAD的氧化酶，是一种胞内氧化酶，其代谢精胺和亚精胺，并调节细胞生长(Jalkanen et al.，2001)。人MAO-B的晶体结构已经在3.0A分辨率下被揭示，表明是FAD辅因子与半胱氨酸侧链(Cys-397)共价结合的一种二聚体(Binda et al.，2002)。MAO-A和MAO-B由X染色体上毗邻但分离的基因编码，它们呈现70％以上的序列相同性以及在神经递质分解代谢中不同的但重叠的底物特异性。
MAO-A和MAO-B在组织分布、结构和底物特异性方面不同。MAO-A对5-羟色胺、真蛸胺、肾上腺素和去甲肾上腺素具有较高的亲和性；而MAO-B的天然底物是苯乙胺和酪胺。多巴胺被认为是由这两种同种型氧化的。MAO-A和MAO-B广泛分布于一些器官包括脑中(A.M.Cesura and A.Pletscher，Prog.Drug Research 1992，38，171-297)。脑MAO-B活性看起来随着年龄而增加。这种增加规因于与和老化相关的神经胶质增生(C.J.Fowler et al.，J.Neural.Transm.1980，49，1-20)。另外，MAO-B活性在阿尔茨海默氏病患者脑中显著较高(P.Dostert et al.，Biochem.Pharmacol.1989，38，555-561)，已经发现其在老年斑周围的星形胶质细胞中高度表达(Saura et al.，Neuroscience 1994，70，755-774)。关于这一点，由于MAO对伯单胺(primary monoamines)的氧化脱氨作用产生具有确定或潜在毒性的NH3、醛和H2O2，提示存在使用选择性MAO-B抑制剂治疗痴呆和帕金森氏病的理论根据。MAO-B的抑制导致多巴胺的酶失活作用降低，并因此延长了神经递质在多巴胺能神经元中的可利用性。与年龄及阿尔茨海默氏病和帕金森氏病相关的退行性过程也可以归结于由增加的MAO活性及随之发生的MAO-B所引起的H2O2形成增加而导致的氧化应激。因此，MAO-B抑制剂可通过在脑中降低氧自由基形成及增加单胺水平而起作用。
由于MAO-B参与上述神经学病症，因此有强烈的兴趣来获得可以控制这种酶活性的强选择性抑制剂。一些已知的MAO-B抑制剂的药理学例如由D.Bentue-Ferrer等在CNS Drugs 1996，6，217-236中论述。而不可逆和非选择性MAO抑制剂活性的主要限制是需要遵守规定饮食，因为当摄入饮食酪胺时可诱导高血压危象以及与其它药物相互作用的潜在危险(D.M.Gardner et al.，J.Clin.Psychiatry 1996，57，99-104)，这些不利情况在可逆的选择性MAO抑制剂、特别是MAO-B抑制剂不太常见。
通过抑制MAO活性，MAO抑制剂可调节在不同的脑部区域和机体中单胺及其神经递质释放的水平(包括多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺)。因此，MAO抑制剂可影响神经内分泌功能、呼吸、情绪、运动控制和功能、注视和注意力、注意力集中、记忆力和认知及滥用药物机制的调节。已经表明MAO抑制剂对注意、认知、食欲、滥用药物、记忆力、心血管功能、锥体束外功能、疼痛和胃肠蠕动和功能起作用。MAO在脑中的分布广泛，包括基底神经节、大脑皮质、边缘系统、及中脑和后脑细胞核。在外周组织，所述分布包括肌肉、胃肠道、心血管系统、自主神经节、肝脏、和内分泌系统。
通过其它抑制剂对MAO进行抑制已示出能增加脑和机体中单胺的含量。调节机体中单胺水平已表明在许多疾病包括抑郁、焦虑、应激障碍、与记忆功能相关的疾病、神经内分泌问题、心脏功能障碍、胃肠道障碍、饮食性疾病、高血压、帕金森氏病、记忆障碍和戒断症状中是有效的。
目前已经认为吸烟对单胺氧化酶(MAO)具有不可逆的抑制作用。Boulton et al.，″Biogenic Amine Adducts，Monoamine Oxidse Inhibitors，and Smoking，″Lancet，1(8577)114-155(Jan.16，1988)，报道了吸烟对MAO的抑制性质可有助于解释吸烟对于对抗帕金森氏病的保护作用，并且还观察到严重吸烟的精神疾病患者不经历不寻常比例的吸烟诱导的疾病。提示吸烟作为MAO抑制剂，可对抗引起帕金森氏病的多巴胺能神经毒性而起保护作用，并且吸烟对MAO的抑制作用可在精神疾病患者中产生抗抑郁作用。
发明概述在本发明之前，MAO-A和MAO-B是在人体中鉴别的仅有两种单胺氧化酶。当本发明人尝试使用人基因组数据库鉴别和鉴定人体中新的分泌蛋白时，鉴别了一种新的单胺氧化酶。本发明揭示了分泌形式的单胺氧化酶的鉴别和鉴定，所述单胺氧化酶代谢生物单胺如去甲肾上腺素、多巴胺和肾上腺素。由于新鉴别的单胺氧化酶是经鉴别在人体中代谢单胺的第三种酶，因此本发明人将其称作MAO-C。或者，因为其是一种由肾分泌的蛋白质，因此也被称作肾酶(renalase)。因为MAO-C或者肾酶是单胺氧化酶家族的一个新成员，因此也预期这种酶在脑中与MAO-A和MAO-B同样发挥重要作用。
本发明涉及编码称作肾酶的新的哺乳动物单胺氧化酶(MAO)的核酸(SEQ ID NO2)，所述肾酶是参与调节儿茶酚胺的一种新蛋白质。人肾酶的核酸序列与人MAO-A的核酸序列(SEQ ID NO10)具有27.7％的同源性，与MAO-B的核酸序列(SEQ ID NO12)具有38.2％的同源性。肾酶在氨基酸水平与MAO-A和MAO-B分别具有13％和12％的相同性。其还具有与MAO-A和MAO-B不同的底物特异性和抑制剂特征谱，表明其代表一类新的独特的含有FAD的单胺氧化酶。
人肾酶基因位于第10号染色体上，含有9个外显子并跨越大约300Kb。人肾酶基因编码一个342个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质含有氨基末端信号序列，随后是含有黄素-腺苷-二核苷酸(FAD)的结构域及一个氨基氧化酶结构域。组织Northern印迹研究表明肾酶在肾中强表达，而在所分析的所有其它组织中表达水平较低。原位杂交实验表明肾酶在近端和远端小管中高水平表达。
肾酶在体外转录和翻译实验中高水平表达。人肾酶cDNA被翻译产生一种分子量大约为38-kDa的蛋白质，这与预测的蛋白质大小一致。使用转染的HEK293细胞的条件培养基进行的Western印迹研究表明肾酶是一种分泌的蛋白质。肾酶在健康个体中以5-10mg/l浓度存在于血浆中。
晚期肾病(ESRD)与升高的儿茶酚胺水平相关，其随之导致许多病变、疾病和障碍，包括例如无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭和动脉粥样硬化。这些病变、疾病和障碍是导致ESRD患者死亡的常见因素。
肾酶以如下顺序代谢儿茶酚胺多巴胺＞肾上腺素＞去甲肾上腺素。肾酶在ESRD患者中实际上不可检测。因此，ESRD患者中肾酶丧失或水平降低至少与升高的血浆儿茶酚胺水平部分相关，导致心血管疾病增加，是ESRD患者死亡的常见因素。
另外，肾酶水平与肾功能之间的关联使得肾酶是诊断肾脏疾病的一种理想的诊断标记候选物，特别是对于在重症监护室中常发生的急性肾小管坏死。肾酶及其潜在的临床实用性的生物学意义在本文进一步讨论。
本发明提供了一种新的FAD依赖性胺氧化酶，其由肾分泌进血液中。其使血液循环中的儿茶酚胺代谢，尤其是血压和心率的一种有效的调节剂。另外，其在ESRD患者血浆中含量降低提示与升高的交感紧张及增加的心血管危险之间的因果关系，这在这种患者群中充分论证。肾酶的鉴别不仅是更详细了解心血管生理学的重要步骤，而且还是为肾病和/或心脏病及其相关并发症患者提供最佳治疗方案的重要步骤。
本发明包括编码多肽的分离的核酸分子，其中所述核酸分子与SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少大约或者高于大约40％的序列相同性。
本发明包括编码多肽的分离的核酸分子，其中所述核酸分子SEQID NO1所示核酸序列的第24-1049位核酸残基序列具有至少大约或者高于大约40％的序列相同性。
一方面，所述核酸进一步包含编码与之共价连接的标记多肽的核酸。
另一方面，所述核酸进一步包含代表与之可操纵地连接的启动子/调节序列的核酸。
再一方面，本发明包括一种载体，其包含编码多肽的分离的核酸，其中所述核酸与SEQ ID NO1所示序列具有至少大约或者高于大约40％的序列相同性。
另一方面，本发明包括一种重组细胞，其包含编码多肽的分离的核酸，其中所述核酸与SEQ ID NO1所示序列具有至少大约或者高于大约40％的序列相同性。
本发明包括与编码多肽的分离的核酸互补的分离的核酸或其片段，所述互补核酸是反义方向。
一方面，本发明的核酸与具有人肾酶序列(SEQ ID NO1)的核酸互补的核酸具有至少大约或者高于大约40％的序列相同性。
本发明包括分离的哺乳动物肾酶肽、多肽或蛋白质。
本发明包括一种分离的哺乳动物多肽，其中所述多肽包含与具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽具有至少大约或者高于大约15％相同性的氨基酸序列。
本发明还包括一种分离的多肽，其中所述多肽包含与具有SEQID NO2所示氨基酸序列的第24-342位氨基酸残基的多肽具有至少大约或者高于大约15％相同性的氨基酸序列。
本发明包括一种与哺乳动物肾酶特异性结合的抗体或其片段。所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或者合成的抗体。
本发明包括一种包含编码多肽的分离的核酸及一种药物可接受载体的组合物，其中所述核酸与SEQ ID NO1所示序列具有至少大约或者具有高于大约40％的相同性。
本发明包括一种组合物，其包含分离的哺乳动物肾酶多肽和一种药物可接受的载体。
本发明包括一种鉴别降低或者抑制人肾酶在细胞中表达的化合物的方法。所述方法包括将肾酶在其中表达的细胞与一种化合物接触，将人肾酶在与化合物接触的细胞中的表达水平与人肾酶在另外的相同细胞中的表达水平进行比较，其中人肾酶在与所述化合物接触的细胞中的表达水平低于其在未与所述化合物接触的另外的相同细胞中的表达水平表明所述化合物抑制人肾酶在细胞中表达。一方面，本发明包括通过这种方法鉴别的化合物，其中这种化合物是人肾酶的拮抗剂。
本发明还包括一种鉴别增强或者增加人肾酶在细胞中表达的方法。所述方法包括将肾酶在其中表达的细胞与一种化合物接触，将人肾酶在与化合物接触的细胞中的表达水平与人肾酶在另外的相同细胞中的表达水平进行比较，其中人肾酶在与所述化合物接触的细胞中的表达水平高于其在未与所述化合物接触的另外的相同细胞中的表达水平表明所述化合物增强或者增加人肾酶在细胞中表达。一方面，本发明包括通过这种方法鉴别的化合物，其中这种化合物是人肾酶的激动剂。
本发明包括一种治疗由人肾酶表达介导的病变、障碍或者疾病的方法。所述方法包括给予患有由人肾酶表达介导的病变、障碍或者疾病的人患者一种人肾酶表达抑制或者人肾酶表达降低量的肾酶抑制剂，从而治疗由人肾酶表达介导的病变、障碍或者疾病。
本发明的组合物和方法可用于治疗与生物体包括人的血管、心脏、肾脏、神经和/或内分泌系统相关的任何病变、障碍或者疾病。一方面，所述病变、障碍或者疾病选自ESRD、慢性肾脏疾病、高血压、心血管疾病如无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭、心律失常及动脉粥样硬化。
另一方面，所述肾酶抑制剂包含与编码人肾酶的分离的核酸互补的分离的核酸或其片段，所述互补核酸是反义方向。
本发明包括一种治疗哺乳动物高血压的方法，所述方法包括给予哺乳动物肾酶，从而治疗高血压。
本发明还包括一种治疗中枢神经系统(CNS)病变、障碍或者疾病的方法，所述病症包括但不限于痴呆、阿尔茨海默氏病、精神分裂症、精神病、抑郁、头痛、偏头痛或者紧张性头痛及癫痫；及治疗和/或预防CNS病症如重度抑郁症，包括两极抑郁(bipolar depression)，单相性抑郁，有或无精神病特征、紧张型精神分裂症特征、忧郁症特征、非典型特征或者产后发作的单一或者再发重度抑郁症发作的方法，治疗焦虑症和治疗恐慌症的方法。术语重度抑郁症涵盖的其它心境障碍包括早期和晚期发作的及有或无非典型特征的情绪恶劣性障碍、神经症性抑郁症、创伤后应激障碍及社交恐怖症；早期或晚期发作的阿尔茨海默氏病型痴呆，酒精、苯异丙胺、可卡因、致幻剂、吸入剂、鸦片、phecyclidine、镇静剂、催眠药、抗焦虑药及其它物质诱导的病症。
本发明进一步包括一种鉴别患有与肾酶表达改变相关的疾病、障碍或者病变的人患者的方法。所述方法包括检测人体中的肾酶表达水平，将肾酶在该人体中的表达水平与其在未患有与肾酶表达改变相关的疾病、障碍或病变的正常人体中的表达水平进行比较，从而检测患有与肾酶表达改变相关的疾病、障碍或者病变的人患者。
附图简述结合附图可以更好地理解本发明的前文概述以及如下的详细描述。为了例证本发明，示出了本发明优选的实施方案图示。然而，应理解本发明不限于所示的方式和手段。在图中

图1A是使用MGC 12474克隆作为探针对人体组织进行的Northern印迹分析。
图1B示出在肾酶中检测的推定的结构基序FAD黄素腺苷二核苷酸，SP信号肽。
图1C是与MAO-A相比较的推导的人肾酶氨基酸序列。
图1D是使用肾酶多克隆抗体对大鼠组织进行的Western印迹分析。
图2A示出人肾酶的cDNA及推导的氨基酸序列。方框范围内的氨基酸残基1-16据信编码信号肽。
图2B示出肾酶的基因组结构。
图2C是人MAO-A、MAO-B和MAO-C之间的序列对比。
图3A-3D示出肾酶在人肾脏和心脏中的亚细胞定位。
图3A是对人肾脏进行的原位杂交分析；左侧反义探针，放大200×，空心箭头指示肾小球，实心箭头指示近端小管；右侧放大100×的有义探针对照。
图3B是对人心脏进行的原位杂交分析；左侧反义探针，放大200×，空心箭头指示血管，实心箭头指示心室肌细胞；右侧有义探针对照。
图3C是在人肾脏中的免疫定位图像；左侧抗肾酶抗体，放大630×，实心箭头表示近端小管；右侧免疫前血清。
图3D是人心脏的免疫定位图像；左侧抗肾酶抗体，放大630×，空心箭头表示血管，实心箭头表示心室肌细胞；右侧免疫前血清。
图4A-4C示出大鼠肾酶-HA-标记的融合蛋白在HEK293细胞中的表达。
图4A示出肾酶的表达TAP片段的构建。
图4B是产生和纯化GST-肾酶融合蛋白的示意图。将来自细菌裂解粗产物的蛋白质(100μg)与纯化的GST-肾酶(10μg)在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，用考马斯蓝染色。泳道A细菌裂解粗产物；泳道B纯化的肾酶蛋白。
图4C示出肾酶活性的确定。将纯化的GST-肾酶融合蛋白(每个反应10μg)用于每个分析。在与多巴胺或者去甲肾上腺素(2mM终浓度)保温30分钟后，氨基氧化酶活性以任意荧光单位/10μg蛋白质表示。柱1对照蛋白质(GST)与多巴胺和去甲肾上腺素；柱2GST-肾酶与去甲肾上腺素；柱3GST-肾酶与多巴胺。
图5A-5B示出肾酶是一种分泌的蛋白质。
图5A是在用肾酶cDNA瞬时转染的HEK293细胞培养基中检测肾酶的示意图。
图5B是使用抗肾酶抗体对人血浆进行Western印迹分析的示意图，正常是指具有正常肾功能的个体，对照物是重组肾酶，ESRD表示接受血液透析的晚期肾病患者。
图6A-6C示出肾酶的酶活性和功能。
在图6A中，使用10μg GST-肾酶融合蛋白进行每个分析；胺氧化酶活性以任意荧光单位/10μg蛋白质表示；将底物(2mM)保温30分钟。
在图6B中，与图6A一样，使用1μM氯吉兰和1μM巴吉林。
图6C是亲和纯化的人肾酶的图。使用抗肾酶抗体从人尿液中分离蛋白质；泳道1人尿液，泳道2只具有二抗的对照。
图7A-7G示出肾酶的血液动力学作用；箭头指示注射肾酶的时间，时标为分钟，心率以每分钟搏动的次数(bpm)测量，收缩和舒张动脉血压以毫米汞柱(mmHg)表示。
图7A示出在以4μg/g体重进行IV推注之前和之后的心脏应答；箭头指示注射肾酶的时间；Vp＝左心室压力；HR＝心率；dP/dt＝左心室压力的变化速度，测量心脏收缩。
图7B是在注射肾酶之前和之后的压力—体积曲线。
图7C是图7A的一部分的放大图(见箭头所示)。HR心率，Vp左心室压力。
图7D是关于心脏收缩性的肾酶剂量—应答曲线。
图7E是关于平均动脉压的肾酶剂量—应答曲线。
图7F是肾酶活性对于血浆肾上腺素的时程。
图7G是肾酶活性对于血浆去甲肾上腺素的时程。
发明详述本发明引用的所有出版物和专利申请均与特异分别指出并入参考的各个出版物及专利申请一样并入本文作参考。
如下描述包括可用于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或者与请求保护的本发明相关，或者任何特别或暗示参考的出版物是现有技术。
除非另外说明，本发明使用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员通常了解的相同含义。尽管在实施或者测试本发明中可以使用与本文所述相似或相当的任何方法和材料，但优选本文所描述的方法和材料。
本发明揭示的数据不除外受体相互作用，数据表明肾酶在降解循的儿茶酚胺如去甲肾上腺素、多巴胺和肾上腺素中起作用，这些是肾、心脏和血管功能的重要调节物。如本文别处更充分的描述，肾酶因此在作为激素调节其它组织和/或器官的功能中起作用。这还包括神经系统，因为其功能也是部分由儿茶酚胺介导的。因此，可以例如为不能产生足够量肾酶的患者提供肾酶。肾酶的鉴别可以参与研发用于例如晚期肾病(ESRD)的治疗方法和诊断方法以治疗/预防高血压、心血管疾病如无症状型左心室障碍、慢性充血性心力衰竭和动脉粥样硬化。
与广泛用于治疗贫血患者的重组蛋白—红细胞生成素(EPO)相似，肾酶是一种分泌的蛋白质并且在肾中表达。肾酶的另一个显著特征是与EPO相同，在ESRD患者中实际上不可检测，肾酶在健康个体血液中以大约5-10mg/L的浓度表达。
本发明揭示的数据表明代谢儿茶酚胺的一种新的酶的存在。除了扩大MAO的范例之外，这种新发现的酶对于例如ESRD患者具有显著的临床意义。补充肾酶水平以抵消肾酶底物(即儿茶酚胺)的过量水平的方案是治疗ESRD患者的合理方法。另外，无论肾功能状态如何，由过量的儿茶酚胺水平导致的任何其它疾病均可以通过加入补足或者补充量的肾酶而治疗。
或者，肾酶可以用作药物靶位以提高交感紧张降低的患者的循环儿茶酚胺水平，并因此改良某些心血管并发症的结果。肾酶也可以用于设计对于MAO-A或MAO-B更特异的药物，因为目前的MAO抑制剂也许无意中也靶向肾酶，导致不利的副作用。
肾酶的鉴别和鉴定提供了进一步研究肾酶及其在心血管疾病的病理生理学中作用的框架，所述疾病如慢性心力衰竭(CHF)、心肌梗塞(MI)、心律失常，因为这些疾病可以由增加交感神经刺激的突然情绪应激而产生(Wittstein et al.，(2005)Neurohumoral features ofmyocardial stunning due to sudden emotional stress，New EnglandJournal of Medicine，3 52，539-548)。也许更重要地，与MAO-A和-B一样，肾酶可提供调节人体交感神经活性的潜在的有用靶位。
除了其潜在的治疗作用之外，肾酶可用作急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或者ATN，这是一种肾脏缺血性病变)的诊断标记物。如上所述，不具有正常肾功能的患者具有较低水平的肾酶。
本发明还包括诊断对于心血管、心脏、肾脏和精神相关病变、障碍和疾病的易感性的方法，所述方法基于肾酶基因表达和酶活性的测定。例如，心血管病变、障碍和疾病如高血压、无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律失常和动脉粥样硬化；精神病变、障碍和疾病如抑郁和焦虑症；及心脏病变、障碍和疾病如肺动脉高血压，均可以通过确定肾酶基因表达水平、肾酶蛋白质水平和/或肾酶酶活性而诊断、评价和监测。例如，肾酶基因的表达水平降低是与交感神经输出增加相关的病症的诊断标记物。
本发明的组合物和方法可用于治疗、预防、降低或者改善高血压，包括收缩期高血压、孤立性收缩期高血压和糖尿病高血压。此外，预期对更罕见的高血压病症—肺动脉高血压具有相同的益处。肺动脉高血压是一种罕见的肺血管病症，其中肺动脉(引导血液从心至肺的血管)的压力高于正常水平，并且危及生命。在肺床(pulmonary bed)中血压升高与糖尿病高血压和孤立性收缩期高血压中体循环血压的升高的相似性，提示其包含相似的机制。
定义如本文所用，如下每个术语具有与其在这一节中相关的含义。
文中“一个”是指一或多个(即至少一个)。例如，“一个元件”是指一个或者多个元件。
如本文所用，术语“相邻”是指核苷酸之间无间隔而彼此直接连接的核苷酸序列。例如，当五核苷酸5′-AAAAA-3′与三核苷酸5′-TTT-3′以5′-AAAAATTT-3′或者5′-TTTAAAAA-3′这样的方式连接时，这两个核苷酸是相邻的，但是以5′-AAAAACTTT-3′这样的方式连接时则是不相邻的。
如本文所用，氨基酸是以其全称、相应的三字母代码、或者相应的单字母代码表示，如下表所示全称三字母代码单字母代码天冬氨酸Asp D谷氨酸 Glu E赖氨酸 Lys K精氨酸 Arg R组氨酸 His H酪氨酸 Tyr Y半胱氨酸Cys C天冬酰胺Asn N谷氨酰胺Gln Q丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T甘氨酸 Gly G丙氨酸 Ala A缬氨酸 Val V亮氨酸 Leu L异亮氨酸Ile I甲硫氨酸Met M脯氨酸 Pro P苯丙氨酸Phe F
色氨酸 TrpW如本文所用，使疾病、障碍或者病变“减轻”是指降低所述疾病、障碍或者病变的一或多个症状的严重程度。这可以包括但不限于与在进行所述治疗方法之前或者未进行所述治疗方法的患者的肾酶水平相比较，提高在细胞或者组织(例如平滑肌细胞、肺组织、动脉)中表达的肾酶水平，降低或者提高患者体内肾酶水平等等。
“反义”特别是指编码蛋白质的双链DNA分子的非编码链的核酸序列，或者与所述非编码链基本上同源的序列。如本文所限定，反义序列与编码蛋白质的双链DNA分子的序列互补。反义序列不是必需只与所述DNA分子编码链的编码部分互补。反义序列可以与编码蛋白质的DNA分子编码链上指定的控制编码序列的表达的调节序列互补。
本文所用术语“供料器”是指用于将本发明的肾酶核酸、蛋白质和/或组合物给予哺乳动物的任何装置，包括但不限于皮下注射器、移液管、支气管镜、喷雾器等等。
本文所用术语“生物学样品”是指得自动物的样品，其可用于评定肾酶的表达水平、肾酶蛋白质存在水平或者这两者。这种样品包括但不限于血管(例如颈动脉、主动脉等等)样品、肺组织样品和SMC样品。
与“编码肾酶的部分或者全部核酸互补”是指不编码肾酶蛋白的核酸序列。相反，在细胞中表达的序列与编码肾酶蛋白的核酸非编码链相同，并因此不编码肾酶蛋白。
如本文所用，术语“互补”和“反义”不是完全同义的。“反义”特指编码蛋白质的双链DNA分子的非编码链的核酸序列，或者与非编码链基本上同源的序列。
本文所用术语“互补”是指广义的两个核酸例如两个DNA分子之间的亚单位序列互补性。当两个分子中的核苷酸位置由通常能彼此碱基配对的核苷酸占据时，则认为在这个位置的核酸是彼此互补的。因此，当每个分子中相当数目(至少50％)的相应位置由通常彼此碱基配对(例如A∶T和G∶C核苷酸对)的核苷酸占据时，这两个核酸是彼此互补的。如本文规定，反义序列与编码蛋白质的双链DNA分子序列互补。反义序列不是必需只与DNA分子编码链的编码部分互补。反义序列可以与编码蛋白质的DNA分子编码链上指定的调节序列互补，所述调节序列控制编码序列的表达。
基因的“编码区”由基因编码链的核苷酸残基及基因非编码链的核苷酸组成，其与通过基因转录产生的mRNA分子的编码区分别同源或者互补。
mRNA分子的“编码区”也由mRNA分子的核苷酸残基组成，其与在mRNA分子翻译期间转移RNA分子的反密码子区域匹配或者编码终止密码子。编码区因此可包括相应于在所述mRNA分子编码的成熟蛋白质中不存在的氨基酸残基(例如蛋白质输出信号序列的氨基酸残基)的核苷酸残基。
“编码”是指多核苷酸中核苷酸的特异性序列如基因、cDNA或者mRNA在具有限定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或者限定氨基酸序列的生物学过程中，作为模板合成其它聚合物和大分子的固有性质及从中产生的生物学性质。因此，如果在细胞或者其它生物系统中相应于基因的mRNA转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。两条编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同，并通常在序列表中提供，非编码链用作转录基因或cDNA的模板，可以称作编码蛋白质或者该基因或cDNA的其它产物。
除非特别说明，则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此的简并形式及编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与被表达的核苷酸序列可操纵地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件以进行表达；进行表达的其它元件可由宿主细胞或者在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或者包含于脂质体中)和病毒(例如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本文关于本发明的病毒基因治疗载体所用术语“复制缺陷”是指所述病毒载体不能独立地进一步复制和包装其基因组。例如，当用rAAV病毒粒体感染对象的细胞时，异源基因在感染的细胞中表达，然而由于感染的细胞缺少AAV rep和cap基因及附加的功能基因，因此rAAV不能复制。
如本文所用，“逆转录病毒转移载体”是指一种表达载体，其包含编码转基因的核苷酸序列，并进一步包含包装载体必需的核苷酸序列。优选地，逆转录病毒转移载体还包含在细胞中表达转基因必需的序列。
如本文所用，“包装系统”是指一系列病毒构建体，其包含编码参与包装重组病毒的病毒蛋白质的基因。典型地，包装系统的构建体最后掺入包装细胞中。
如本文所用，“二代”慢病毒载体系统是指缺乏功能性附加基因的慢病毒包装系统，如其中附加基因vif、vpr、vpu和nef之一已经缺失或者失活。见例如Zufferey et al.，1997，Nat.Biotechnol.15871-875。
如本文所用，“三代”慢病毒载体系统是指具有二代载体系统特征，并进一步缺乏功能性tat基因的慢病毒包装系统，如其中tat基因已经缺失或者失活。典型地，编码rev的基因在一个单独的表达构建体上提供。见例如Dull et al.，1998，J.Virol.72(11)8463-8471所述。
如本文所用，“假型(pseudotyped)”是指用异源或者功能修饰的包膜蛋白置换天然的包膜蛋白。
如本文所用，“离体给予(ex vivo administration)”是指一种方法，其中从对象取原代细胞，将载体给予细胞以产生转导的、感染的或者转染的重组细胞，将该重组细胞再次给予相同或不同的个体。
寡核苷酸的第一个区域与寡核苷酸的第二个区域如果彼此相邻或者由不超过大约1000个核苷酸残基、优选不超过大约100个核苷酸残基间隔，则第一个区域在第二个区域的“侧翼”。
如本文所用，用于核酸序列或者核酸分子的术语“片段”是指参考全长核酸序列或分子的一个节段或者一部分，其中所述片段小于所述参考核酸序列或分子的全长。片段核酸序列或分子的一个例子分别是全长肾酶cDNA序列或分子的一个节段或一部分。片段核酸序列或分子的另一个例子分别是全长基因组肾酶DNA序列或分子的一个节段或一部分。片段可以是小于全长自然或者天然cDNA或基因的任何长度。片段的例子包括长度为至少大约20、50、50-100、100-200、200-300、300-350、350-500、500-600、600-650、650-800或者至少大约800-1000个核苷酸的核酸。
如本文所用，用于氨基酸序列或者氨基酸分子的术语“片段”是指参考全长氨基酸序列或者分子的一个节段或者一部分，其中所述片段小于参考氨基酸序列或者分子全长。片段氨基酸序列或者分子的例子是分别由全长肾酶cDNA序列或者分子编码的多肽的一个节段或者一部分。片段氨基酸序列或者分子的另一个例子是分别由全长基因组肾酶DNA序列或者分子编码的多肽的一个节段或者一部分。片段可以是小于由自然或天然cDNA或者基因编码的全长多肽的任何长度的多肽。片段的例子包括长度为至少大约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、或者至少大约340个氨基酸。
“基因组DNA”是具有与基因同源的核苷酸序列的DNA链。例如，通过哺乳动物mRNA的逆转录产生的染色体和cDNA的片段均是基因组DNA。
如本文所用，“同源”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或者两个RNA分子之间，或者两个多肽分子之间的亚单位序列相似性。当两个分子中一个亚单位位置均被相同的单体亚单位占据时，例如如果两个DNA分子中的一个位置均由腺嘌呤占据，则这两个分子在这个位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或者同源位置数目的直接函数，例如如果两个化合物序列中一半位置(例如长度为10个亚单位的聚合物中有5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的，如果90％的位置(例如10个位置中有9个)是匹配或同源的，则这两个序列呈现90％同源性。例如，DNA序列3′ATTGCC5′与3′TATGGC呈现50％同源性。
如本文所用，“同源性”与“相同性”同义互用。另外，当术语“同源性”或者“相同性”在本文用于描述核酸或者蛋白质时，应解释为在核酸和氨基酸序列水平的同源性或者相同性。如果第一种寡核苷酸与第二种寡核苷酸在只有彼此至少大约60％、优选至少大约65％、更优选至少大约70％、80％、90％、或者95％互补的条件下退火，则这两个寡核苷酸“高度严格”或者“在高度严格条件下”退火。用于退火两个寡核苷酸的条件的严格性是温度、退火介质的离子强度、保温时间、寡核苷酸的长度、寡核苷酸的G-C含量及两个寡核苷酸之间预期的非同源性程度(如果已知的话)的函数。本领域已知调节退火条件严格性的方法(见例如Sambrook et al.，1989，InMolecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York)。
两个核苷酸或者氨基酸序列之间相同性百分比的确定可以使用数学算法完成。例如，用于比较两个序列的一个数学算法是Karlin和Altschul算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268)，经Karlin和Altschul加以修改(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)。这个算法整合进Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(1990，J.Mol.Biol.215403-410)，可以在例如国立卫生研究院(NIH)的国家医学图书馆(NLM)国家生物技术信息中心(NCBI)万维网站的BLAST站点获得。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST程序(在NCBI网站称作blastn)进行，使用如下参数gap penalty＝5；gapextension penalty＝2；mismatch penalty＝3；match reward＝1；expectationvalue 10.0；word size＝11，以获得与本文所述核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以使用XBLAST程序(在NCBI网站称作blastn)或者NCBI“blastp”程序进行，使用如下参数expectation value 10.0，BLOSUM62 scoring matrix，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。
为了获得有缺口的序列排列以进行对比，可以利用Altschul等所述的Gapped BLAST(1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)。或者，可以使用PSI-Blast或者PHI-Blast进行循环搜索，检测分子之间的远缘关系和呈现共同模式的分子之间的关系。当利用BLAST、GappedBLAST、PSI-Blast和PHI-Blast程序时，可以使用在国立卫生研究院的国家医学图书馆的国家生物技术信息中心网站上获得的各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
两个序列之间的相同性百分比可以使用与上述那些技术相似的技术确定，有或无缺口。在计算相同性百分比中，典型地计数精确匹配。
如本文所用，术语“基因”或者“重组基因”是指包含编码本发明多肽的开放读框的核酸分子。这种天然的等位基因变化可以典型地导致特定基因核苷酸序列中1-5％的变化。备选的等位基因可通过对众多不同个体中感兴趣基因进行测序而鉴别。这可以使用杂交探针进行，以鉴别众多个体中的相同基因座。任何及所有这种核苷酸变化及由于天然等位基因变化所得的、及不改变功能活性的氨基酸多态性或变化均包含在本发明范围内。
此外，编码其它物种的本发明蛋白质的核酸分子(同系物)，具有与本文所述小鼠蛋白质不同的核苷酸序列，其也在本发明的范围内。相应于本发明cDNA的天然等位基因变体和同系物的核酸分子可以基于其与小鼠核酸分子的相同性而分离，使用小鼠cDNA或其一部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下进行。例如，编码本发明大鼠肾酶蛋白的核酸同系物可以基于其与编码所有或部分大鼠和/或人肾酶的核酸分子在高度严格条件下的杂交而分离。
“分离的核酸”是指已经从在天然状态下在其侧翼的序列中分离的核酸节段或者片段，例如从通常与该片段相邻的序列，例如从在天然发生的基因组中与该片段相邻的序列中分离的DNA片段。该术语还用于描述基本上从天然与核酸伴随的其它成分，例如RNA或DNA或蛋白质中纯化的核酸。该术语还包括例如重组DNA，其被掺入载体、自主复制的质粒或病毒、或者掺入原核细胞或真核细胞的基因组DNA中，或者以独立于其它序列之外的单独分子存在(例如通过PCR或者限制酶消化产生的cDNA或者基因组或者cDNA片段)。该术语还包括是编码另外的多肽序列的杂种基因的一部分的重组DNA。
在本发明中，使用如下缩写代表普遍存在的核酸碱基A是指腺苷，C是指胞苷，G是指鸟苷，T是指胸苷，U是指尿苷。
两个多核苷酸是“可操纵地连接”是指单链或者双链核酸部分包含在该核酸部分中以这样的方式排列的两个多核苷酸，所述方式是两个多核苷酸中至少一个能对另一个发挥生理学作用。例如，与基因的编码区可操纵地连接的启动子能促进该编码区的转录。优选地，当编码所需蛋白质的核酸进一步包含一个启动子/调节序列时，该启动子/调节序列位于所需蛋白质编码序列的5’末端，由此其驱动所需蛋白质在细胞中表达。总之，编码所需蛋白质的核酸及其启动子/调节序列包含一个“转基因”。两个多肽非必需彼此相邻以可操纵地连接。
如本文所用，术语“启动子/调节序列”是指与启动子/调节序列可操纵地连接的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况中，这个序列可以是核心启动子序列，在其它情况中，这个序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列及其它调节元件。启动子/调节序列可例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
“组成型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操纵地连接时，在细胞的大多数或者所有生理条件下使所述基因产物在活的人体细胞中产生。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操纵地连接时，只有当相应于启动子的诱导剂存在于细胞中时，使基因产物在活的人体细胞中产生。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操纵地连接时，只有在细胞是相应于启动子的组织类型的细胞时，使基因产物在活的人体细胞中产生。
“聚腺苷酸化序列”是一个多核苷酸序列，其指导polyA尾加入转录的信使RNA序列上。
“多核苷酸”是指单链或者平行和反平行核酸链。因此，多核苷酸可以是单链或者双链核酸。
术语“核酸”典型是指大的多核苷酸。
术语“寡核苷酸”典型是指短的多核苷酸，通常不超过大约50个核苷酸。应理解当核苷酸序列以DNA序列表示时(即A、T、G、C)，也包括其中U置换T的RNA序列(即A、U、G、C)。
本文使用常规的表示法描述多核苷酸序列单链多核苷酸序列的左侧末端是5’末端，双链多核苷酸序列的左侧方向是5’方向。
以5’-3’方向将核苷酸加入新生的RNA转录物中是指转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链称作“编码链”；DNA链上位于DNA上参考点5’端的序列称作“上游序列”；DNA链上DNA上参考点的3’端的序列称作“下游序列”。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指有效治疗病变、障碍或疾病的药剂的数量。
多核苷酸的“一部分”是指多核苷酸的至少大约20个连续核苷酸残基。应理解多核苷酸的一部分可包括该多核苷酸的每个核苷酸残基。
“引物”是指这样的多核苷酸，其能与指定的多核苷酸模板特异性杂交，并提供合成互补多核苷酸的起始点。当多核苷酸引物在诱导合成的条件下放置时，发生这种合成，所述条件即存在核苷酸、互补多核苷酸模板、及进行聚合的制剂如DNA聚合酶。引物典型是单链的，但也可以是双链的。引物典型是脱氧核糖核酸，但可以使用众多的合成和天然发生的引物。引物与指定与之杂交的模板互补，作为合成起始位点，但是不需要反映模板的精确序列。在这种情况中，引物与模板的特异性杂交依赖于杂交条件的严格性。引物可以用例如生色团、放射性或荧光部分标记，并用作可检测部分。
“探针”是指能与指定的另一个多核苷酸序列特异性杂交的多核苷酸。探针与靶互补多核苷酸特异性杂交，但是不需要反映模板的精确互补序列。在这种情况中，探针与靶的特异性杂交依赖于杂交条件的严格性。探针可以用例如生色团、放射性或荧光部分标记并用作可检测部分。
“肾酶抑制剂”是指一种化合物，当与没有所述化合物的另外相同的细胞或组织中肾酶水平相比较时，该化合物可检测地抑制细胞或组织中肾酶的水平。肾酶的水平包括但不限于编码该分子的核酸的表达水平，可检测的肾酶水平，和/或肾酶活性的水平。肾酶抑制剂包括但不限于化学化合物、辅因子、抗体、核酶、反义分子、核酸等等。
“重组多核苷酸”是指具有非天然结合在一起的序列的多核苷酸。扩增的或装配的重组多核苷酸可以包括在合适的载体中，该载体可用于转化合适的宿主细胞。重组多核苷酸可提供非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等等)。
“重组多肽”是基于重组多核苷酸表达产生的多肽。
“多肽”是指通过肽键连接由氨基酸残基、相关的天然发生的结构变体及其合成的非天然发生的类似物组成的聚合物，其相关的天然发生的结构变体，及其合成的非天然发生的类似物。合成的多肽可例如使用自动多肽合成仪合成。
术语“蛋白质”典型是指大的多肽。
术语“肽”典型是指短的多肽。本文使用常规的表示法描述多肽序列多肽序列的左侧末端是氨基末端，多肽序列的右侧末端是羧基末端。
如本文所用，术语“肾酶(renalase)”是指由肾分泌的新的单胺氧化酶，其代谢生物单胺如多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素。本发明揭示的肾酶分子是一类包括与本发明揭示的其它多肽具有高和/或显著序列相同性的那些分子。更特别地，推定的肾酶与具有SEQ IDNO1所示序列的核酸具有至少大约40％序列相同性。更优选地，编码肾酶的核酸与SEQ ID NO1所示序列具有至少大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者至少大约99％序列相同性。更优选地，所述核酸是SEQ ID NO1。
术语“肾酶”还包括肾酶同种型。肾酶基因在人基因组10号染色体中含有跨越310188bp的9个外显子。本发明揭示的肾酶克隆(SEQ ID NO1，GenBank登记号BC005364)是含有外显子1、2、3、4、5、6、8的基因。在人基因组数据库中有至少两种另外的可变剪接形式的肾酶蛋白。一种可变剪接形式含有外显子1、2、3、4、5、6、9，通过在人基因组数据库中登记号为GenBank登记号AK002080(SEQ ID NO3)和NM_018363(SEQ ID NO4)的克隆鉴别。另一种可变剪接形式含有外显子5、6、7、8，通过人基因组数据库中GenBank登记号BX648154(SEQ ID NO5)的克隆鉴别。
除非特别说明，则“肾酶”涵盖所有已知肾酶(例如大鼠肾酶和人肾酶)，及将被发现的肾酶，包括但不限于具有本发明揭示的肾酶的特性和/或物理特征的小鼠肾酶和黑猩猩肾酶。
“限制位点”是由限制性核酸内切酶识别的双链核酸的一部分。当核酸与核酸内切酶接触时，如果核酸内切酶在所述部分能够切割所述核酸的两条链，则双链核酸的该部分由限制性核酸内切酶“识别”。
如本文所用，术语“特异性结合”是指一种化合物例如蛋白质、核酸、抗体等识别并特异性结合一个特异性分子，但基本上不识别或结合样品中其它分子。
如果第一种寡核苷酸与第二种寡核苷酸在只有彼此至少大约70％、或者至少大约73％、更优选至少大约75％、80％、85％、90％或者至少大约95％互补的条件下退火，则这两个寡核苷酸“高度严格”退火。用于退火两个寡核苷酸的条件的严格性是温度、退火培养基的离子强度、保温时间、寡核苷酸的长度、寡核苷酸的G-C含量及两个寡核苷酸之间预期的非同源程度(如果已知的话)的函数。本领域已知调节退火条件严格性的方法(见例如Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York)。
如本文所用，术语“转基因”是指外源核酸序列，该外源核酸由转基因细胞或哺乳动物编码。
“重组细胞”是包含转基因的细胞。这种细胞可以是真核细胞或者原核细胞。另外，转基因细胞涵盖但不限于包含转基因的胚胎干细胞，得自衍生自转基因ES细胞的嵌合哺乳动物的细胞(该细胞包含转基因)，得自转基因哺乳动物或其胎儿或胎盘组织的细胞，及包含转基因的原核细胞。
术语“外源核酸”是指使用便于将核酸导入细胞或动物中的技术导入细胞或动物中的核酸。
“标记”多肽是指这样的任何蛋白质，当其通过肽键与感兴趣的蛋白质连接时其可用于定位该蛋白质、将其从细胞提取物中纯化、将其固定以用于结合分析中、或者另外研究其生物学性质和/或功能。
如本文所用，术语“转基因哺乳动物”是指其细胞包含外源核酸的哺乳动物。所述外源核酸可以或者未整合进哺乳动物的基因组中。
如本文所用，“治疗”是指降低ESRD、高血压、心血管疾病、精神疾病等患者的症状的发生频率、程度、严重性和/或持续时间。
如本文所用，术语“载体”是指编码外源核酸的任何质粒或者病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移进病毒体或细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如多赖氨酸化合物等等。载体可以是适合作为运输载体将肾酶蛋白或者编码哺乳动物肾酶的核酸运送至患者的病毒载体，或者可以是适于同样目的的非病毒载体。
将DNA运送至细胞和组织的病毒和非病毒载体的例子为本领域所熟知，例如Ma等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9412744-12746)所描述。病毒载体的例子包括但不限于重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺伴随病毒、重组禽痘病毒等等(Cranage et al.，1986，EMBO J.53057-3063；1994年8月18日公布的国际专利申请WO94/17810；1994年10月27日公布的国际专利申请WO94/23744)。非病毒载体的例子包括但不限于脂质体、DNA的多胺衍生物等等。
如本文所用，术语“敲除靶向载体”是指一种载体，其包含两个核酸序列，每个序列均与在感兴趣的靶序列两侧的、要被缺失或者由另一个核酸序列置换的核酸区域互补。这两个核酸序列因此位于靶序列两侧，通过同源重组方法而被除去。
如本文所用，术语“慢性肾病”是指3个月以上的肾脏损害，特征在于结构和功能异常，有或无降低的肾小球滤过率(GFR)，或者GFR为60mL/分钟/1.73m2或者更低，有或无肾脏损害。GFR是测定肾脏过滤血液能力的指标，其可以连续赋分表示。GFR可以通过血清肌酸酐、体重和年龄估计。
如本文所用，术语“晚期肾病(ESRD)”是指肾脏完全或者接近完全不能发挥排泄废物、浓缩尿液及调节电解质的功能。当慢性肾衰竭进展到肾只能发挥其10％以下能力的阶段时发生晚期肾病(ESRD)。在这个阶段，肾的功能如此低，以至于不能进行透析或者肾脏移植，出现多种严重并发症，由于机体内液体和废物的积聚而发生死亡。
描述I.分离的核酸A.有义核酸本发明包括编码哺乳动物肾表达的分子，肾酶的分离的核酸或其片段，其中所述核酸与具有SEQ ID NO1所示序列的至少一种核酸具有至少大约40％的相同性。或者，所述核酸与本文揭示的SEQ IDNO1序列具有至少大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者至少大约99％同源。在一个实施方案中，所述核酸序列或分子具有SEQ ID NO1所示序列。
另一方面，本发明包括编码哺乳动物肾酶的分离的核酸或其片段，其中由所述核酸编码的蛋白质与SEQ ID NO2所示氨基酸序列具有大约15％以上的同源性。序列排列对比研究表明肾酶与单胺氧化酶A具有13.2％的氨基酸相同性。
优选地，由编码肾酶的分离的核酸编码的蛋白质与SEQ ID NO2所示序列至少大约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者至少大约99％同源。在一个实施方案中，由所述核酸编码的肾酶多肽具有SEQ ID NO2所示序列。如本发明所揭示，SEQ ID NO1的核酸可以被翻译产生包含342个氨基酸的人肾酶蛋白，计算分子量为37.8kDa。
本发明不应被解释为仅限于本文揭示的核酸和氨基酸序列。借助于本发明，本领域技术人员易于意识到可以获得编码如其它哺乳动物(例如猿、长臂猿、牛、绵羊、马、猪、犬、猫、鼠等等)物种中存在的肾酶多肽的其它核酸，通过本发明在实验章节详细描述的分离编码肾酶多肽的大鼠及人肾酶核酸方法(例如筛选基因组或cDNA文库)，及本领域熟知的方法(例如使用mRNA样品的逆转录PCR)和揭示的方法进行。
另外，许多方法可用于产生肾酶的突变体、衍生物或者变体形式，使用本领域熟知的重组DNA方法进行，例如Sambrook et al.(1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)和Ausubel et al.(1997，Current Protocols inMolecular Biology，Green & Wiley，New York)所描述的方法。
通过改变编码多肽的DNA序列而在蛋白质或多肽中导入氨基酸改变的方法为本领域所熟知，也由Sambrook等(1989，如前)和Ausubel等(1997，如前)描述。
本发明进一步包括编码哺乳动物肾酶的核酸，其中编码标记多肽的核酸与之共价连接。也就是说，本发明涵盖一种嵌合核酸，其中编码标记多肽的核酸序列与编码至少一种人肾酶的核酸共价连接。这种标记多肽为本领域所熟知，包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、流感病毒血凝素标记多肽、myc、myc-丙酮酸激酶(myc-PK)、His6、麦芽糖结合蛋白(MBP)、FLAG标记多肽、HA标记多肽、及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记多肽。然而，本发明不应被解释为仅限于编码上述标记多肽的核酸。甚至，编码以与这些标记多肽基本相似的方式起作用的多肽的任何核酸序列均应解释为包含在本发明中。包含编码标记多肽的核酸的核酸可用于在细胞、组织(例如血管、骨等等)和/或整个生物体(例如两栖动物和/或哺乳动物胚胎等等)中定位肾酶，检测肾酶是否从细胞中分泌，及研究肾酶在细胞中的作用。另外，加入标记多肽可便于“标记的”蛋白质的分离和纯化，由此本发明的蛋白质可易于产生和纯化。
B.反义核酸在某些情形中需要抑制肾酶的表达，因此本发明还包括用于抑制肾酶表达的组合物。因此，本发明特征在于提供了与编码哺乳动物肾酶的核酸的一部分或者全长互补的分离的核酸，该核酸对于转录是反义方向。所述反义核酸与和SEQ ID NO1具有至少40％同源的核酸或其片段互补。在其它实施方案中，反义核酸与具有SEQ ID NO1序列的、编码哺乳动物肾酶的核酸的一部分或者全长互补的核酸或其片段至少大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或者至少大约99％同源，其对于转录是反义方向。最优选地，所述核酸与SEQ ID NO1所示核酸或其片段的一部分或者全长互补。这种反义核酸抑制肾表达的(肾酶)分子的表达、功能或者这两者。
另外，与编码肾酶的核酸的全部或者一部分互补的反义核酸可用于检测肾酶mRNA在细胞、组织和/或生物体中的表达，使用例如但不限于原位杂交方法检测。因此，本领域技术人员基于本文提供的揭示将理解，本发明涵盖了可用作探针以评定肾酶表达的反义核酸。
本发明的反义分子可以合成产生，然后提供给细胞。优选大约10-30个核苷酸、更优选大约15个核苷酸的反义寡聚体，因为其易于被合成及导入靶细胞中。本发明的合成的反义分子包括本领域已知的寡核苷酸衍生物，其与未修饰的寡核苷酸相比较具有改良的生物学活性(见Cohen，如前；Tullis，1991，美国专利No.5,023,243所述，全文并入作参考)。
II.分离的多肽A.多肽、其类似物及修饰本发明还包括包含哺乳动物肾酶的分离的多肽。在一个实施方案中，包含哺乳动物肾酶的分离的多肽与具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽呈现至少大约15％的同源性。在另外的实施方案中，包含哺乳动物肾酶的分离的多肽与大鼠肾酶具有至少大约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者至少大约99％同源性。在一个实施方案中，包含哺乳动物肾酶的分离的多肽是大鼠肾酶多肽。在另一个实施方案中，包含哺乳动物肾酶分子的分离的多肽是SEQ ID NO2。
本发明还提供了包含本发明揭示的肾酶的蛋白质或肽的类似物。通过保守氨基酸序列差异或者通过不影响序列的修饰或者通过这两种方式，类似物与天然发生的蛋白质或肽不同。例如，可以进行保守氨基酸改变，这种改变尽管改变了蛋白质或肽的一级序列，但是通常不改变其功能。保守氨基酸取代典型包括如下组取代甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
修饰(其通常不改变一级序列)包括多肽的体内或者体外化学衍生化，例如乙酰化或者羧化。所述修饰还包括糖基化，例如通过在多肽合成和加工或者进一步加工步骤期间修饰多肽的糖基化模式而产生的那些糖基化；例如通过将多肽暴露于影响糖基化的酶(例如哺乳动物糖基化或者去糖基化酶)而产生的糖基化。所述修饰还包括具有磷酸化氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或者磷酸苏氨酸的序列。
本发明还包括使用通常的分子生物学技术修饰的多肽，以改良其对蛋白酶解的抗性或者优化溶解性质或者使其更适合作为治疗剂。这种多肽的类似物包括含有除了天然发生的L-氨基酸之外的残基，例如D-氨基酸或者非天然发生的合成氨基酸的那些多肽。本发明的多肽不限于本文所列举的任何特异示例方法的产物。
本发明还应解释为涵盖本发明肽(或者编码本发明肽的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”，肾酶肽的突变体、衍生物和变体是其中改变了一或多个氨基酸(或者当描述编码肽的核苷酸序列时，改变一或多个碱基对)，由此所得肽(或者DNA)与所述序列不同，但是与所述肽具有相同的生物学性质，即所述肽具有本发明的肾酶肽的生物学/生物化学性质。
另外，本发明应被解释为包括肾酶同种型及肾酶序列天然发生的变体或重组衍生的突变体，所述变体或突变体使得其编码的蛋白质与本发明的全长克隆相比具有较多、较少或者相同的生物学活性。
B.从细胞中产生和分离多肽如本文别处所证实，本发明还涉及从产生肾酶的细胞中产生和分离肾酶多肽的方法。本发明还涉及从这种细胞在其中生长的细胞培养基中产生和分离肾酶的方法。
可用于这种方法中的细胞包括天然产生肾酶的任何细胞及已经进行突变、改变或者处理以产生肾酶的细胞。这种细胞包括产生典型量肾酶的那些细胞和过量产生肾酶的那些细胞。可以对非天然产生肾酶或者低量产生肾酶的细胞进行突变、改变或者处理，以使其产生一定量的肾酶，以自然和/或经济地将其从这种细胞和其生长的培养基中分离。
一旦由细胞产生，则可以将肾酶从细胞和/或其生长培养基中分离，使用本领域技术人员熟知的蛋白质分离技术进行。如果需要或必需，可以使用本领域技术人员熟知的蛋白质纯化技术将分离的肾酶进一步纯化。
C.从体液中纯化多肽本发明还涉及一种从动物特别是哺乳动物体液中纯化肾酶多肽的方法。产生肾酶的任何动物均可用于从其体液中纯化肾酶。合适动物的例子包括但不限于小鼠、大鼠、马、猪、狗、猴、牛和人。
多肽包括片段、同源多肽、突变蛋白、类似物、衍生物和融合蛋白的纯化为本领域技术人员所熟知。见例如Scopes，ProteinPurification，2d ed.(1987)。化学合成肽的纯化可例如通过HPLC而易于实现。因此，本发明提供了一种从至少一种体液中纯化肾酶多肽的方法。所述体液包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、全血、脑脊液组织培养基和细胞提取物。肾酶从体液中的纯化可以通过本领域已知的任何蛋白质纯化方法进行，包括但不限于离子交换层析、吸附层析、配体结合亲和性层析和凝胶渗透层析，单独或者组合进行。
在有或无稳定剂的情况中，本发明一方面提供了纯或者基本纯的形式的本发明分离的蛋白质。稳定剂包括蛋白质样或者非蛋白质样材料，为本领域所熟知。稳定剂如白蛋白和聚乙二醇(PEG)为本领域所已知并且可以商购。
尽管当本发明分离的蛋白质用作治疗剂如用作疫苗及用作置换治疗时优选高水平的纯度，但是较低纯度的本发明分离的蛋白质也有用。例如，部分纯化的本发明蛋白质可在实验动物中用作免疫原以产生抗体。
D.多肽的活性本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含一种酶激活辅因子。如本文别处更充分的揭示，肾酶是一种含有黄素-腺苷-二核苷酸(FAD)的酶，其需要辅因子FAD以发挥其功能。通过本发明教导，本领域技术人员显而易见可以有其它酶辅因子以激活或者失活肾酶活性，所述其它酶辅因子如以与FAD基本相似的方式起作用并且为本领域熟知的那些辅因子。这些辅因子包括但不限于FAD类似物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、硫胺素焦磷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、吡哆醛磷酸、辅酶A、四氢叶酸、腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、金属离子、金属卟啉，例如血红素基团，生物素、α2-微球蛋白、硫胺素焦磷酸、辅酶A、吡哆醛磷酸、辅酶B12、生物胞素、四氢叶酸和硫辛酸。
肾酶活性也可以通过同源多聚体或者异源多聚体的形成而调节。同源多聚体可以是由三或多个相同的亚单位组成的多肽。另一方面，多聚体多肽可以是异源二聚体，即由两个不同的亚单位组成的多肽，或者由三或多个亚单位组成的异源多聚体，其中这些亚单位至少两个是不同的。例如，多聚体多肽是由众多亚单位组成的，其形成“单一”的多聚体多肽或者许多功能相关的多肽的复合物，可以是单体和/或多聚体多肽。
同源二聚体或者同源多聚体可以通过一些相同的多肽亚单位的自发结合而形成。异源二聚体或异源多聚体可以通过一些不同的多肽亚单位的自发结合而形成。有迹象表明肾酶形成二聚体或者多聚体复合物(图6C)。确信肾酶的二聚体或者多聚体化可以正面或者负面影响该酶活性。因此，预期肾酶的二聚体或者多聚体复合物的破坏或稳定可以特别用于多种治疗目的。
E.多肽的应用所述核酸及其编码的肽是说明肾酶分子在细胞中功能的有效工具。另外，包含哺乳动物肾酶分子的核酸和氨基酸是可以用于例如鉴别影响肾酶表达等的化合物的有效靶位，并且是高血压、肾脏疾病、心脏病等疾病的一种潜在的候选治疗药物。所述核酸、其编码的蛋白质或者这两者可给予哺乳动物以增加或者降低肾酶在哺乳动物中的表达或活性。这在与肾酶在健康哺乳动物中正常表达相比较，肾酶在哺乳动物中低表达或者过表达介导与肾酶表达改变相关的疾病或病变的情况中对于哺乳动物可能是有益的。可以通过调节肾酶表达或者活性从而提供治疗益处而影响的这种病变包括但不限于高血压、肾脏疾病、心脏病等等。这是因为如在本文别处更充分地揭示，已经示出在大鼠中注入肾酶可降低血压和心率。
另外，本发明的核酸和氨基酸可用于产生重组细胞和转基因非人哺乳动物，用于研究肾酶功能、鉴别新的诊断剂和治疗剂及说明肾酶的细胞作用的有用工具。例如，转基因动物可用于研究肾和血管疾病相关病变。
另外，本发明的核酸和氨基酸可通过评定基因表达水平或者蛋白质表达水平而诊断性用于评估ESRD、高血压、心脏病、肾病、心血管疾病等的严重程度和预后。本发明的核酸、肽、多肽和蛋白质也可用于研制评定预防ESRD、高血压、心血管疾病等的处理措施效力的分析。即本发明的核酸、肽、多肽和蛋白质可用于检测多种治疗方法对肾酶表达的作用，从而确定该治疗方法的效力，例如但不限于评估对于ESRD、高血压、心脏病、肾病和心血管疾病的治疗效力。
F.多肽的小分子抑制剂除了本文揭示的抗体、核酶、干扰RNA′s(即RNAi)和反义核酸分子之外，本发明进一步提供了使用小分子调节肾酶活性的方法。如本文所用，术语“潜在小分子抑制剂”是指与选择的蛋白质结合的小分子，但是其抑制酶的生物学活性的能力(例如降低酶的催化速度)还未测试。在证实了这种抑制特征之后，所述小分子可以称作“小分子抑制剂”或者更普通的“抑制剂”。
术语“小分子”是指分子量等于或者小于大约5000道尔顿(5kD)、或小于大约3kD、或小于大约2kD、或小于大约1kD的化合物。在一些情况中，优选所述小分子的分子量等于或者小于大约700Da。
如实施例中所提供，本发明的蛋白质和核酸，如具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白质，参与儿茶酚胺代谢。调节或者下调蛋白质表达的小分子或者如蛋白质的至少一种活性的激动剂或者拮抗剂的制剂可用于调节与该蛋白质功能和活性相关的生物学和病理学过程。
病理学过程是指一种产生有害作用的生物学过程。例如，本发明蛋白质的表达缺乏或者表达下调可以与某些疾病如ESRD相关。如本文所用，当小分子抑制剂降低所述过程的程度或者严重性时，则称该制剂调节该病理学过程。例如，可以通过给予以某些方式降低或者调节本发明蛋白质的表达或者至少一种活性的制剂而预防疾病或者调节疾病进展。
本发明的小分子抑制剂可单独提供，或者与调节特定病理学过程的其它制剂组合。如本文所用，当同时给予两种小分子或者以使其同时起作用的方式单独给予两种小分子时，则称这两种小分子是组合给予的。
本发明的小分子抑制剂可以通过胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、经皮或者经口腔途径给予。或者，或同时，可以通过口服给予。给予的剂量依赖于受者的年龄、健康状态和体重，同时进行治疗的种类，如果有，还有治疗频率及希望的作用性质。
III.载体A.进行体外表达的载体在其它相关方面，本发明包括编码哺乳动物肾酶的一种分离的核酸，其与包含启动子/调节序列的核酸可操纵地连接，由此所述核酸优选能指导其编码的蛋白质的表达。因此，本发明涵盖了表达载体及将外源DNA导入细胞中并在该细胞中伴随表达所述外源DNA的方法，例如Sambrook等(1989，如前)及Ausubel等(1997，如前)所述。
肾酶(单独或者与可检测的标记多肽融合)在正常不表达肾酶或者不表达与标记多肽融合的肾酶的细胞中的表达，可以通过产生质粒、病毒或者其它类型载体而实现，所述载体包含与启动子/调节序列可操纵地连接的所需核酸，所述启动子/调节序列驱动有或无标记的蛋白质在导入所述载体的细胞中表达。本领域可利用许多用于驱动基因组成型表达的启动子/调节序列，包括但不限于例如巨细胞病毒立即早期启动子增强子序列、SV40早期启动子，这两种启动子均用于本发明揭示的实验中，以及Rous肉瘤病毒启动子等等。此外，编码肾酶的核酸的诱导型及组织特异性表达可以通过将编码有或无标记的肾酶的核酸置于诱导型或者组织特异性启动子/调节序列的控制下而实现。
用于这种目的的组织特异性或者诱导型启动子/调节序列的例子包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子及SV40晚期增强子/启动子。另外，本领域熟知的应答诱导剂如金属、糖皮质激素等而诱导的启动子也涵盖在本发明中。因此，应意识到本发明包括使用已知或者未知的能驱动与之可操纵地连接的所需蛋白质表达的任何启动子/调节序列。
使用载体表达肾酶使得可以分离大量重组产生的蛋白质。另外，肾酶表达的缺乏或者水平降低导致与这种表达相关的疾病、障碍或者病变的情况中，由启动子/调节序列驱动的肾酶的表达可以提供有效的治疗方法，包括但不限于通过肾酶提供的基因治疗。对于与蛋白质的表达水平增加、蛋白质的水平或者蛋白质活性降低相关的疾病、障碍或者病变，给予肾酶可以是有效的治疗方法，包括但不限于提供肾酶进行基因治疗。因此，本发明不仅包括抑制肾酶表达、翻译和/或活性的方法，还包括涉及增加肾酶表达、蛋白质水平和/或活性的方法，因为降低和增加肾酶表达和/或活性均可用于提供有效的治疗方法。
本发明不限于所选择的任何特定质粒载体或者其它DNA载体，可以利用本领域熟知的许多载体。另外，本领域技术人员熟知选择特殊的启动子/调节序列并将那些启动子/调节序列与编码所需多肽的DNA序列可操纵地连接的方法。这种技术为本领域所熟知，例如由Sambrook(如前)和Ausubel(如前)所述。
本发明因此包括包含编码哺乳动物肾酶的分离的核酸的载体。将所需核酸整合入载体中并选择载体是本领域所熟知的技术，见例如Sambrook等(如前)和Ausubel等(如前)所述。
本发明还包括含有这种载体的细胞、病毒、原病毒等等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域所熟知。见例如Sambrook等(如前)和Ausubel(如前)所述。
编码肾酶的核酸可以克隆进不同质粒载体中。然而，本发明不应被解释为限于质粒或者任何特定载体。相反，本发明应被解释为涵盖可易于获得和/或本领域熟知的载体及根本不是载体。
B.进行体内和离体表达的载体所述肾酶多肽也可以根据本发明通过这种多肽在体内的表达进行应用，通常称作“基因治疗”。
因此，例如患者的细胞可以用编码离体多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)工程化，然后将工程化的细胞提供给患者以用所述多肽治疗患者。这种方法为本领域所熟知，通过本文教导将显而易见。例如，细胞可以通过使用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体而工程化。
相似地，细胞可以通过例如本领域已知的方法在体内工程化以在体内表达多肽。例如，将包装细胞用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导，由此所述包装细胞产生含有感兴趣基因的感染性病毒颗粒。这些生产细胞可以给予患者以使得细胞在体内工程化及在体内表达多肽。本领域技术人员通过本发明的教导将显而易见给予本发明多肽的这些及其它方法。
本发明涵盖了众多载体将包含两或多个多肽或者蛋白质的编码序列和自身加工切割序列的构建体导入细胞中的应用，由此导致蛋白质表达。本领域已知许多表达载体的例子，可以是病毒或者非病毒来源。可用于实践本发明的非病毒基因输送方法包括但不限于质粒、脂质体、核酸/脂质体复合物、阳离子脂质等。
病毒载体可有效地转导细胞并将其自身DNA导入宿主细胞中。在产生重组病毒载体中，将非必需基因用编码感兴趣的蛋白质或者多肽的基因置换。示例的载体包括但不限于病毒和非病毒载体，如逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒(Ad)载体，包括其复制感受态、复制缺陷和gutless形式，腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头状瘤病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、莫洛尼鼠白血病毒载体、Harvey鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺瘤病毒载体、Rous肉瘤病毒载体和非病毒质粒。
载体典型包含复制起点，另外载体可以包含或者不包含“标记”或者“可选择的标记”，通过这些标记可以鉴别和选择所述载体。任何可选择的标记均可以使用，用于重组载体中的可选择标记为本领域所已知，依赖宿主细胞选择适当的可选择的标记。编码赋予抗生素或者其它毒素抗性的蛋白质的可选择的标记的例子包括但不限于氨苄青霉素、氨甲蝶呤、四环素、新霉素(Southern et al.，J.，J Mol ApplGenet.1982；1(4)327-41(1982))、霉酚酸(Mulligan et al.，Science 2091422-7(1980))、嘌呤霉素、zeomycin、潮霉素(Sugden et al.，Mol CellBiol.5(2)410-3(1985))和G418。如本领域技术人员所已知，表达载体典型包括适合被表达的编码序列的一个复制起点、一个与编码序列或者被表达的序列可操纵地连接的启动子以及核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。
“重组”载体或者其它DNA序列只是在自然状态下分离或者发现的典型地未可操纵地连接的DNA序列的可操纵地连接。当表达和/或控制序列调节核酸序列的转录和翻译时(适当时)，该调节(表达和/或控制)序列与核酸编码序列是可操纵地连接的。因此，表达和/或控制序列可包括启动子、增强子、转录终止子、编码序列的5’起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号和终止密码子。
已知腺病毒基因治疗载体展示强瞬时表达能力，极佳的效价，和体内转导分化和未分化的细胞的能力(Hitt et al.，Adv in Virus Res 55479-505，2000)。本发明的重组Ad载体包含(1)使得载体整合入复制缺陷Ad病毒体中的包装位点；(2)感兴趣的两或多个蛋白质或多肽的编码序列；及(3)仅编码自身加工切割位点或者组合另外的蛋白酶解切割位点的序列。整合入感染性病毒体必需的或者辅助的其它元件包括5′和3′Ad ITR、E2基因、部分E4基因及任选E3基因。
复制缺陷Ad病毒体与本发明的重组Ad载体的包囊化是通过本领域已知的标准技术产生的，使用Ad包装细胞和包装技术进行。这些方法的例子可见于例如美国专利No.5,872,005所述。感兴趣的两或多个多肽或者蛋白质的编码序列通常被插入缺失病毒基因组E3区域的腺病毒中。优选实践本发明的腺病毒载体不表达一或多种野生型Ad基因产物，例如E1a、E1b、E2、E3和E4。优选的实施方案是病毒体，其典型地与包装细胞系一起使用，所述包装细胞系互补E1、E2A、E4及任选E3基因区域的功能。见例如美国专利No.5,872,005、5,994,106、6,133,028和6,127,175所述。因此，如本文所用，术语“腺病毒”和“腺病毒颗粒”除了特别指出之外，是指病毒自身或其衍生物，并且覆盖了所有血清型和亚型以及天然发生的和重组两种形式。这种腺病毒可以是野生型或者是以本领域已知的或者本文所述的多种方式修饰。这种修饰包括将腺病毒基因组包装在颗粒中以产生感染性病毒的修饰。这种修饰包括本领域已知的缺失，如缺失一或多个E1a、E1b、E2a、E2b、E3或者E4编码区。示例的包装和生产细胞衍生自293、A549或者HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和制备腺病毒载体。
腺伴随病毒(AAV)是一种依赖于辅助病毒的人细小病毒，其能通过染色体整合而潜在地感染细胞。因为其能整合进染色体中并且非病原的性质，AAV在作为人基因治疗载体中具有重要潜力。为了用于实践本发明，使用本领域技术人员已知的标准方法产生并构建rAAV病毒体，由此其包括(如以转录方向可操纵地连接的成分)包括转录起始和终止序列的控制序列及感兴趣的编码序列。更特别地，本发明的重组AAV载体包含(1)一个能使载体整合入复制缺陷AAV病毒体中的包装位点；(2)感兴趣的两或多个蛋白质或多肽的编码序列；(3)只编码自身加工切割位点或者组合另外的蛋白酶解切割位点的序列。用于实践本发明的AAV载体被构建，由此其还包括(以转录方向可操纵地连接的成分)包括转录起始和终止序列的控制序列。这些成分在5’和3’末端两侧是功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”是指ITR序列具有挽救、复制和包装AAV病毒体的功能。
重组AAV载体特征还在于其能指导选择的感兴趣重组蛋白质或者多肽在靶细胞中表达和产生。因此，重组载体包含至少所有包囊化必需的AAV序列及感染重组AAV(rAAV)病毒体的物理结构。因此，用于本发明载体中的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如Kotin，Hum.Gene Ther.，5793-801，1994所述)，可以通过核苷酸插入、缺失或者取代而改变，或者AAV ITR可以衍生自一些AAV血清型。通常，AAV载体是衍生自腺伴随病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8等等。优选的rAAV表达载体全部或者部分缺失的野生型REP和CAP基因，但仍保留功能性侧翼ITR序列。
典型地，将AAV表达载体导入生产细胞中，随后导入AAV辅助构建体，所述辅助构建体包括能在生产细胞中表达并且互补在AAV表达载体中缺少的AAV辅助功能的AAV编码区。如本文所用，术语“AAV辅助功能”是指能在宿主细胞中表达的AAV编码区以互补rAAV载体中缺少的AAV病毒功能。典型地，AAV辅助功能包括AAVrep编码区和AAV cap编码区。辅助构建体可以设计为下调大的Rep蛋白(Rep78和Rep68)的表达，典型地通过将在p5之后的起始密码子由ATG突变为ACG而构建，如美国专利No.6,548,286所述。
将AAV表达载体导入生产细胞中典型随后在生产细胞中导入辅助病毒和/或另外的载体，其中所述辅助病毒和/或另外的载体提供能支持有效的rAAV病毒产生的附属功能。
“附属功能”是指AAV复制必需的但不是由AAV病毒体自身提供的功能。因此，这些附属功能和因子必须由宿主细胞、病毒(例如腺病毒、单纯疱疹病毒或者痘苗病毒)或者由在相同细胞中共表达的表达载体提供。通常，腺病毒的E1A和E1B、E2A、E4和VA编码区用于提供AAV复制和包装必需的附属功能(Matsushita et al.，GeneTherapy 5938)。
然后培养生产细胞以产生rAAV。这些步骤使用标准方法进行。复制缺陷AAV病毒体与本发明的重组AAV载体的包囊化是使用AAV包装细胞和包装技术通过本领域已知的标准技术进行的。这些方法的例子可见于例如美国专利Nos.5,436,146、5,753,500、6,040,183、6,093,570和6,548,286所述。进行包装的其它组合物和方法见Wang等(US 2002/0168342)所述，并包括本领域技术人员已知的那些技术。AAV载体和AAV辅助构建体均可以构建为含有一或多个任选可选择的标记基因。授予抗生素抗性或者对适当选择性培养基敏感性的可选择的标记基因为本领域所熟知。
术语“AAV病毒体”是指一种完整的病毒颗粒，如“野生型”(wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白外壳结合的线性、单链AAV核酸基因组)。相反，“重组AAV病毒体”和“rAAV病毒体”是指在AAV ITR两侧含有感兴趣的异源DNA序列的感染性病毒颗粒。
在实践本发明中，产生rAAV病毒体的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因稳定保持在宿主细胞或者生产细胞中，其中AAV载体基因组被稳定保持和包装。示例的包装和生产细胞衍生自293、A549或者HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和制备AAV载体。
逆转录病毒载体也是基因输送的一种常用工具(Miller，Nature357455-460，1992)。逆转录病毒载体及更特别的慢病毒载体可用于实施本发明。因此，本文所用术语“逆转录病毒”或者“逆转录病毒载体”是指分别包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。对逆转录病毒载体进行测试并发现其是将感兴趣基因稳定导入广泛靶细胞基因组中的合适的运输载体。逆转录病毒载体将未重排的单拷贝转基因输送进细胞中的能力使得逆转录病毒载体非常适合将基因转移进细胞中。另外，逆转录病毒通过逆转录病毒包膜糖蛋白与宿主细胞上的特异性细胞表面受体的结合而进入宿主细胞。因此，也可发现假型逆转录病毒载体在实践本发明中的用途，所述假型逆转录病毒载体中编码的天然包膜蛋白由一种异源包膜蛋白置换，该异源包膜蛋白具有与天然包膜蛋白不同的细胞特异性(例如与天然包膜蛋白相比，结合不同的细胞表面受体)。指导编码一或多种靶蛋白质编码序列的逆转录病毒载体输送至特异靶细胞的能力是实践本发明所需的。
本发明提供了逆转录病毒载体，其包括例如包含一或多个转基因序列的逆转录病毒转移载体及包含一或多个包装元件的逆转录病毒包装载体。特别地，本发明提供了编码异源或者功能修饰的包膜蛋白的假型逆转录病毒载体以产生假型逆转录病毒。
本发明的逆转录病毒载体的核心序列可易于衍生自众多的逆转录病毒，包括例如B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒(spumaviruses)和慢病毒(RNA Tumor Viruses，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory，1985)。适用于本发明的组合物和方法中的逆转录病毒的例子包括但不限于慢病毒。适用于本发明的组合物和方法中的其它逆转录病毒包括但不限于禽类白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、Mink-Cell Focus-Inducing Virus、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病毒和Rous肉瘤病毒。优选的鼠类白血病毒包括4070A和1504A(Hartley and Rowe，J.Virol.1919-25，1976)、Abelson(ATCC No.VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graffi、Gross(ATCCNo.VR-590)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)及莫洛尼鼠类白血病毒(ATCC No.VR-190)。这种逆转录病毒可易于得自如美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，Md.)的保藏物，或者使用常用技术分离自已知来源。
优选地，本发明的逆转录病毒载体序列衍生自慢病毒。优选的慢病毒是人免疫缺陷病毒，例如1型或者2型(即HIV-1或者HIV-2，其中HIV-1原来被称作淋巴结病伴随病毒3(HTLV-III)及获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关病毒(ARV))或者与HIV-1或HIV-2相关的已经修饰并与AIDS或者AIDS样疾病相关的另一种病毒。其它慢病毒包括绵羊Visna/maedi病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)及山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。
适用于本发明的组合物和方法中的逆转录病毒的多个种属和毒株为本领域所熟知(见例如Fields Virology，Third Edition，edited by B.N.Fields et al.，Lippincott-Raven Publishers(1996)，见例如Chapter 58，RetroviridaeThe Viruses and Their Replication，Classification，pages1768-1771)。
本发明的包装系统包含至少两个包装载体，第一个包装载体包含第一个核苷酸序列，该序列包含gag、pol或者gag和pol基因，第二个包装载体包含第二个核苷酸序列，该序列包含异源或者功能修饰的包膜基因。在一个优选的实施方案中，逆转录病毒元件衍生自慢病毒，如HIV。优选地，所述载体缺少功能性tat基因和/或功能辅助基因(vif、vpr、vpu、vpx、nef)。在一个优选的实施方案中，所述系统进一步包含第三个包装载体，其包含一个核苷酸序列，该序列包含rev基因。所述包装系统可以含有第一个、第二个及任选第三个核苷酸序列的包装细胞形式提供。
本发明可适用于许多系统，本领域技术人员意识到不同组的逆转录病毒共有共同的元件。本发明使用慢病毒系统作为代表性实例。然而，所有逆转录病毒均呈现包膜病毒体的特征，具有表面突起，含有一个线性正义单链RNA分子，由二聚体组成的基因组，及共有的蛋白质gag、pol和env。
慢病毒呈现一些共有的结构性病毒体蛋白，包括包膜糖蛋白SU(gp120)和TM(gp41)，其由env基因编码；CA(p24)、MA(p17)和NC(p7-11)，其有gag基因编码；及由pol基因编码的RT、PR和IN。HIV-1和HIV-2含有参与调节病毒RNA合成和加工及其它复制功能的辅助蛋白质和其它蛋白质。由vif、vpr、vpu/vpx和nef基因编码的辅助蛋白质在重组系统中可以省略(或者失活)。另外，tat和rev可例如通过突变或者缺失而省略或者失活。
第一代慢病毒载体包装系统提供了针对gag/pol和env的单独的包装构建体，出于安全原因而典型应用异源或者功能修饰的包膜蛋白质。在第二代慢病毒载体系统中，辅助基因vif、vpr、vpu和nef被缺失或者失活。优选第三代慢病毒载体系统用于实践本发明，包括其中tat基因已经缺失或者另外失活(例如通过突变)的那些慢病毒载体系统。
补偿通常由tat提供的转录调节可以通过使用强组成型启动子而提供，如人巨细胞病毒立即早期(HCMV-IE)增强子/启动子。其它启动子/增强子可以基于组成型启动子活性强度、对于靶组织的特异性或者关于所需控制过表达的其它因素而选择，这些为本领域所已知。例如在一些实施方案中，可以应用一种诱导型启动子如tet实现控制表达。编码rev的基因优选在单独的表达构建体上提供，由此典型的第三代慢病毒载体系统将包含四个质粒gagpol、rev、包膜和转移载体。无论应用哪一代包装系统，gag和pol均可以在一个构建体上或者单独的构建体上提供。
典型地，包装载体包含在包装细胞中，并通过转染、转导或者感染而导入细胞中。进行转染、转导或者感染的方法为本领域技术人员所熟知。本发明的逆转录病毒/慢病毒转移载体可以通过转染、转导或者感染而导入包装细胞系中，以产生生产细胞或者细胞系。
本发明的包装载体可以通过标准方法导入人细胞或者细胞系中，例如通过磷酸钙转染、脂质转染或者电穿孔进行。在一些实施方案中，包装载体与一种显性可选择标记一起导入细胞中，所述标记如neo、DHFR、Gin合成酶或者ADA，随后在存在合适药物的条件下选择及分离克隆。可选择标记基因可以与包装载体编码的基因物理连接。
已知其中包装功能设计为由合适的包装细胞表达的稳定细胞系。见例如描述包装细胞的美国专利No.5,686,279，及Ory et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)9311400-11406所述。关于产生稳定细胞系的进一步描述可见于Dull et al.，1998，J.Virology 72(11)8463-8471；及Zufferey et al.，1998，J.Virology 72(12)9873-9880。
Zufferey et al.，1997，Nature Biotechnology 15871-875，教导了一种慢病毒包装质粒，其中包括HIV-1包膜基因的pol的3’序列缺失。该构建体含有tat和rev序列，并且3′LTR由polyA序列置换。5′LTR和psi序列由另一种启动子置换，如由诱导型启动子置换。例如，可以使用CMV启动子或其衍生物。
优选的包装载体可以含有另外的包装功能改变，以增强慢病毒蛋白表达及增加安全性。例如，gag上游的所有HIV序列均可以除去。同样，包膜的下游序列也可以除去。另外，可以采用修饰载体以增强RNA剪接和翻译的步骤。
任选地，使用条件包装系统，如Dull et al.，J.Virology 72(11)8463-8471，1998描述的包装系统。也优选使用自身失活载体(SIN)，通过缺失HIV-1长末端重复(LTR)而改良载体的生物安全性，例如Zufferey et al.，1998，J.Virology 72(12)9873-9880所述。也可以使用诱导型载体，如tet诱导型LTR。
单纯疱疹病毒(HSV)由于其神经细胞向性而在治疗神经系统障碍中产生广泛兴趣，但是这种载体也可用于其广泛宿主范围内的其它组织。使得HSV成为一种引人注目的载体的另一个因素是基因组的大小和组构。因为HSV较大，因此与其它较小的病毒系统相比较容易掺入多个基因或者表达盒。另外，与其它系统相比，具有不同性能(时间、强度等等)的不同病毒控制序列的可用性使其可以控制表达至较高程度。另一个优点是该病毒具有相对极少的剪接信息，进一步易于遗传操纵。
HSV也是相对易于操纵，并且可以生长至高效价。因此，在需要达到足够MOI的体积和减少需要重复给料方面，输送均不成问题。关于HSV作为基因治疗载体的综述见Glorioso et al.(1995)所述。本领域技术人员熟知使用HSV作为载体的技术。
痘苗病毒载体已经广泛应用，因为其易于构建、获得相对高水平的表达、广泛的宿主范围及携带DNA的大容量。痘苗病毒含有一个大约186kb的线性双链DNA基因组，呈现明显的A-T偏爱。在基因组两侧具有大约10.5kb的反向末端重复。大多数必需基因看起来在中心区内作图，其在痘病毒中是最高度保守的。估计痘苗病毒中开放读框数为150-200。尽管这两个链均是编码链，但是读框的广泛重叠不常见。
其它病毒载体在本发明中可以用作构建体。例如，可以应用衍生自病毒如痘病毒的载体。委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis，VEE)病毒的分子克隆株已经遗传改进为复制感受态疫苗载体以表达异源病毒蛋白质(Davis et al.，1996)。研究表明VEE感染刺激强有力的CTL应答，提示VEE也许是进行免疫的一个极其有用的载体(Caley et al.，1997)。本发明预期VEE病毒可用于靶向树突细胞。
多核苷酸可以包含在已经工程化表达特异性结合配体的病毒载体中。因此该病毒颗粒将特异性结合靶细胞的同族受体(cognatereceptor)并将内容物输送给细胞。基于通过向病毒包膜蛋白中化学添加乳糖残基而对逆转录病毒进行化学修饰，揭示了设计特异性靶向逆转录病毒载体的一种新方法。这种修饰通过唾液酸糖蛋白受体可以特异性感染肝细胞。
设计靶向重组逆转录病毒的另一种方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白及针对特异性细胞受体的生物素酰化的抗体。使用链霉抗生物素蛋白通过生物素成分偶联抗体(Roux et al.，1989)。使用针对主要组织相容性复合体I和II类抗原的抗体，表明在体外具有亲嗜性病毒那些表面抗原的多种人体细胞的感染(Roux et al.，1989)。
用于实践本发明的任何载体均包括异源控制序列，如组成型启动子，例如巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、和PGK启动子；组织或者细胞类型特异性启动子，包括mTTR、TK、HBV、hAAT、可调节或者可诱导的启动子、增强子等等。优选的启动子包括LSP启动子(III et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis 8S223-30，1997)、EF1-α启动子(Kim et al.，Gene 91(2)217-23，1990)和Guo et al.，Gene Ther.3(9)802-10，1996)。最优选的启动子包括延伸因子1-α(elongation factor 1-alpha，EF1α)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒立即早期基因(CMV)启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、四环素应答启动子(TRE)、运甲状腺素蛋白启动子(TTR)、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子。这些和众多另外的启动子的序列为本领域所已知。相关序列可易于得自公共数据库，并掺入载体中以用于实践本发明。
本发明还包括基因调节系统以控制两或多个感兴趣多肽或蛋白质的编码序列的表达。基因调节系统用于调节特定一或多个基因的表达。在一种方法中，基因调节系统或者开关包括一种嵌合转录因子，其具有配体结合结构域、转录激活结构域和DNA结合结构域。所述结构域可得自任何来源并且可以任何方式组合以获得新的蛋白质。可调节的基因系统还包括一个DNA应答元件，其与嵌合转录因子相互作用。这个元件位于被调节的基因的邻近。
可用于实践本发明的示例基因调节系统包括果蝇蜕皮激素系统(Yao et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，933346(1996))；蚕蜕皮激素系统(Suhret al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，957999(1998))；Valentis GeneSwitch.RTM.合成的孕酮受体系统，其应用RU486作为诱导剂(Osterwalder et al.，Proc Natl Acad Sci 98(22)12596-601(2001))；Tet.TM.& RevTet.TM.系统(BD Biosciences Clontech)，其应用小分子如四环素(Tc)或类似物例如强力霉素调节(开始或者关闭)靶的转录(Knott et al.，Biotechniques 32(4)796，798，800(2002))；ARIAD调节技术，基于使用小分子使两个细胞内分子结合在一起，每个分子均与转录激活物或者DNA结合蛋白连接。当这些成分集合在一起时，激活感兴趣基因的转录。Ariad具有两个主要系统一个系统基于同源二聚体化，一个系统基于异源二聚体化(Rivera et al.，Nature Med，2(9)1028-1032(1996)；Ye et al.，Science 28388-91(2000))，每个系统均可掺入本发明的载体中。
用于实践本发明的优选基因调节系统是ARIAD调节技术和Tet.TM.& RevTet.TM.系统。
C.非病毒载体本发明还涉及将表达载体转移进细胞中的一些非病毒方法。这些方法包括磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb，1973；Chen andOkayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa et al.，1986；Potter et al.，1984)、直接微注射(Harlandand Weintraub，1985)、荷载DNA的脂质体(Nicolau and Sene，1982；Fraley et al.，1979)及lipofectamine-DNA复合物、细胞超声(Fechheimeret al.，1987)、使用高速微粒进行基因轰击(Yang et al.，1990)、聚阳离子(Bousssif et al.，1995)和受体介导的转染(Wu and Wu，1987；Wu andWu，1988)。这些技术有一些可以成功适用于体内或离体应用。本领域技术人员熟知关于非病毒载体应用的技术，并了解本发明涵盖了除了揭示的那些载体之外其它类型的非病毒载体。
在本发明的另一个实施方案中，表达盒可以在脂质体或者脂质制剂中包载(entrap)。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部水相基质的囊泡状结构。多层脂质体具有由水相基质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时自然形成。脂质成分在密闭结构形成之前经历自身重排并在脂质双层之间包载水和溶解的溶质(Ghosh andBachhawat，1991)。本发明还涵盖了一种与Lipofectamine(Gibco BRL)复合的基因构建体。本领域技术人员熟知利用脂质体和脂质制剂的技术。
基于脂质的非病毒制剂提供了另一种腺病毒基因治疗方法。尽管许多细胞培养研究证实了基于脂质的非病毒基因转移，但是通过基于脂质的制剂的系统性基因输送受限。基于非病毒脂质的基因输送主要受限于包含非病毒输送载体的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性部分说明了体外和体内基因转移结果之间的差异。归因于这种矛盾数据的另一个因素是在存在和不存在血清蛋白质的情况中脂质体稳定性的差异。脂质体与血清蛋白质之间的相互作用对脂质体的稳定性特征具有显著影响(Yang and Huang，1997)。阳离子脂质体吸引并结合负电荷的血清蛋白质。由血清蛋白质包被的脂质体溶解或者由巨噬细胞吞噬而使其从血液循环中除去。目前体内脂质体输送方法使用皮下、皮内或者颅内注射方法，以避免与血液循环中阳离子脂质相关的毒性和稳定性问题。脂质体与血浆蛋白质的相互作用是造成体外(Felgneret al.，1987)和体内基因转移(Zhu et al.，1993；Solodin et al.，1995；Thierry et al.，1995；Tsukamoto et al.，1995；Aksentijevich et al.，1996)效力之间不一致的原因。
脂质制剂的产生通常通过在如下阶段之后对脂质体混合物进行超声或者连续挤压而实现(I)反相蒸发(II)脱水-再水化(III)洗涤剂透析和(IV)薄膜水合。一旦产生，脂质结构可用于将血液循环中的毒性(化疗剂)或者不稳定化合物(核酸)包囊化。脂质体包囊化使得这种化合物的毒性降低及血清半衰期较长(Gabizon et al.，1990)。许多疾病的治疗是使用基于脂质的基因转移策略，以增强常规治疗方法或者建立新的治疗方法，特别是治疗过度增殖性疾病。
D.包括蛋白质或者多肽编码序列的核酸构建体输送至细胞本发明可应用的载体构建体可以在体外、离体或者在体内导入细胞中以由细胞(例如体细胞)体内表达异源编码序列或者由载体转导的细胞在体外或体内产生重组多肽，所述载体构建体包含编码异源蛋白质或者多肽的核酸序列及仅一个自身加工切割位点或者组合编码另外的蛋白酶解切割位点的序列。
可以使用本领域已知的标准方法将本发明的载体构建体在体外或者离体导入细胞中。这种技术包括使用磷酸钙的转染、显微注射进培养的细胞中(Capecchi，Cell 22479-488(1980))、电穿孔(Shigekawaet al.，BioTechn.，6742-751(1988))、脂质体介导的基因转移(Manninoet al.，BioTechn.，6682-690(1988))、脂质介导的转导(Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417(1987))及使用高速微粒轰击进行核酸输送(Klein et al.，Nature 32770-73(1987))。
对于体外或者离体表达，可以应用有效表达功能性蛋白质的任何细胞。本领域已知许多用于蛋白质表达的细胞和细胞系的例子。例如，原核细胞和昆虫细胞可用于表达。另外，可以使用真核微生物，如酵母。重组蛋白质在原核细胞、昆虫和酵母系统中的表达为本领域所已知，并且可以适用于使用本发明的组合物和方法的蛋白质或多肽表达。
用于表达的宿主细胞的例子进一步包括哺乳动物细胞，如成纤维细胞、非人哺乳动物细胞如绵羊、猪、鼠和牛细胞、昆虫细胞等等。哺乳动物细胞特别例子包括COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293细胞、NSO细胞、3T3成纤维细胞、W138细胞、BHK细胞、HEPG2细胞、DUX细胞和MDCK细胞。
将宿主细胞在经修饰的常规营养培养基中培养，所述修饰是针对适合诱导启动子、选择转化体或者扩增编码所需序列的基因而进行。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)，Sigma)、RPMI1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM，Sigma)典型适于培养宿主细胞。给定的培养基通常根据需要补加激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白、或者上皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或者等价的能量源。也可以包含适当浓度的任何其它必需补充物，这些为本领域技术人员所已知。对于特殊细胞系的合适培养条件如温度、pH等为本领域所已知，关于多种细胞系的建议培养条件见例如在http://www.atcc.org/SearchCatalogs/AllCollections.cfm网上可以获得的ATCC目录。
本发明的载体可以在体内通过多种途径给予(例如皮内、静脉内、肿瘤内、脑内、门静脉内、腹膜内、肌内、膀胱内等等)，以输送通过自身加工切割序列连接的多个基因以在动物模型或者人体对象中表达两或多个蛋白质或者多肽。根据给予途径，治疗性蛋白质发挥其局部(例如在脑或者膀胱中)或者全身(其它给予途径)作用。本发明的载体中使用蛋白质或多肽的开放读框的5’组织特异性启动子可用于使得由该载体编码的两或多个蛋白质或多肽组织特异性表达。
将携带转基因的重组载体在体外、离体或者体内导入靶细胞中的多种方法在先前已经描述并且为本领域所熟知。本发明提供了通过用本发明的重组载体转导靶细胞的治疗方法、疫苗和癌症治疗方法。
例如，在体内输送本发明的重组载体可以靶向于多种器官类型，包括但不限于脑、肝、血管、肌肉、心、肺和皮肤。
在离体基因转移中，使用本发明的重组载体和本领域熟知的方法从宿主中获取靶细胞并在实验室中进行遗传修饰。
本发明的重组载体可以使用常规给予模式给予，包括但不限于上述模式。本发明的重组载体可以多种制剂提供，如液体溶液和悬浮液、微泡、脂质体和可注射或者可输注的溶液。优选的形式依赖于给予模式和治疗应用。合适的输送途径可以使用本领域技术人员通常可利用的知识确容易地定。
认识到的使用本发明重组载体构建体在体内产生重组蛋白质和多肽中的众多优点包括给予单一载体可以在患者中长期并持续地表达两或多种重组蛋白质或多肽ORF；在体内表达具有生物学活性的两或多种重组蛋白质或多肽ORF；及在人体细胞中产生的重组蛋白质或者多肽的天然翻译后修饰。
一个优选方面是使用本发明的重组载体构建体在体外产生重组蛋白质和多肽。产生重组蛋白质的方法为本领域所熟知，使用这种标准方法可以利用本发明的含有自身加工切割位点的载体构建体表达重组蛋白质和多肽。
在本发明的一方面，将载体导入或者给予细胞(转染)，通过如下一或多个步骤进行(1)在一定条件下培养转染的细胞以选择表达重组蛋白质或多肽的细胞；(2)评估所述重组蛋白质或多肽的表达；及(3)收集所述重组蛋白质或多肽。
从中可以衍生上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫洛尼鼠类白血病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒，禽类白血病毒、猿白血病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳癌病毒。在一个实施方案中，所述逆转录病毒质粒载体衍生自莫洛尼鼠类白血病毒。
所述载体包括一或多个启动子。可以利用的合适启动子包括但不限于逆转录病毒LTR、SV40启动子、Miller，et al.，Biotechniques，Vol.7，No.9，980-990(1989)所描述的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或者任何其它启动子(例如细胞启动子如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。可以应用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据本文教导，本领域技术人员显而易见可以选择合适的启动子。
编码本发明多肽的核酸序列在合适启动子的控制下。可以应用的合适启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或者异源启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR(包括上述修饰的逆转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是控制编码所述多肽的基因的天然启动子。
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAml2、和DAN细胞系，如Miller，Human Gene Therapy，Vol.1，pgs.5-14(1990)所述，其以全文并入参考。所述载体可以通过本领域已知的任何方法转导包装细胞。这种方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体及CaPO4沉淀。或者，逆转录病毒质粒载体可以在脂质体中包囊化，或者与脂质偶联，然后给予宿主。
所述生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码所述多肽的核酸序列。这种逆转录病毒载体颗粒然后可用于在体外或者体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
IV.含有外源提供的编码核酸分子的宿主细胞本发明进一步提供了用编码肾酶蛋白的核酸分子转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞。用于表达本发明蛋白质的真核细胞不受限制，只要该细胞系与细胞培养方法相容及与表达载体的增殖和基因产物的表达相容即可。优选的真核宿主细胞包括但不限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞如小鼠、大鼠、猴或人细胞系，及其它无限增殖的细胞系。优选的真核宿主细胞包括得自ATCC登记号为CCL61的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，得自ATCC登记号为CRL 1658的NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3，幼仓鼠肾细胞(BHK)等真核组织培养细胞系及其它无限增殖的细胞系。
任何原核细胞宿主均可用于表达编码本发明蛋白质的rDNA分子。优选的原核细胞宿主是大肠杆菌(E.coli)。
通过熟知方法用本发明的rDNA分子转化合适的细胞宿主，所使用的方法典型依赖于所用载体和宿主系统的类型。关于原核宿主细胞的转化，典型应用电穿孔和盐处理方法，见例如Cohen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110，1972和Maniatis et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Mammal，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1982)所述。关于用含有rDNA的载体转化脊椎动物细胞，典型应用电穿孔、阳离子脂质或者盐处理方法，见例如Graham et al.，Virol.52456，1973；Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761373-76，1979所述。
成功转化的细胞，即含有本发明rDNA分子的细胞，可以通过熟知的技术鉴别，包括选择可选择的标记。例如，可以克隆导入了本发明的rDNA而获得的细胞以产生单一集落。对这些集落的细胞可以进行收获、裂解并根据rDNA的存在情况检测其DNA含量，使用如Southern，J.Mol.Biol.98503，1975或者Berent et al.，Biotech.3208，1985所述方法进行，或者通过免疫学方法分析该细胞产生的蛋白质。
V.反义分子、核酶和干扰RNA本发明进一步包括一种包含反义核酸的重组细胞，该细胞是阐明肾酶在细胞过程中作用的有用模型。即肾酶在气囊损伤的血管、特别是在其外膜中表达水平增加表明肾酶参与与阴性重塑(negativeremodeling)和动脉再狭窄相关的细胞增殖。因此，包含与肾酶互补但反义方向的反义核酸的转基因细胞是研究肾酶作用机制及其在细胞中的作用以及鉴别改善肾酶表达的作用的治疗方法的一种有用工具。
本领域技术人员基于本发明提供的揭示可以意识到与编码肾酶的核酸互补的反义核酸可用于转染细胞，并且研究该细胞以确定肾酶表达改变的作用以研究肾酶的功能及鉴别有效的治疗和诊断方法。
进一步，降低肾酶在细胞中的表达和/或活性的方法可为肾酶表达增加、肾酶蛋白质在细胞中的水平增加或者细胞分泌的肾酶蛋白质水平增加和/或肾酶活性增加介导的或者与之相关的疾病、障碍或者病变提供有效的诊断和/或治疗方法。
本领域技术人员意识到一种降低细胞中肾酶mRNA和/或蛋白质水平的方式是抑制编码该蛋白质的核酸的表达。肾酶的表达可以使用例如反义分子抑制，也可以通过使用核酶或者双链RNA抑制，例如Wianny and Kernicka-Goetz(2000，Nature Cell Biol.270-75)所描述。
RNA干扰(RNAi)是一种现象，其中双链RNA(dsRNA)导入不同类的生物体和细胞类型中引起互补mRNA的降解。在细胞中，长的dsRNA由称作Dicer的核糖核酸酶切割成短的21-25个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。随后siRNA与蛋白质成分装配成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，在这个过程中解旋。然后通过siRNA反义链与mRNA之间的碱基配对相互作用，激活的RISC与互补转录物结合。结合的mRNA被切割，mRNA的序列特异性降解导致基因沉默。见例如美国专利No.6,506,559；Fire et al.，Nature(1998)391(19)306-311；Timmons et al.，Nature(1998)395854；Montgomery et al.，TIG(1998)14(7)255-258；David R.Engelke，Ed.，RNA Interference(RNAi)Nuts & Bolts of RNAi Technology，DNAPress(2003)；及Gregory J.Hannon，Ed.，RNAi A Guide to GeneSilencing，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2003)所描述。因此，本发明还包括通过使用RNAi技术使编码肾酶的基因沉默的方法。
反义分子及其在抑制基因表达中的应用为本领域所熟知(见例如Cohen，1989，InOligodeoxyribonucleotides，Antisense Inhibitors ofGene Expression，CRC Press)。如本文别处所解释，反义核酸是与特异的mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub，1990，Scientific American 26240)。在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链的分子，从而抑制基因的翻译。
抑制基因翻译的反义方法的应用为本领域所已知，例如Marcus-Sakura(1988，Anal.Biochem.172289)所描述。这种反义分子可以使用编码该反义分子的DNA通过遗传表达提供给细胞，如Inoue(1993，美国专利No.5,190,931)所教导。
或者，本发明的反义分子可以合成产生，然后提供给细胞。优选大约10-30个、更优选大约15个核苷酸的反义寡聚体，因为它们易于合成及导入靶细胞中。本发明涵盖的合成的反义分子包括本领域已知的寡核苷酸衍生物，其与未修饰的寡核苷酸相比具有改良的生物学活性(见Cohen，如前；Tullis，1991，美国专利No.5,023,243，所述文献以其全文并入作参考)。
核酶及其抑制基因表达的应用也为本领域所熟知(见例如Cech etal.，1992，J.Biol.Chem.26717479-17482；Hampel et al.，1989，Biochemistry 284929-4933；Eckstein et al.，国际出版物WO 92/07065；Altman et al.，美国专利No.5,168,053，所述文献以其全文并入作参考)。核酶是具有以与DNA限制性核酸内切酶相似方式特异性切割其它单链RNA的能力的RNA分子。通过对编码这些RNA的核苷酸序列进行修饰，可以将分子工程化为识别RNA分子中特异性核苷酸序列并切割其(Cech，1988，J.Amer.Med.Assn.2603030)。这种方法的主要优点是由于其是序列特异性的，因此只有具有特定序列的mRNA被失活。
有两种基本类型的核酶，即四膜虫型(Hasselhoff，1988，Nature 334585)和锤头型。四膜虫型核酶识别长度为四个碱基的序列，而锤头型核酶识别长度为11-18个碱基的碱基序列。序列越长，则序列在仅靶mRNA物种中发生的可能性就越大。因此，对于失活特异的mRNA物种优选锤头型核酶而非四膜虫型核酶，优选18个碱基识别序列而非可以在多种不相关mRNA分子中随机发生的较短的识别序列。
用于抑制肾酶表达的核酶可以通过将靶序列掺入基本核酶结构中而设计，所述靶序列与由肾酶编码的肾酶的mRNA序列互补，或者与SEQ ID NO1具有至少大约33％同源性。优选地，该序列与SEQID NO1具有至少大约35％、更优选40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％及最优选99％同源性。靶向肾酶的核酶可以使用商购试剂(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)合成或者可以从编码其的DNA中遗传表达。
V.重组细胞和转基因非人哺乳动物本发明包括一种重组细胞，其包含编码肾酶的分离的核酸、与其互补的反义核酸、编码特异性结合肾酶的抗体的核酸等等。一方面，所述重组细胞可以用编码编码肾酶的核酸的一部分的载体(例如质粒等)瞬时转染。所述核酸不需要整合进细胞基因组中，也不需要在细胞中表达。另外，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞，本发明不限于任何特定的细胞系或者细胞类型。这种细胞包括但不限于成纤维细胞、小鼠干细胞、两栖动物卵母细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等等。
一方面，使用包含编码哺乳动物肾酶的分离的核酸的重组细胞产生转基因非人哺乳动物。即将本发明的外源核酸或者在本文也称作的“转基因”导入细胞中，然后使用该细胞产生非人转基因哺乳动物。其中导入了转基因的细胞优选是胚胎干(ES)细胞。然而，本发明非仅限于包含本发明的转基因的ES细胞，也不限于用于产生转基因动物的细胞。更确切地，本发明的转基因细胞包括但不限于衍生自包含转基因的转基因动物的任何细胞，包含衍生自转基因ES细胞的嵌合动物的转基因的细胞，及包含可用于或不可用于产生非人转基因哺乳动物的转基因的任何其它细胞。
另外，重要的是注意包含转基因的细胞即重组细胞应不限于产生转基因哺乳动物。更确切地，本发明应解释为包括其中导入了编码哺乳动物肾酶的核酸的任何类型的细胞，包括但不限于包含编码哺乳动物肾酶的分离的核酸的原核细胞和真核细胞。
当细胞是真核细胞时，所述细胞可以是任何真核细胞，其当本发明的转基因导入其中及由所需基因编码的蛋白质不再从中表达时获得益处。这种益处可包括提供了一种系统，其中所需基因的表达缺乏可以在体外在实验室或者在所述细胞存在的哺乳动物中研究；还提供了一种系统，其中包含导入的基因缺失的细胞可以用作研究、诊断和治疗工具；及还提供了一种系统，其中产生动物模型用于揭示对于在哺乳动物中经选择的疾病包括例如ESRD和高血压的新的诊断和治疗工具。
或者，本发明包括一种真核细胞，其当本发明的转基因导入其中及所需基因编码的蛋白质从中表达时获得益处，所述蛋白质在细胞中先前不存在或不表达，或者所述蛋白质现在在细胞中以与在导入转基因之前不同的水平或情况下表达。这种益处可包括提供了一种系统，其中所需基因的表达可以在体外在实验室中或者在细胞存在的哺乳动物中研究；还提供了一种系统，其中包含导入的基因的细胞可以用作研究、诊断和治疗工具；及还提供了一种系统，其中产生动物模型以用于揭示对于哺乳动物中选择的疾病的新的诊断和治疗工具。
这种表达编码肾酶的分离的核酸的细胞可用于为细胞、组织或者整个动物提供肾酶，其中较高水平的肾酶可用于治疗或者减轻与低水平的肾酶表达和/或活性相关的疾病、障碍或病变。这种疾病、障碍或病变包括但不限于ESRD、高血压、心血管疾病。因此，肾酶的额外表达可使血压降低。因此，本发明包括一种表达肾酶的细胞，以增加或者诱导肾酶表达、翻译和/或活性，其中增加肾酶表达、蛋白质水平和/或活性可用于治疗或者减轻疾病、障碍或病变。
本领域技术人员基于本文提供的教导意识到，本发明的“敲入(knock-in)”或者“敲除”载体包含分别与被置换或缺失的核酸的两个部分同源的至少两个序列。这两个序列与基因两侧的序列同源；即一个序列位于在编码肾酶的核酸的编码序列5’部分或其邻近的区域同源，另一个序列在第一个序列的下游。本领域技术人员基于本文提供的教导意识到，本发明不限于任何特别的侧翼核酸序列。相反，靶向载体可包含两个序列，这两个序列分别在哺乳动物基因组中除去一些或者所有编码肾酶的核酸或其片段(即“敲除”载体)或者插入编码肾酶的核酸或其片段(即“敲入”载体)。靶向载体的极其重要的特点是其在敲除载体的情况中，包含足够的位于相反方向的两个序列部分，即位于肾酶开放读框(ORF)的5’和3’末端，使得可以通过同源重组而产生缺失/插入，由此全部或部分编码肾酶的核酸在哺乳动物染色体中从某位缺失或插入。
转基因及敲入和敲除靶向载体的设计为本领域所熟知，见例如Sambrook et al.(1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)及Ausubel et al.(1997，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)等所描述。在靶向载体中使用的肾酶编码区两侧或者其中的上游和下游部分可基于已知方法及本文提供的教导容易地选择，所述教导包括大鼠和人肾酶的核酸和氨基酸序列。借助于这些序列，本发明技术人员可以构建本发明的转基因和敲除载体。
本发明进一步包括一种敲除靶向载体，其包含编码可选择的标记的核酸，例如编码neoR基因的核酸，从而可以选择其中编码肾酶的核酸或其一部分已经缺失或者用新霉素抗性基因置换(通过细胞在存在G418的情况下生长的能力进行选择)的转基因细胞。然而，本发明不限于新霉素抗性作为可选择标记。更确切地，本领域熟知的其它可选择标记可用于敲除靶向载体中，使得可以选择其中肾酶基因已经缺失和/或失活及由编码可选择的标记的核酸置换的重组细胞。选择可选择标记及将其掺入载体中的方法为本领域所熟知，见例如Sambrook et al.(1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)和Ausubel et al.(1997，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)所描述。
如本文所述，本发明包括非人转基因哺乳动物(即敲除转基因动物)，在其基因组所需位点插入了外源核酸，从而缺失了所需内源靶基因的编码区。本发明进一步包括一种转基因的非人哺乳动物，其中编码肾酶的外源核酸插入在基因组中一个位点，即“敲入”转基因哺乳动物。插入的敲入转基因可包含多种核酸，例如编码标记多肽的核酸、与编码正常在细胞中不存在的肾酶的核酸可操纵地连接的或者与肾酶非典型可操纵地连接的启动子/调节区的核酸。
本发明的非人转基因哺乳动物的产生优选使用本文所述的方法实现。然而，本发明不限于使用这种方法，也可以使用其它方法产生所需敲除哺乳动物。在产生非人转基因哺乳动物的优选方法中，产生包含本发明转基因的ES细胞，然后将该细胞用于产生敲除动物，基本如Nagy and Rossant(1993，InGene Targeting，A Practical Approach，pp.146-179，Joyner ed.，IRL Press)所述。如果将ES细胞注入宿主胚泡中而送回胚胎环境中或者与卵裂球阶段的胚胎聚合，则ES细胞表现为正常的胚胎细胞。当这样送回时，细胞具有沿着胚胎所有世系发育的充分潜力。因此，也可以获得其中导入了所需DNA的ES细胞，然后将该细胞送回胚胎环境中发育成成熟的哺乳动物细胞，其中所需DNA可以表达。
产生转基因小鼠的确切方案由Nagy and Rossant(1993，InGeneTargeting，A Practical Approach，Joyner ed.IRL Press，pp.146-179)揭示，在此不再重复。转染或转导ES细胞以在其中导入所需DNA使用标准方案完成，例如Sambrook et al.(1989，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)及Ausubel et al.(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York)所述。优选地，本发明的转基因中包含的所需DNA是经电穿孔导入ES细胞中，并如Soriano et al.(1991，Cell 64693-702)所述增殖该细胞。
将分离的核酸导入哺乳动物受精卵中是通过任何标准转基因技术完成的(Hogan et al.，1986，Manipulating the Mouse EmbryoALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)。最普遍的是将核酸通过显微注射的方式导入胚胎中。
一旦将核酸导入卵中，则将该卵短时间保温，然后移至与获得该卵相同物种的假孕哺乳动物中，例如Hogan et al.(1986，Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)所述。典型地，每次实验注射多个卵，大约2/3的卵存活。然后将大约20个存活的卵移至假孕动物中，通常4-10个如此转移的存活卵发育成活的幼仔。
本发明的方法中可以使用任何哺乳动物肾酶基因产生携带包含缺失全部或部分哺乳动物肾酶基因的转基因的转基因哺乳动物或者转基因细胞。
本发明的转基因哺乳动物可以是任何物种的哺乳动物。因此，本发明应解释为包括产生编码嵌合核酸的转基因哺乳动物，该哺乳动物包括小鼠、仓鼠、大鼠、兔、猪、绵羊和牛。本发明所述的产生转基因小鼠的方法可相似地用于任何哺乳动物物种。优选地，本发明的转基因哺乳动物是啮齿动物，更优选地，本发明的转基因哺乳动物是小鼠。例如Lukkarinen et al.(1997，Stroke 28639-645)教导可以产生转基因小鼠的基因构建体也可以产生其它转基因啮齿动物，包括大鼠。相似地，一个物种动物的基因座中零合基因(nullizygous)突变可以在与第一个物种高度同源的具有基因座的另一物种动物中复制。
为了鉴别本发明的转基因哺乳动物，检测幼仔中所述分离的核酸的存在情况，使用标准技术如Southern印迹杂交、PCR和/或RT-PCR进行。所述核酸在哺乳动物细胞和组织中的表达也使用本发明描述的常规技术评定。进一步地，如果肾酶蛋白质是分泌的，则转基因动物的循环血液中肾酶的存在与否可以使用例如Western印迹分析或者使用本领域熟知的检测蛋白质的标准方法确定。
得自本发明转基因哺乳动物的细胞在本文认为是“转基因细胞”，其包括如得自肾酶(+/-)和(-/-)转基因非人哺乳动物的那些细胞，是对确信与肾酶表达水平改变相关的哺乳动物疾病和症状建模的有效系统，所述疾病如ESRD、高血压、心血管疾病及与肾酶表达水平改变相关的任何其它疾病、障碍或病变。
特别合适的细胞是衍生自本文所述非人敲除或者敲入转基因哺乳动物组织的细胞，其中包含肾酶基因的转基因在多种组织中表达或者抑制肾酶的表达。例如，从中衍生这种细胞的细胞类型包括(1)肾酶(+/+)、(+/-)和-/-)非人转基因活产哺乳动物的成纤维细胞等，(2)肾酶(+/+)、(-/-)或(+/-)动物胚胎的成纤维细胞，及(3)得自肾酶(+/+)、(-/-)和(+/-)胚胎和活产哺乳动物的胎盘细胞系。
本领域技术人员基于本文教导意识到包含降低水平肾酶蛋白、降低水平肾酶活性或者两者的细胞包括但不限于表达肾酶表达抑制剂(例如反义或者核酶分子)的细胞。
用于维持培养中的哺乳动物细胞的方法和组合物为本领域所熟知，其中哺乳动物细胞得自哺乳动物，包括但不限于得自小鼠如本发明所述转基因小鼠的细胞。
或者，在离体和体内治疗方法中可以给予表达肾酶的重组细胞，其中给予所述重组细胞，从而给予细胞、组织和/或动物所述蛋白质。另外，所述重组细胞用于揭示肾酶配体和肾酶信号途径。
本发明的重组细胞可用于研究肾酶水平增加或降低对细胞稳态和细胞增殖和/或迁移的作用，因为已经推测肾酶在细胞迁移、外膜纤维化、动脉再狭窄、阴性重塑等方面起作用。
本发明的重组细胞也可以用于离体和体内细胞治疗方法中，其中所述细胞已经工程化为不表达肾酶或者表达缺少生物学活性的降低或改变的肾酶，动物自身的细胞(例如成纤维细胞等)或者同系匹配的供体的细胞均如本文别处所述进行重组工程化(例如通过插入反义核酸或者敲除载体，由此在重组细胞中肾酶表达和/或蛋白质水平降低)，将重组细胞给予受体动物。在这种方式中，低水平表达肾酶的重组细胞可以给予其自身细胞表达高水平肾酶的动物，从而治疗或者减轻本文别处所述的与肾酶表达增加相关或者由其介导的疾病、障碍或病变。
使得对于外膜纤维化、动脉再狭窄等易感的本发明的转基因哺乳动物如肾酶敲除小鼠，可用于研究这些疾病的发病机制及其中肾酶的潜在作用。
进一步地，本发明的转基因哺乳动物和/或细胞可用于进一步研究肾酶的亚细胞定位。而且，本发明的转基因哺乳动物(+/-和-/-活产动物和胚胎)和/或细胞也可用于研究肾酶在儿茶酚胺循环中的作用，以阐明肾酶作用靶位以及与肾酶结合介导其在细胞中作用的任何受体和/或配体。
VI.抗体本发明还包括特异性结合肾酶或其片段的抗体。本领域技术人员基于本文提供的教导理解特异性结合肾酶的抗体与本发明的蛋白质结合，例如但不限于与人肾酶或者其免疫原部分结合。在一个实施方案中，抗体针对大鼠肾酶，包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
多克隆抗体是根据本领域熟知的标准免疫学技术通过免疫兔而产生的(见例如Harlow et al.，1988，InAntibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)。这种技术包括用一种嵌合蛋白免疫动物，所述嵌合蛋白包含一部分另一种蛋白质，如麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽(GSH)标记多肽部分，和/或一种部分，使得肾酶部分是免疫原性的(例如与匙孔血蓝蛋白KLH缀合的肾酶)及包含各自的啮齿动物和/或人肾酶氨基酸残基的部分。所述嵌合蛋白是通过将编码肾酶的合适核酸(例如SEQ ID NO1)克隆进适于此目的的质粒载体中而产生的，所述载体例如但不限于是pMAL-2或pCMX。
然而，本发明不限于这些抗体或者这些蛋白质抗原部分。本发明包括大鼠和人肾酶的其它抗体或其部分。进一步地，本发明包括与肾酶结合的抗体，这些抗体在对组织进行免疫组织化学染色中及在对用编码至少一部分肾酶的核酸瞬时转染的细胞的免疫荧光显微术中，能结合Western印迹上存在的肾酶，从而确定肾酶在组织中的位置。
本领域技术人员基于本文提供的教导意识到抗体可以特异性结合所述蛋白质的任何部分，全长蛋白质可用于产生特异于其的抗体。然而，本发明不限于使用全长蛋白质作为免疫原。更确切地，本发明包括使用所述蛋白质的免疫原性部分产生特异性结合哺乳动物肾酶的抗体。即本发明包括使用肾酶蛋白的免疫原性部分或者抗原决定簇免疫动物。抗体可以通过用本发明的蛋白质或其一部分免疫动物例如但不限于兔或者小鼠而产生，或者通过用包含至少一部分肾酶的蛋白质或者融合蛋白免疫动物而产生，所述融合蛋白包括包含例如与包含合适的肾酶氨基酸残基的共价连接的麦芽糖结合蛋白标记多肽部分的标记多肽部分。本领域技术人员基于本文提供的教导意识到这些蛋白质的较小片段也可以用于产生特异性结合肾酶的抗体。
本领域技术人员基于本文提供的教导意识到分离的肾酶多肽的不同部分均可用于产生针对肾酶高度保守区域或者该多肽的非保守区域的抗体。如本文别处所揭示，肾酶包含不同的保守结构域，包括但不限于N末端的推定信号肽，FAD结合结构域(从大约第4-35位氨基酸残基)；胺氧化酶结构域(从大约第75-339位氨基酸残基)。
结合肾酶的序列及该蛋白质的多个保守和非保守结构域的详细定位分析，本领域技术人员基于本文提供的教导懂得如何使用本领域熟知的方法以及本文所述的方法获得特异于哺乳动物肾酶多肽的多个部分的抗体。
进一步地，本领域技术人员基于本文提供的教导意识到感兴趣蛋白质的非保守区域与在不同生物体中高度保守的区域相比更具免疫原性。进一步地，使用非保守的免疫原性部分进行免疫可以产生特异于非保守区域的抗体，从而产生与共有一或多个保守部分的其它蛋白质不交叉反应的抗体。因此，本领域技术人员基于本文教导意识到每个肾酶分子的非保守区域可用于产生仅特异于该肾酶并且与其它肾酶或者其它蛋白质无特异性、不交叉反应的抗体。
或者，本领域技术人员基于本文的教导懂得使用在一或多个肾酶分子中保守的区域产生的抗体可用于产生与一或多个肾酶分子特异性反应的抗体。产生与保守的蛋白质结构域(该结构域与蛋白质的其它部分相比免疫原性较低)特异性结合的抗体的方法为本领域所熟知，包括但不限于将感兴趣蛋白质片段与一种分子(例如匙孔血蓝蛋白等)缀合，从而使得该蛋白质结构域是免疫原性的，或者通过使用佐剂(例如Freund′s完全和/或不完全佐剂等)或者通过这两种方法进行。因此，本发明包括识别至少一种肾酶的抗体及特异性结合一种以上肾酶的抗体，包括与所有肾酶均特异性结合的抗体。
本领域技术人员基于本文的教导意识到部分肾酶与共有保守结构域的其它蛋白质的同源性较低。然而，本发明不限于任何特定结构域；相反，本领域技术人员理解本发明肾酶蛋白的其它非保守区域也可用于产生本文所述的本发明抗体。
因此，本领域技术人员基于本文提供的教导意识到本发明包括中和和/或抑制肾酶活性的抗体(例如通过抑制必需的肾酶受体/配体相互作用)，所述抗体可识别一或多种肾酶，包括但不限于人肾酶以及不同物种的肾酶(例如小鼠肾酶)。
本发明不仅限于本文揭示的抗体或者本发明蛋白质的任何特定免疫原性部分。更确切地，本发明包括肾酶的其它抗体或其部分，或者与具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽具有至少大约15％同源性的蛋白质的抗体。在其它实施方案中，所述多肽与人肾酶具有至少大约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者至少大约99％同源性。在另一个实施方案中，与特异于哺乳动物肾酶的抗体特异性结合的多肽是人肾酶。
本发明包括多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体等等。本领域技术人员基于本文教导理解本发明的抗体的关键特征是其与肾酶特异性结合。即本发明的抗体识别肾酶或其片段(例如其免疫原性部分或者抗原决定簇)，这通过在使用本领域熟知的标准方法进行的细胞免疫染色和/或肾酶免疫沉淀中抗体结合Western印迹上的肾酶而证实。
本领域技术人员基于本文教导意识到所述抗体可用于确定相关蛋白质在细胞中的位置，并用于研究其识别的抗原在细胞进程中的作用。另外，所述抗体可用于检测或者测定生物学样品中存在的蛋白质的量，使用熟知的方法例如但不限于Western印迹和酶联免疫吸附测定(ELISA)进行。另外，所述抗体可用于使用本领域熟知的方法免疫沉淀和/或免疫亲和纯化其同族抗原。
另外，所述抗体可用于降低细胞中肾酶的水平，从而抑制肾酶在细胞中的作用。因此，通过给予动物的细胞或组织或者给予动物自身所述抗体，可因此抑制必需的肾酶受体/配体相互作用，由此肾酶介导的信号化作用也被抑制。本领域技术人员基于本文的教导理解使用抗肾酶抗体抑制肾酶配体/受体相互作用的可检测到的作用可包括但不限于细胞增殖降低、细胞迁移降低、阴性重塑降低、外膜纤维化降低、动脉再狭窄降低、任何器官或组织的纤维化降低、骨化或骨形成降低等等。
多克隆抗体的产生通过用抗原接种所需动物并分离特异性结合该抗原的抗体而实现，使用标准的抗体产生方法进行，例如，Harlowet al.(1988，InAntibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)所述。
针对全长蛋白质或肽或者其肽片段可以使用任何熟知的单克隆抗体制备方法制备单克隆抗体，例如Harlow et al.(1988，InAntibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)和Tuszynski et al.(1988，Blood，72109-115)所述方法。所需肽的量也可以使用化学合成技术合成。或者，可以克隆编码所需肽的DNA并在适于产生大量肽的细胞中从合适的启动子序列表达。针对所述肽的单克隆抗体使用标准方法从用所述肽免疫的小鼠中产生。
使用本文所述方法获得的编码单克隆抗体的核酸可以使用本领域可利用的方法克隆和测序，例如Wright et al.(1992，Critical Rev.Immunol.12125-168)及其参考文献中所述的方法。
进一步地，本发明的抗体可以是人源化的，使用例如Wright et al.(如前)及其参考文献和Gu et al.(1997，Thrombosis and Hematocyst 77755-759)所述方法及本领域熟知的其它人源化抗体的方法进行。
为了产生噬菌体抗体文库，首先从分离自细胞例如杂交瘤的mRNA中获得cDNA文库，所述细胞在噬菌体表面上表达要被表达的所需蛋白质(例如希望的抗体)。所述mRNA的cDNA拷贝使用逆转录酶产生。表示免疫球蛋白片段的cDNA通过PCR获得，将所得DNA克隆进合适的噬菌体载体中以产生包含表示免疫球蛋白基因的DNA的噬菌体DNA文库。产生包含异源DNA的噬菌体文库的方法为本领域所熟知，例如Sambrook等(如前)所述。
编码所需抗体的噬菌体可以进行工程化，由此所述蛋白质以这样的方式在其表面上展示，所述方式是其可用于结合其相应的结合蛋白，例如该抗体针对的抗原。因此，当表达特异性抗体的噬菌体在存在表达相应抗原的细胞的条件下保温时，该噬菌体将与该细胞结合。不表达抗体的噬菌体与该细胞不结合。这种淘选方法为本领域所熟知，例如Wright等(如前)所述。
如上述方法已使用M13噬菌体展示产生人抗体(Burton et al.，1994，Adv.Immunol.57191-280)。基本上，从得自抗体生产细胞群的mRNA中产生cDNA文库。所述mRNA编码重排的免疫球蛋白基因，因此cDNA也编码其。扩增的cDNA克隆进M13表达载体中产生在其表面上表达人Fab片段的噬菌体文库。展示感兴趣抗体的噬菌体通过抗原结合进行选择，并在细菌中增殖以产生可溶的人Fab免疫球蛋白。因此，与常规的单克隆抗体合成方法不同，这个方法使得编码人免疫球蛋白的DNA无限增殖化，而不是使得表达人免疫球蛋白的细胞无限增殖化。
上述方法描述了编码抗体分子的Fab部分的噬菌体的产生。然而，本发明非仅限于产生编码Fab抗体的噬菌体。更确切地，本发明还包括编码单链抗体(scFv/噬菌体抗体文库)的噬菌体。Fab分子包含全部的Ig轻链，即其包含轻链的可变区和恒定区，但仅包括重链的可变区和第一个恒定区结构域(CH1)。单链抗体分子包含包含Ig Fv片段的蛋白质的轻链。Ig Fv片段仅包括抗体的重链和轻链的可变区，其中不包含恒定区。包含scFv DNA的噬菌体文库可以根据Marks etal.(1991，J.Mol.Biol.222581-597)所述方法产生。淘选如此产生的噬菌体以分离所需抗体是以与针对包含Fab DNA的噬菌体文库描述的相似方式进行的。
本发明还包括合成的噬菌体展示文库，其中重链和轻链可变区可以合成，由此它们包括几乎所有可能的特异性(Barbas，1995，NatureMedicine 1837-839；de Kruif et al.1995，J.Mol.Biol.24897-105)。
VII.组合物本发明包括一种组合物，其包含与编码哺乳动物肾酶的核酸或其一部分互补的分离的核酸，其对于转录是反义方向。优选地，所述组合物包含一种药物可接受的载体。
本发明包括一种组合物，其包含本发明所述分离的哺乳动物肾酶多肽。优选地，所述组合物包含一种药物可接受的载体。
本发明还包括一种组合物，其包含特异性结合肾酶的抗体。优选地，所述组合物包含一种药物可接受的载体。
本发明进一步包括一种组合物，其包含编码哺乳动物肾酶的一种分离的核酸。优选地，所述组合物包含一种药物可接受的载体。
所述组合物可用于将肾酶给予细胞、组织或者动物，或者抑制细胞、组织或者动物中肾酶的表达。所述组合物用于治疗肾酶表达改变介导的疾病、障碍或病变，由此细胞、组织或动物中肾酶表达降低或升高或者蛋白质水平的降低或升高对于动物是有益的。即在动物的疾病、障碍或者病变是由肾酶表达水平或者蛋白质水平改变所介导或与其相关的情况中，该组合物可用于调节肾酶的这种表达或蛋白质水平。
为了给予哺乳动物，多肽或者编码其的核酸和/或与其全部或一部分互补的反义核酸可以悬浮在任何药物可接受的载体中，所述载体例如是pH为大约7.8的HEPES缓冲盐水。
可用的其它药物可接受的载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇及其它药物可接受的盐溶液，如磷酸盐和有机酸盐。为本领域技术人员已知的这些及其它药物可接受的载体的例子在Remington′sPharmaceutical Sciences(1991，Mack Publication Co.，New Jersey)中描述。
所述药物组合物可以无菌可注射水溶液或者油相悬浮液或者溶液形式制备、包装或销售。这种悬浮液或者溶液可以根据本领域已知方法配制，除了活性成分之外还可包含本文所述的额外成分如分散剂、增湿剂或者悬浮剂。这种无菌可注射的制剂可以使用无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂制备，例如水或者1，3-丁二醇。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于Ringer′s溶液、等渗氯化钠溶液及非挥发油如合成的甘油一酯或甘油二酯。
可用于本发明方法中的药物组合物可以适于口服、直肠、阴道、胃肠外、局部、肺部、鼻内、口腔、眼或者其它给予途径的制剂给予、制备、包装和/或销售。其它制剂包括计划的纳米颗粒(projectednanoparticle)、脂质体制品、含有活性成分的重封闭红细胞(resealederythrocyte)及基于免疫学的制剂。
如本文所用，“纳米颗粒”是指直径为1-1000纳米、任何大小、形状或形态的微粒。纳米颗粒甚至可以是“纳米壳(nanoshell)”，其是具有不连续的电介质或者半导体核心部分、周围围绕一或多个传导壳层的纳米颗粒。“纳米壳”是特征在于不连续的核心/壳结构的纳米颗粒。纳米壳和纳米颗粒均可以含有结合例如负电荷分子如DNA、RNA等的掺杂剂。常用的正电荷掺杂剂的例子包括Pr3、Er3和Nd3。如本文所用，“壳”是指通常围绕一个核心的至少一部分的一或多个壳。在较大的纳米壳中可以掺入几个核心。在一个实施方案中，使用标准方法将纳米颗粒给予动物。
如本文所用，术语“输送”纳米颗粒是用于描述例如通过静脉内将纳米颗粒置于附着于、紧邻或者足够接近靶向位置，以使得能与靶位置的细胞接触的微粒数目最大化。
本发明的组合物包括与纳米颗粒结合的核酸序列及其使用方法。结合的纳米颗粒可用于将核酸序列输送至多个生物学靶位，如内皮细胞。在一个实施方案中，所述核酸，例如在基因表达启动子控制下的核酸基因附着于阳性掺杂的纳米核心，然后由包括特异于例如感兴趣细胞上配体靶位的靶向配体的壳围绕。
本发明的一个实施方案涉及与纳米颗粒结合的核酸序列。所述纳米颗粒是通过“纳米颗粒前体”的装配而制备的。核酸序列通常可以是对于输送进生物学靶位而选择的任何核酸序列。所述核酸序列可以是DNA、RNA、PNA或者其它合成或修饰的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列是编码人肾酶的DNA序列(GenBank登记号BC 005364)。所述DNA序列可以是天然发生的序列，经修饰的天然发生的序列，或者合成序列。在一个实施方案中，所述核酸被修饰以最大化靶宿主的密码子使用百分比。天然发生的序列可以是人、猴、牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、熊、兔、驼鹿、鱼、羊、或者其它动物序列。所述序列可以被修饰添加或缺失特定序列。例如，DNA序列可以修饰例如除去限制位点、消除共有的切割或者突变位点、最大化结合纳米核心。所述序列可以进一步被修饰包括有助于转录、翻译、定位、消除蛋白质切割位点、加入切割和/或加工位点及加入或者除去糖基化位点的额外序列。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒前体包括与纳米颗粒聚合物结合的核酸序列。纳米颗粒前体与核酸之间的键可以是非共价键或者共价键。纳米颗粒聚合物可以是能装配为纳米颗粒的任何聚合物。例如，核酸序列可以与第一种聚合物非共价结合。该第一种聚合物可以是结合DNA的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)。所述第一种聚合物与第二种聚合物可以共价结合。第二种聚合物可以是亲水性聚合物，如聚乙二醇(PEG)。例如，第二种聚合物可以与PEI的伯胺部分缀合。
所述亲水性聚合物可以与配体如抗体结合。抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体，优选单克隆抗体。所述抗体可以特异于生物学受体或者其它细胞表达的蛋白质。例如，所述抗体可以结合凝集素样氧化的低密度脂蛋白(LDL)受体-1，Lox-1。抗体提供引人注目的结合能力，但是具有相对高的空间大小。较小的抗体片段或者其它结合肽或分子在本发明的多个实施方案中可以用作配体。
当纳米颗粒前体自身装配时，核酸分子包囊在形成的纳米颗粒中，抗体或者配体存在于纳米颗粒的表面。包囊化的核酸分子被部分或者全面保护免于环境、酶、水解或者其它降解力的降解。
装配的纳米颗粒通常平均直径为大约1nm-1000nm。更精密的直径范围是大约10nm-250nm，及大约40nm-100nm。
本发明的另一个实施方案涉及装配的纳米颗粒。装配的纳米颗粒包含已经在溶液中装配的纳米颗粒前体。装配的纳米颗粒优选在纳米颗粒的内部容积中含有核酸序列，在纳米颗粒的外表面上存在抗体或其它结合肽。纳米颗粒通常可以是任何形状的，优选大约球形的。所述抗体优选保持其天然构象，可以与其天然靶位结合。
装配的纳米颗粒可以多种制剂形式存在，包括于溶液中、无水、于脂质体中等等。制剂的特别例子包括富勒烯纳米颗粒、由相反电荷的聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和硫酸葡聚糖(DS)组成、由锌作为稳定剂的水相纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、衍生自Tris(羟甲基)氨基甲烷的末端加帽的寡聚体，具有氢或者氟碳尾、缀合的聚(氨基聚(乙二醇)氰基丙烯酸酯-共-十六烷基氰基丙烯酸酯(聚(H(2)NPEGCA-共-HDCA)纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒，由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及水溶性生物可降解的聚磷酸酯配制、聚(2-氨乙基丙烯磷酸)(PPE-EA)纳米颗粒。
本发明还涉及制备装配的纳米颗粒的方法。所述方法可包括形成聚合物缀合物，并将该聚合物缀合物与核酸接触以形成纳米颗粒。所述聚合物缀合物包括第一种聚合物、第二种聚合物和配体。第一种聚合物优选以非共价方式结合核酸。优选的第一种聚合物是结合DNA的阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)。第二种聚合物可以是一种亲水性聚合物，如聚乙二醇(PEG)。所述配体优选是抗体。
优选所述聚合物缀合物的部分是通过共价键连接的。聚合物缀合物的特定装配顺序可以改变。例如，可以将第一种聚合物与第二种聚合物连接，然后再与配体连接。或者，可以将第二种聚合物与配体连接，然后再与第一种聚合物连接。所述方法可进一步包括在接触步骤之后进行分离或者纯化步骤。所述装配的纳米颗粒可用于多种应用。所述纳米颗粒可以在体外或者体内应用中使用。
本发明还提供了一种微晶形式的肾酶药物组合物。已经揭示了获得蛋白质晶体的多种方法，包括自由界面扩散方法(free interfacediffusion method)(Salemme，F.R.(1972)Arch.Biochem.Biophys.151533-539)、悬滴或座滴蒸气扩散法(vapor diffusion in the hanging orsitting drop method)(McPherson，A.(1982)Preparation and Analysis ofProtein Crystals，John Wiley and Son，New York，pp 82-127)和液体透析(Bailey，K.(1940)Nature 145934-935)。与非晶体蛋白质相比，晶体蛋白质在蛋白质的稳定性和浓度上提供了显著改良，使得可以口服和胃肠外输送蛋白质。在一些情况中，特殊晶体形式的分子具有更多的生物学活性，较迅速地溶解，不易于分解和/或较易于纯化。
蛋白质、糖蛋白、酶、抗体、激素和肽晶体或者晶体制剂可以在组合物中包囊化，以生物学输送至人和动物。本领域熟知使蛋白质结晶的方法，使用药物成分或赋形剂制备稳定制剂的方法，及任选将其在聚合物载体中包囊化产生组合物及使用这种蛋白质晶体制剂和组合物进行生物医学应用、包括输送治疗性蛋白质和疫苗的方法。例如，美国专利No.6,541,606揭示了蛋白质晶体或者晶体制剂在包含聚合物载体的基质中包囊化以形成组合物。所述制剂和组合物增强了蛋白质天然生物学活性三级结构的保存，并产生在需要之处和需要时可缓慢释放活性蛋白质的集合库。这种聚合物载体包括生物相容的和可生物降解的聚合物。生物学活性蛋白质随后以控制方式释放一段时间，这通过特殊的包囊化技术、聚合物制剂、晶体几何学、晶体溶解性、晶体交联和使用的配制条件而决定。
本发明的组合物可以通过多种途径给予，包括但不限于口服、直肠、阴道、肠道外、局部、肺部、鼻内、口腔或者眼部给予途径。给予途径易于为本领域技术人员所显而易见，并且依赖于包括治疗的疾病的类型和严重性、治疗的动物或者人患者的类型和年龄等多种因素。
用于本发明方法中的药物组合物可以口服固体制剂、眼药、栓剂、气雾剂、局部或其它相似制剂形式全身给予。除了化合物如硫酸乙酰肝素或其生物学等价物之外，这种药物组合物还可以含有药物可接受的载体及已知增强和促进药物给予的其它成分。根据本发明的方法也可以使用其它可能的制剂，如纳米颗粒、脂质体、重封闭红细胞和基于免疫学的系统，以给予肾酶和/或编码肾酶的核酸。
可以配制使用本发明所述任何方法鉴别的化合物及给予哺乳动物以治疗动脉再狭窄、外膜纤维化、任何器官或组织的纤维化、阴性重塑、过度的骨形成、过度的骨化等。
本发明包括药物组合物的制备和应用，所述药物组合物包含用于治疗动脉再狭窄、外膜纤维化、阴性重塑等的化合物作为活性成分。这种药物组合物可仅由活性成分组成，以合适形式给予对象，或者所述药物组合物可包含活性成分及一或多种药物可接受的载体，一或多种其它成分或者这些成分的组合。活性成分可以生理学可接受的酯或盐的形式存在于药物组合物中，如与生理学可接受的阳离子或者阴离子组合，这些为本领域所熟知。
如本文所用，术语“药物可接受的载体”是指与活性成分组合的一种化学组合物，在组合之后可用于将活性成分给予对象。
如本文所用，术语“生理学可接受的”酯或盐是指与药物组合物的任何其它成分相容的活性成分的酯或盐形式，其对于给予所述组合物的对象无不利影响。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过任何已知方法或者此后药物学领域揭示的方法制备。一般而言，这种制备方法包括将活性成分与载体或者一或多种其它辅助成分组合，然后如果需要或者希望则将产物成形或者包装为所需的单一或多剂量单位。
尽管对于本发明提供的药物组合物的描述主要是针对适于凭处方给予人体的药物组合物，但是本领域技术人员理解这种组合物通常适于给予所有种类的动物。本领域技术人员充分理解可以对适于给予人体的药物组合物进行修饰以可以适合给予多种动物，兽医学药理学家可以通过常规的实验设计并进行这种修饰。给予本发明药物组合物的对象包括但不限于人和其它灵长类动物，哺乳动物包括商业上相关的哺乳动物如牛、猪、马、羊、猫和狗。
可用于本发明方法中的药物组合物可以适于口服、直肠、阴道、胃肠外、局部、肺部、鼻内、口腔、眼药、鞘内或者其它途径给予的制剂来制备、包装或销售。其它制剂包括计划的纳米颗粒、脂质体制品、含有活性成分的重封闭红细胞及基于免疫学的制剂。
本发明的药物组合物可以单一单位剂量或者多个单一单位剂量体积制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是分立量的药物组合物，其包含预定量的活性成分。活性成分的量通常等于给予对象的活性成分的剂量或者这种剂量的适当分量，如一半或者1/3这种剂量。
本发明的药物组合物中活性成分、药物可接受的载体及任何其它成分的相对量根据治疗对象的特性、大小和条件及进一步根据该组合物的给予途径而变化。例如，所述组合物可包含0.1％-100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物可进一步包含一或多种另外的药物活性成分。特别涉及其它制剂，包括止吐剂和清除剂如氰化物和氰酸盐清除剂。
本发明药物组合物的控制或缓释制剂可以使用常规技术产生。适于口服的本发明药物组合物的制剂可以个别的固体剂量单位形式制备、包装或销售，所述形式包括但不限于片剂、硬或软胶囊、扁胶剂(cachet)、锭剂(troche)、或者锭剂(lozenge)，每种均含有预定量的活性成分。适于口服的其它制剂包括但不限于粉末或者颗粒制剂，水或者油悬浮液，水或者油溶液，或者乳状液。
如本文所用，“油(oily)”液体是包含含碳液体分子并呈现低于水的极性特征的液体。
包含活性成分的片剂可例如通过将活性成分及任选一或多种其它成分一起压缩或者模压成型而产生。压缩的片剂可以通过在合适的设备中将活性成分压缩为无流动的形式，如粉末或者颗粒制品，任选与一或多种结合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂混合。模压成型的片剂可以在合适的设备中对活性成分、药物可接受的载体及至少使混合物湿润的足够的液体的混合物进行模压而产生。生产片剂中使用的药物可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、粒化和分解剂、结合剂和润滑剂。已知的分散剂包括但不限于马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。已知的表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的粒化和分解剂包括但不限于玉米淀粉和褐藻酸。已知的结合剂包括但不限于明胶、阿拉伯树胶、预先明胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石。
片剂可以是无包被的或者可以是使用已知方法包被的以在对象胃肠道中延迟分解，从而提供活性成分的持续释放和吸收。例如，可以使用如甘油单硬脂酸酯或者甘油二硬脂酸酯材料包被片剂。再例如，片剂可以使用美国专利No.4,256,108、4,160,452和4,265,874的所述方法包被，以形成渗透性控制释放片剂。片剂可进一步包含甜味剂、香味剂、色素、防腐剂，或者这些材料的组合，以提供药物学上等的和美味的制品。
包含活性成分的硬胶囊可以使用生理学可降解的组合物如明胶制备。这种硬胶囊包含活性成分，并可进一步包含其它成分，包括例如惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或者高岭土。包含活性成分的软明胶胶囊可以使用生理学可降解组合物如明胶制备。这种软胶囊包含活性成分，其与水或油介质如花生油、液体石蜡或者橄榄油混合。
适于口服给予的本发明药物组合物的液体制剂可以液体形式或者以干燥的产物形式制备、包装和销售，在使用之前用水或者其它合适运载体重建(reconstitution)。
液体悬浮液可以使用常规方法制备，使得活性成分悬浮在水或者油运载体中。水运载体包括例如水和等渗盐水。油运载体包括例如杏仁油、油酯、乙醇、植物油如落花生油、橄榄油、芝麻油或者椰子油、分馏的植物油、和矿物质油如液体石蜡。液体悬浮液可进一步包含一或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、分散剂或者增湿剂、乳化剂、润滑剂、防腐剂、缓冲剂、盐、香料、色素和甜味剂。油悬浮液可进一步包含增稠剂。已知悬浮剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、氢化食用脂肪、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶、阿拉伯树胶、和纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知分散剂或者增湿剂包括但不限于天然发生的磷脂如卵磷脂，氧化烯与脂肪酸、长链脂肪醇、衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯、或者与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如聚氧乙烯硬脂酸酯、十七碳乙烯氧十六烷醇、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、和聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)的缩合产物。已知乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯树胶。已知防腐剂包括但不限于甲基、乙基或者n-丙基-对-羟基苯甲酸盐/酯、抗坏血酸和山梨酸。已知甜味剂包括例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖和糖精。对于油悬浮液的已知增稠剂包括例如蜂蜡、硬石蜡和十六烷醇。
活性成分于水或者油溶剂中的液体溶液可以与液体悬浮液基本相同的方式制备，主要不同是活性成分是溶解而不是悬浮在溶剂中。本发明药物组合物的液体溶液可包含关于液体悬浮液所述的每种成分，应理解悬浮剂非必需帮助活性成分溶解在溶剂中。水溶剂包括例如水和等渗盐水。油溶剂包括例如杏仁油、油酯、乙醇、植物油如落花生油、橄榄油、芝麻油或者椰子油、分馏的植物油、及矿物质油如液体石蜡。
本发明药物制品的粉末和颗粒制剂可以使用已知方法制备。这种制剂可以直接给予对象，例如形成片剂、充入胶囊、或者通过加入水或者油运载体制备水或者油悬浮液给予对象。每种这些制剂均可以进一步包含一或多种分散剂或者增湿剂、悬浮剂和防腐剂。其它赋形剂如装填剂和甜味剂、香料或者色素也可以包含在这些制剂中。
本发明的药物组合物也可以水包油乳状液或者油包水乳状液形式制备、包装或者销售。油相可以是植物油如橄榄油或者落花生油、矿物质油如液体石蜡，或者这些油相的组合。这种组合物可进一步包含一或多种乳化剂如天然发生的树胶如阿拉伯树胶或者西黄蓍胶，天然发生的磷脂如大豆磷脂或者卵磷脂，衍生自脂肪酸与己糖醇酐组合的酯或者偏酯如失水山梨糖醇单油酸酯，及这种偏酯与氧化乙烯的缩合产物如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。这些乳状液还可含有其它成分，包括例如甜味剂或香料。
本发明的药物组合物可以适于直肠给药的形式制备、包装或销售。这种组合物可以是例如栓剂、保留灌肠制品和直肠或结肠灌洗溶液的形式。
栓剂制剂可以通过将活性成分与无刺激性的药物可接受的赋形剂组合而制备，所述赋形剂在常室温(即大约20℃)是固体，在对象直肠温度(即在健康人体大约37℃)是液体。合适的药物可接受的赋形剂包括但不限于可可油、聚乙二醇和多种甘油酯。栓剂制剂可进一步包含多种其它成分，包括但不限于抗氧化剂和防腐剂。
保留灌肠制品或者直肠或结肠灌洗溶液可以通过将活性成分与药物可接受的液体载体组合而产生。如本领域所熟知，灌肠剂制品可以使用或者包装在适于对象直肠解剖学的输送装置中给予。灌肠剂制品可进一步包含多种其它成分，包括但不限于抗氧化剂和防腐剂。
本发明的药物组合物可以适于阴道给药的形式制备、包装或销售。这种组合物可以是例如栓剂、浸渍或者包被可插入阴道的材料如棉塞、冲洗制品、或者阴道灌洗凝胶或乳液或者溶液的形式。
将材料浸渍一种化学组合物或者用该化学组合物包被的方法为本领域所已知，包括但不限于将化学组合物在表面上沉积或者结合的方法，在材料(即如生理学可降解的材料)合成期间将化学组合物掺入材料结构中的方法，及将水或者油溶液或者悬浮液吸收进吸收材料中的方法，随后可以或不用干燥。
用于阴道灌洗的冲洗制品或者溶液可以通过将活性成分与药物可接受的液体载体组合而制备。如本领域所熟知，冲洗制品可以使用或者包装在适于对象阴道解剖学的输送载体中给予。冲洗制品可进一步包含多种其它成分，包括但不限于抗氧化剂、抗生素、抗真菌剂和防腐剂。
如本文所用，药物组合物的“胃肠外给予”包括特征在于物理性突破对象的组织并通过组织的突破口给予药物组合物的任何给予途径。胃肠外给予因此包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口应用组合物、通过穿透组织的非手术创伤应用组合物等给予所述药物组合物。特别地，胃肠外给予包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射及肾脏透析输注技术(kidney dialytic infusion techniques)。
适于胃肠外给予的药物组合物的制剂包含活性成分组合药物可接受的载体，如无菌水或者无菌等渗盐水。这种制剂可以适于推注(bolus administration)或者持续给予的形式制备、包装或销售。可注射的制剂可以单位剂量形式制备、包装或者销售，如于含有防腐剂的安瓿或者多剂量容器中。胃肠外给予的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、于油或者水载体中的乳状液、糊剂、可植入的持续释放或者可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包含一或多种其它成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或者分散剂。在胃肠外给予制剂的一个实施方案中，活性成分是以干燥形式提供的(即粉末或颗粒)，用合适的载体(例如无菌无热原水)重建后，再胃肠外给予所述重建的组合物。
所述药物组合物可以无菌可注射水或者油悬浮液或者溶液形式制备、包装或者销售。这种悬浮液或者溶液可以根据本领域已知技术配制，其除了活性成分之外还可包含其它成分，如本文所述的分散剂、增湿剂或者悬浮剂。这种无菌可注射的制剂可以使用无毒胃肠外可接受的稀释剂或者溶剂制备，例如水或者1，3-丁二醇。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于Ringer′s溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油如合成的甘油一酯或甘油二酯。可用的其它可胃肠外给予的制剂包括包含微晶形式、于脂质体制品或者作为生物可降解的聚合物系统的成分的活性成分的制剂。持续释放或者植入的组合物可包含药物可接受的聚合材料或者疏水性材料，如乳状液、离子交换树脂、微溶聚合物或者微溶盐。
适于局部给予的制剂包括但不限于流体或者半流体制品，如搽剂、洗剂、水包油或者油包水乳状液如乳液、软膏或者糊剂，及溶液或者悬浮液。可局部给予的制剂可例如包含大约1％-10％(w/w)的活性成分，但是活性成分的浓度可高如活性成分在溶剂中的溶解度极限。局部给予的制剂可进一步包含一或多种本文所述其它成分。
本发明的药物组合物可以适于通过口腔经肺部给予的制剂制备、包装或销售。这种制剂可包含包含活性成分的干燥颗粒，颗粒直径为大约0.5-7纳米，优选大约1-6纳米。这种组合物便利地是干燥粉末形式，使用包含干燥粉末贮存器的设备给予，可以向该贮存器中加入推进剂流以分散该粉末，或者使用自身推进剂溶剂/粉末分散容器如包含于密封的容器中溶解或悬浮于低沸点推进剂中的活性成分的设备。优选地，这种粉末包含颗粒，按重量计算至少98％的所述颗粒的直径大于0.5纳米，按数目计算至少95％的所述颗粒的直径小于7纳米。更优选地，按重量计算至少95％的所述颗粒的直径大于1纳米，按数目计算至少90％的所述颗粒的直径小于6纳米。干燥的粉末组合物优选包括一种固体精细粉末稀释剂，例如糖，并且便利地以单位剂量形式提供。
低沸点的推进剂通常包括在大气压下沸点低于65的液体推进剂。通常，推进剂可组成所述组合物的50-99.9％(w/w)，活性成分可组成组合物的0.1-20％(w/w)。所述推进剂可进一步包含其它成分，如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或者固体稀释剂(优选具有与包含活性成分的颗粒相同数量级的颗粒大小)。
配制为经肺部给予的本发明的药物组合物还可以溶液或者悬浮液的小液滴形式提供活性成分。这种制剂可以包含活性成分的、任选无菌的水或者稀释的醇溶液或者悬浮液稀释制备、包装或者销售，并且可以使用任何雾化或者原子化设备便利地给予。这种制剂可进一步包含一或多种其它成分，包括但不限于香料如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂、或者防腐剂如羟基苯甲酸甲酯。通过这种给予途径提供的小液滴优选平均直径为大约0.1-200纳米。
在此描述的可用于肺部输送的制剂也可用于鼻内输送本发明的药物组合物。
适于鼻内给予的另一种制剂是粗粉，其包含活性成分并且平均颗粒为大约0.2-500纳米。这种制剂是以鼻道吸入方式给予，即通过鼻从靠近鼻孔的含有所述粉末的容器中迅速吸入。
适于经鼻给予的制剂可例如包含大约少如0.1％(w/w)及多如100％(w/w)的活性成分，并且可以进一步包含本文所述一或多种其它成分。
本发明的药物组合物可以适于口腔给予的制剂制备、包装或者销售。这种制剂可例如是使用常规方法制备的片剂或者锭剂形式，并且可以例如包含0.1-20％(w/w)活性成分，剩下的包含口服可溶解或者可降解的组合物，及任选一或多种本文所述其它成分。或者，适于口腔给予的制剂可以是包含活性成分的粉末、或者雾化或原子化溶液或者悬浮液。这种粉末状、雾状或者雾化制剂当分散时，优选平均颗粒或者小液滴大小为大约0.1-200纳米，并且可进一步包含一或多种本文所述其它成分。
本发明的药物组合物可以适于眼部给药的制剂制备、包装或者销售。这种制剂可例如是滴眼液形式，例如活性成分于水或者油液体载体中的0.1-1.0％(w/w)溶液或者悬浮液。这种滴眼液可进一步包含缓冲剂、盐或者一或多种本文所述其它成分。可用的其它可眼部给药的制剂包括包含活性成分是微晶形式或者于脂质体制品中的那些制剂。
如本文所用，“其它成分”包括但不限于一或多种如下成分赋形剂、表面活性剂、分散剂、惰性稀释剂、粒化和分解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、香料、色素、防腐剂、生理学可降解的组合物如明胶、水载体和溶剂、油载体和溶剂、悬浮剂、分散或增湿剂、乳化剂、缓和剂、缓冲剂、盐、增稠剂、充填剂、乳化剂、抗氧化剂、抗生素、抗真菌剂、稳定剂、及药物可接受的聚合材料和疏水性材料。本发明药物组合物中可包含的其它“其它成分”为本领域所已知，见例如Genaro，ed.(1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，PA)所述，该文献并入本文作参考。
典型地，给予动物、优选人的本发明化合物的剂量根据众多因素而变化，包括但不限于治疗的动物类型和疾病类型，动物的年龄和给予途径。
所述化合物可以一天数次给予动物，或者低频给予，如一天一次、一周一次、每两周一次、一月一次，或者甚至更低频给予，如数月一次或者甚至一年一次或者更少。给药的频率为本领域技术人员所易知，根据多种因素决定，例如但不限于治疗疾病的类型和严重性，动物的类型和年龄等等。
用于实践本发明的载体VIII.方法A.治疗或减轻与肾酶表达相关的或由其介导的疾病、障碍或者病变的方法本发明一方面提供了一种治疗与哺乳动物肾酶相关或者由其介导的疾病、障碍和病变的方法。这种疾病、障碍和病变包括但不限于ESRD、慢性高血压、收缩期高血压、孤立性收缩期高血压、糖尿病高血压、肺部高血压、急性严重高血压、无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭(CHF)、心肌梗塞(MI)、心律紊乱、中风、动脉粥样硬化、抑郁、焦虑、躁狂和精神分裂症等等。
在此揭示的数据提示肾酶的过表达、肾酶的低表达、过度活性的肾酶及失活的肾酶与多种疾病、障碍或者病变相关，因此降低肾酶水平、增加肾酶水平、降低肾酶活性及增加肾酶活性的方法可潜在地获得益处，其中选择的方法依赖于治疗的特异障碍、病变和/疾病。因此，本发明揭示了影响肾酶的水平以治疗/减轻多种疾病、障碍或者病变的方法，其中肾酶的水平与治疗之前细胞中肾酶的水平或者与得自己知未患有与肾酶水平改变相关或由其介导的疾病、障碍或病变的哺乳动物的另外相同的细胞中肾酶的水平相比降低或者增加。
肾酶的表达、该多肽的水平或其活性是否增加或者降低，本领域技术人员基于本文教导意识到降低或者诱导肾酶的方法包括给予天然发生的或者非天然发生的肾酶、肾酶抑制剂、或者表达或者不表达肾酶的重组细胞。因此，本领域技术人员基于本文教导意识到本发明包括本领域已知影响哺乳动物中肾酶表达水平或者活性的可检测增加或降低的治疗方法。
本发明的组合物可用于将肾酶给予细胞、组织或者动物，或者用于促进肾酶在细胞、组织或者动物中的表达。所述组合物可用于治疗由肾酶表达改变而介导的疾病、障碍或病变，由此降低或者增加细胞、组织或者动物中肾酶表达或者该蛋白质水平对该动物是有益的。即在动物中的疾病、障碍或病变是由肾酶表达水平或者蛋白质水平改变介导的或者与之相关的情况中，所述组合物可用于调节肾酶的这种表达或者蛋白质水平。
本领域技术人员基于本文教导理解可以增加细胞中肾酶的水平或者活性。即本文揭示的证明肾酶表达与高血压相关的数据表明肾酶活性的过表达或者增加可以降低血压。这可用于治疗或者减轻与未患有疾病、障碍或病变所述的相同细胞、组织或者动物中肾酶的表达、水平或者活性相比，与肾酶的表达、水平或者活性降低相关或者由其介导的疾病、障碍或病变(例如高血压)，通过给予天然发生的或者非天然发生的肾酶进行。这种疾病、障碍或者病变包括但不限于ESRD、高血压、心血管疾病或者精神障碍。
本文揭示的数据表明肾酶可以调节体循环血压。因此，技术人员基于本文提供的教导意识到代谢儿茶酚胺的肾酶可用于治疗心血管疾病。因此，本发明包括一种增加儿茶酚胺代谢的方法，包括增加血液循环中肾酶的活性或者提高肾酶在细胞中的表达。例如，ESRD可以通过给予哺乳动物有效量的肾酶而治疗。这是因为本文揭示的数据表明肾酶与ESRD相关。即数据表明肾酶表达的缺乏与ESRD相关。进一步地，本文揭示的数据表明将重组肾酶注入大鼠中导致大鼠血压降低，提示肾酶可用于治疗ESRD诱导的高血压及其它心血管疾病。
在另一个实施方案中，本发明包括一种减轻由肾酶表达或活性改变介导的疾病、障碍或病变的方法，通过给予哺乳动物一种抑制肾酶表达和/或活性的抑制剂进行。就如同MAO抑制剂一样，肾酶抑制剂也可以用于治疗CNS疾病如心境障碍。因此，使用抑制肾酶的化合物、肽模拟物、小分子、核酶、反义核酸、抗体和内抗体(intrabody)降低肾酶的表达或者降低肾酶的活性可以增加脑中单胺的含量，可以减轻这些疾病的症状。因此，本领域技术人员理解通过本文所述多种方法可以实现的肾酶抑制，可用于治疗CNS疾病，特别是心境障碍。
CNS疾病包括但不限于痴呆、阿尔茨海默病、精神分裂症、精神病、抑郁、头痛和偏头痛。如本文所用，术语“抑郁”包括抑郁症，例如单情节性(single episodic)或者复发严重抑郁症和情绪恶劣性障碍，抑郁性神经症，神经症性抑郁症；忧郁型抑郁症包括厌食、体重减轻、失眠、早醒及精神运动性阻滞；非典型抑郁症(或者反应性抑郁症)包括食欲亢进，嗜睡，精神运动性兴奋或者易激惹，焦虑症和恐怖症；季节性情感障碍；或者双相性精神障碍或者躁狂型抑郁症，例如双相I型精神障碍，双相II型精神障碍和循环情感性精神障碍。
术语“抑郁”包含的其它心境障碍，包括早期或者晚期发作的有或无非典型特征的情绪恶劣性障碍；早期或者晚期发作的抑郁心境的阿尔茨海默病型痴呆；抑郁心境的血管性痴呆；酒精、苯异丙胺、可卡因、迷幻剂、吸入剂、阿片样物质、苯环己哌啶、镇静剂、催眠药、抗焦虑药及其它物质诱导的心境障碍；抑郁类型的精神分裂性精神障碍；及抑郁心境的适应失调。
本发明的组合物可用于治疗焦虑症。如本文所用，术语“焦虑症”包括焦虑症疾病，如有或无广场恐怖症的惊恐性障碍、无惊恐性障碍病史的广场恐怖症、特异性恐怖症，例如特异性动物恐怖症、社交恐怖症、强迫性障碍、应激障碍，包括外伤后应激障碍和急性应激障碍，及泛化性焦虑症。
“泛化性焦虑症”典型是一段时间(例如至少6个月)的大多数日子里具有过度焦虑或者烦恼症状。焦虑和烦恼难以控制，并且可伴随坐立不安、易于疲劳、难以集中注意力、易激惹、肌紧张、和睡眠紊乱。
“惊恐性障碍”是指反复出现的惊恐发作，随后至少一个月持续为下一次惊恐发作而担心。“惊恐发作”是不连续地突然发作的强烈恐惧、惧怕或者恐怖。在惊恐发作期间，个体可体验多种症状，包括心悸、出汗、颤抖、气短、胸痛、恶心和眩晕。惊恐性障碍可出现或不出现广场恐怖症。
“恐怖症”包括广场恐怖症、特异性恐怖症和社交恐怖症。“广场恐怖症”特征在于对于在惊恐发作的情况中难以逃走或局促不安或者不可获得帮助的场所或者情境的焦虑。广场恐怖症可以没有惊恐发作历史。“特异性恐怖症”特征在于通过暴露于特定的恐惧目标或者情境而引起的具有显著临床症状的焦虑症。特异性恐怖症包括如下亚型动物型，由动物或者昆虫暗示；自然环境型，由自然环境中的客体暗示，例如暴风雨、高度或者水；血液—注射—损伤型，由看见血液或者损伤或者看见或者接受注射或者其它侵入性医学方法所暗示；环境类型，由特定的环境如公众运输、隧道、桥梁、电梯、飞行、驾驶或者密闭空间暗示；及通过其它刺激暗示恐惧的其它类型。特异性恐怖症也可以称作单纯型恐怖症。“社交恐怖症”特征在于通过暴露于某些类型的社交或者表演环境而激发的临床显著焦虑症。社交恐怖症也可以称作社交焦虑障碍。
术语“焦虑症”涵盖的其它焦虑症包括由乙醇、苯异丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、迷幻剂、吸入剂、苯环己哌啶、镇静剂、催眠药、抗焦虑药及其它物质诱导的焦虑症，及具有焦虑症或者混合的焦虑症和抑郁症的适应失调。
焦虑症可以有或无其它障碍，如抑郁症混合焦虑症和抑郁性障碍。本发明的组合物因此可用于治疗伴随或不伴随抑郁症的焦虑症。
本发明进一步提供了一种减轻由肾酶表达改变介导的疾病、障碍或病变的方法，通过给予与相同但正常组织的肾酶表达水平相比肾酶表达水平增加而介导的疾病、障碍或病变的患者一种与编码肾酶的核酸互补的反义核酸而进行，所述相同但正常的组织即不呈现与治疗或减轻的疾病、障碍或病变相关的任何可检测的临床参数的组织。通过这种方法可降低肾酶表达，从而减轻由肾酶的异常表达介导的疾病、障碍或病变。
尽管例证了通过给予细胞反义核酸从而抑制肾酶在细胞中的表达而对肾酶进行抑制，但本领域技术人员意识到有许多抑制细胞中蛋白质表达和/或活性的方法。这种方法包括但不限于使用核酶抑制肾酶表达，及通过例如给予细胞抗体从而抑制细胞中该蛋白质活性，例如给予细胞编码所述抗体的核酸，由此所述抗体在细胞中表达，因此将该抗体输送至细胞溶胶中。应用这些“内抗体”抑制蛋白质的细胞内活性为本领域所熟知。见例如Verma et al.(1997，Nature 389239-242；Benhar & Pastan，1995，J.Biol.Chem.27023373-23380；Willuda et al.，1999，Cancer Res.595758-5767；及Worn et al.，2000，J.Biol.Chem.2752795-2803)。因此，本发明涵盖了使用这种方法抑制细胞中感兴趣蛋白质活性的任何方法，这些方法为本领域所已知或者在将来揭示。
在本发明的另一个实施方案中，患有与肾酶表达相关或者由其介导的疾病、障碍或者病变的个体可以通过用没有肾酶表达的细胞补充、增加和/或置换缺陷细胞进行治疗。所述细胞可以衍生自得自正常同系匹配供体细胞或者得自治疗个体的细胞。所述细胞可以经遗传修饰以抑制肾酶表达。或者，可以使用本领域熟知的重组方法将细胞修饰为增加肾酶表达。同样，本发明还包括使用得自未患有与肾酶表达改变相关的任何疾病或障碍的其它相同供体的正常细胞，该细胞可以给予需要其的哺乳动物。
另外，本发明包括离体技术，其中从哺乳动物获得细胞，并将其修饰为表达增加或降低水平的肾酶，然后再导入该哺乳动物中。另外，可以将与得自未患有与肾酶表达改变相关的任何病变的相同哺乳动物的相同细胞中表达的肾酶水平相比，表达正常水平肾酶的哺乳动物的细胞生长并扩展，及可以将有效数目的细胞再导入该哺乳动物中。这种方法包括涉及使用骨髓基质细胞的细胞和基因治疗技术，这种方法为本领域所熟知。因此，本领域技术人员意识到关于有或无可检测的肾酶表达的细胞的细胞治疗和基因治疗方法涵盖在本发明中，其中所述细胞是体内给予的。
除了用来自同系、免疫学匹配的供体的修复的细胞或者正常细胞置换缺陷细胞之外，本发明的方法也可用于促进所需蛋白质(当在动物中分泌时)表达，具有有益作用。即可以分离细胞、供给编码肾酶的基因并导入供体中或者导入同系匹配的受体中，其中外源肾酶的表达发挥治疗作用。
本领域技术人员基于本文提供的教导将理解本发明预期肾酶自细胞中分泌。即技术人员基于本文提供的教导意识到肾酶自细胞中分泌可以是一种可用的治疗方法，本发明包括肾酶自细胞的分泌。肾酶自细胞中的分泌可以根据本领域熟知的标准方法及未来揭示的方法实现。这种方法包括但不限于将编码分泌分子的信号肽的核酸与编码肾酶的分离的核酸的5’末端共价连接。可用于介导蛋白质自细胞中分泌的众多信号序列为本领域所熟知，本发明包括这些以及将来揭示的序列以驱动蛋白质自细胞中分泌。
本发明的这个方面涉及基因治疗，其中给予个体治疗量的肾酶。即根据本发明的一些方面，用本发明的编码肾酶的核酸、反义核酸或者敲除靶载体转染的重组细胞可用作细胞治疗剂，以治疗特征在于肾酶表达改变(包括肾酶表达缺乏)的疾病、障碍或病变。
特别地，将包含编码肾酶的异源基因的基因构建体导入细胞中。这些重组细胞用于纯化分离的肾酶，其给予动物。本领域技术人员基于本文提供的教导理解代替给予分离的肾酶多肽，通过给予哺乳动物其自身重组细胞而可以将肾酶给予需要其的哺乳动物。这对于受体个体将有益处，当蛋白质由重组细胞表达和分泌进受体系统中时获得益处。
根据本发明，将包含本发明的核苷酸序列的基因构建体导入细胞中。即将称作“重组细胞”的细胞遗传改变以导入编码肾酶的核酸或者抑制肾酶在重组细胞中表达和/或分泌的核酸(例如反义肾酶核酸、编码抗肾酶抗体的核酸等)，从而介导对给予重组细胞的受体的有益作用。根据本发明的一些方面，对得自相同治疗个体的细胞或者得自另一个体的细胞或者得自非人动物的细胞可以进行遗传改变，以置换缺陷的肾酶基因和/或导入其表达对于个体具有有益作用的肾酶基因，或者抑制肾酶表达，这对个体具有有益作用。
在本发明的一些方面中，患有疾病、障碍或者病变的个体可以通过提供含有包括编码肾酶的核酸的正常功能性拷贝的基因构建体的分离的重组细胞，通过补充、增加和/或置换缺陷或者缺乏的编码肾酶的核酸进行治疗。本发明的这个方面涉及基因治疗，其中为个体提供其存在和/或功能缺乏的编码肾酶的核酸。由细胞提供的编码肾酶的分离的核酸补偿了个体缺陷的肾酶表达，因为当核酸在个体中表达时，产生蛋白质，其可以减轻或者治疗个体的疾病、障碍或病变。这种核酸优选编码自重组细胞中分泌的肾酶多肽。
在编码肾酶的基因构建体转染进细胞中的所有情况中，核酸与实现其在重组细胞中表达需要的合适启动子/调节序列可操纵地连接。这种启动子/调节序列包括但不限于组成型启动子和诱导型启动子和/或组织特异性和分化特异性启动子，这些启动子在本文别处论述。组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子和Rous肉瘤病毒启动子。另外，也可以使用管家启动子如调节管家基因表达的那些启动子。其它启动子包括在中枢神经系统细胞中优先表达的那些启动子，例如但不限于编码胶质细胞原纤维酸性蛋白的基因的启动子。另外，可以选择启动子/调节元件，由此基因表达是可诱导的。例如，可以使用四环素可诱导启动子(Freundlich et al.，1997，Meth.Enzymol.283159-173)。
所述基因构建体优选以表达载体形式提供，其包括与必需的启动子/调节序列可操纵地连接的本发明的哺乳动物肾酶的编码序列，由此当所述载体转染进细胞中时，所述编码序列由细胞表达。所述编码序列与该序列在细胞中表达必需的启动子/调节元件可操纵地连接。编码蛋白质的核苷酸序列可以是cDNA、基因组DNA、合成的DNA或者其杂种或者RNA分子如mRNA。包括与启动子/调节元件可操纵地连接的、编码肾酶的核苷酸序列的基因构建体可以作为功能性附加型分子保持存在于细胞中，或者其可以整合进细胞的染色体DNA中。遗传物质可以导入细胞中，在此其以质粒形式作为独立的遗传物质存在。或者，可以整合进宿主细胞染色体中的线性DNA可以导入细胞中。当将DNA导入细胞中时，可以加入促进DNA整合进染色体中的试剂。可用于促进整合的DNA序列也可包含在DNA分子中。或者，可以将RNA导入细胞中。
为了使表达载体中的遗传物质表达，启动子/调节元件必须与编码蛋白质的核苷酸序列可操纵地连接。为了最大化产生蛋白质，可选择非常适于基因在所需细胞中表达的启动子/调节序列。另外，选择在细胞最有效转录的密码子。本领域技术人员可以产生在所需细胞中起功能的重组遗传物质作为表达载体。
本发明还涉及可以选择启动子/调节元件以促进蛋白质的组织特异性表达。因此，例如可以提供特异性启动子/调节序列，由此异源基因仅在植入重组细胞的组织中表达。另外，技术人员基于本文提供的教导意识到肾酶启动子可以与感兴趣的核酸可操纵地连接，从而指导核酸在组织或器官的一定位置表达。相似地，肾酶启动子可以驱动感兴趣核酸的表达，这种表达在中高度儿茶酚胺循环成问题之处是有益的。
本领域技术人员基于本文提供的教导理解靶向其中肾酶表达或者表达缺乏的优选组织包括但不限于皮肤溃疡、骨折等。另外，可以选择启动子/调节元件，由此基因表达是可诱导的，例如可以使用四环素可诱导的启动子(Freundlich et al.，1997，Meth.Enzymol.283159-173)。
不希望受任何特定理论的限制，编码肾酶的核酸优选包括如本文别处所述的推定的信号序列(例如在人肾酶N末端的氨基酸)，其可以指导由重组细胞中分离的核酸编码的肾酶的转运和分泌。所述信号序列基于成熟肾酶蛋白质自细胞中的分泌而很可能被加工和除去。或者，不希望受任何特定理论的限制，推定的信号序列可以不被切割，但是可以是跨膜结构域。
除了为细胞提供重组遗传物质之外，所述重组遗传物质校正细胞中的遗传缺陷、编码未以足够量和/功能条件存在的蛋白质，由此该遗传物质校正个体中的遗传缺陷，和/或编码在与之相关的特定疾病、障碍或病变的治疗和预防中有益处的蛋白质，及抑制肾酶在细胞中的表达(例如敲除靶向载体，反义核酸等等)，遗传物质也可以导入本发明使用的重组细胞中以提供选择性终结这种应该终结的细胞的方式。这种靶向重组细胞使其破坏的方式可以导入重组细胞中。
根据本发明，可以为重组细胞提供遗传物质，使得其对破坏特异易感。例如，可以为重组细胞提供一种编码可以特异性靶向胞毒剂的受体的基因。可用于诱导选择性细胞死亡的可表达形式的基因可以导入重组细胞中。在这种系统中，表达由该基因编码的蛋白质的细胞在特定条件下或者在特定制剂存在或不存在的条件下对于靶向杀伤易感。例如，可表达形式的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes tk)基因可以导入重组细胞中并用于诱导选择性细胞死亡。当包括herpes tk基因的导入的遗传物质被导入个体中时，产生herpes tk。如果希望或者必须杀死植入的重组细胞，则可以给予个体药物gangcyclovir，导致产生herpes tk的任何细胞的选择性杀死。因此，可以提供一个系统，使得可以选择性破坏植入的重组细胞。
本领域技术人员基于本文提供的教导理解本发明涵盖了重组细胞的产生，该重组细胞是为哺乳动物提供肾酶或者抑制其中肾酶表达。即该细胞可用于给予动物肾酶或者输送分子(例如敲除靶向载体，反义核酸，核酶，与肾酶特异性结合的抗体等等)。
给予动物肾酶可用作模型系统以研究肾酶的作用机制，或者产生用于揭示与肾酶表达相关的疾病、障碍或者病变的诊断和/或治疗方法的模型系统。
进一步地，通过给予表达和分泌肾酶的重组细胞介导的将肾酶输送至动物也可以用于治疗或者减轻其中肾酶水平增加介导治疗作用的疾病、障碍或病变。更特别地，通过给予动物表达编码肾酶的核酸的重组细胞而给予肾酶可用于治疗ESRD、高血压、心血管疾病等。
或者，给予包含核酸(其表达抑制或者降低肾酶在细胞中表达、活性和/或分泌)的重组细胞可用作揭示用于诊断和/或治疗与肾酶表达、活性和/或分泌相关或者由其介导的疾病、障碍或者病变的模型。本发明包括所述重组细胞可产生抑制肾酶表达的分子，从而将这种分子提供给动物。或者，不希望受任何特定理论的限制，所述重组细胞自身除了不能表达肾酶之外，也是功能细胞，可以进行其它相同但非重组细胞的功能，未进行肾酶信号化途径。
得自动物、可商购或者揭示的确定细胞系、或者在体外培养的原代细胞的细胞均可以使用本领域技术人员熟知的技术转染。因此，本发明不限于从供体动物或者患者自身获得细胞。更确切地，本发明包括使用可以使用本发明的核酸工程化的任何细胞，由此所述重组细胞表达肾酶(细胞在工程化之前不表达肾酶，或者在将所述核酸导入细胞之前细胞以不同水平产生肾酶的情况中)，或者所述重组细胞不表达肾酶或者以较低水平表达肾酶(细胞在将所述核酸导入细胞中之前表达肾酶或者在不同水平表达肾酶的情况中)。
可以使用用于将基因构建体导入细胞中的标准方法将核酸导入细胞中，其表达由该基因编码的蛋白质或者表达抑制肾酶表达的分子。在一些实施方案中，通过磷酸钙沉淀转染、DEAE葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、脂质体介导的转移、化学介导的转移、配体介导的转移或者重组病毒载体转移等方法转染细胞。
在一些实施方案中，重组腺病毒载体用于将具有所需序列的DNA导入细胞中。在一些实施方案中，重组逆转录病毒载体用于将具有所需序列的DNA导入细胞中。在一些实施方案中，应用标准磷酸钙、DEAE葡聚糖或者脂质体载体介导的转染技术将所需DNA掺入分裂的细胞中。标准抗生素抗性选择技术可用于鉴别和选择转染的细胞。在一些实施方案中，DNA通过显微注射直接导入细胞中。相似地，熟知的电穿孔或者粒子轰击技术可用于将外源DNA导入细胞中。第二种基因通常与编码肾酶的核酸或者其敲除靶向载体或者反义分子共转染和/或共价连接。所述第二种基因通常是一种可选择的抗生素抗性基因。选择转染的重组细胞可以通过将细胞在杀死不具有所述可选择基因的细胞的抗生素中生长而进行。在所述两种基因是不连接的和共转染的大多数情况中，在抗生素处理条件下存活的细胞含有并表达这两种基因。
本文揭示了评定肾酶水平的方法(例如在Western印迹或者其它基于免疫的分析如ELISA中使用抗肾酶抗体)和/或评定细胞或组织中肾酶表达水平的方法(例如使用Northern印迹分析、RT-PCR分析、原位杂交等)，这些方法为本领域技术人员所熟知。这种分析可用于确定给予动物的肾酶的“有效量”(无论使用分离的核酸、抗体、反义核酸、核酶、重组细胞等)，以将肾酶降低或者增加至所需的水平。
B.鉴别可用化合物的方法本发明进一步包括一种鉴别影响肾酶在细胞中表达和/或活性的化合物的方法。所述方法包括将细胞与测试化合物接触，将肾酶在如此接触的细胞中的表达和/或活性水平与肾酶在其它相同但未接触所述化合物的细胞中的表达和/或活性水平相对比。如果与在其它相同但未接触所述测试化合物的细胞中的肾酶的表达和/或活性水平相比，肾酶的表达和/或活性水平在与测试化合物接触的细胞中较高或较低，则表明该测试化合物影响肾酶在细胞中的表达和/或活性。
相似地，本发明包括一种鉴别降低肾酶在细胞中表达和/或活性的方法。所述方法包括将细胞与测试化合物接触，并将肾酶在接触所述化合物的细胞中的表达和/或活性水平与在其它相同但未接触所述化合物的细胞中的表达和/或活性水平相对比。如果与在未接触所述化合物的细胞中的肾酶的表达和/或水平相比，在与所述化合物接触的细胞中水平较低，则表明该测试化合物降低肾酶在细胞中的表达和/或活性。
技术人员基于本文提供的教导意识到肾酶在细胞中的表达和/或活性水平可以通过确定编码肾酶的mRNA的表达和/或活性水平而测定。或者，编码肾酶的mRNA的表达和/或活性水平可以通过使用免疫学方法确定，例如使用本发明的抗肾酶抗体通过Western印迹分析评定自这种mRNA的肾酶产生。进一步地，可以使用基于核酸的检测方法，如Northern印迹和PCR分析等。另外，细胞中肾酶活性水平也可以通过确定可以被肾酶活性影响的多个参数的水平而评定，所述参数例如是在肾、心脏、骨骼肌和小肠等中肾酶的表达和/或活性水平。或者，肾酶活性水平可以在胺氧化酶分析中评定。因此，本领域技术人员基于本文提供的教导意识到有许多方法可用于评定细胞中肾酶的表达和/或活性水平，这些方法包括本文所揭示的那些方法、本领域熟知的方法及在未来将揭示的其它方法。
进一步地，本领域技术人员基于本文提供的教导意识到如在下文的实施例中所揭示，缺乏内源肾酶表达和/或活性的细胞可以用包含编码肾酶的分离的核酸的载体转染，从而影响细胞中肾酶的表达和/或活性。然后将转染的细胞与测试化合物接触，这样可以确定该化合物是否影响肾酶的表达和/或活性。因此，本领域技术人员综合本发明的教导，可以通过使用表达肾酶的载体选择性转染缺乏可检测水平肾酶的细胞，鉴别选择性影响肾酶表达和/或活性的化合物。
本领域技术人员基于本文教导意识到在将编码肾酶的分离的核酸给予缺乏内源可检测水平肾酶表达和/或活性的细胞，由此所述细胞产生可检测的肾酶的情况中，所述分离的核酸可包含与之共价连接的编码例如标记多肽的其它核酸。这样通过检测标记多肽的表达和/或活性可以检测肾酶的表达和/或活性。因此，本发明包括通过检测与肾酶共表达的另一分子的表达和/或活性而检测肾酶表达和/或活性的方法。
本发明包括一种鉴别与肾酶特异性结合的蛋白质的方法。肾酶与至少一种其它蛋白质结合，从而这种与其它蛋白质的相互作用可以影响肾酶的生物学功能。因此，本发明包括本领域熟知的或者在未来将揭示的鉴别特异性与肾酶结合和/或关联的蛋白质的方法。这种方法包括但不限于蛋白质结合分析，其中将靶蛋白质，即肾酶，固定在合适的支持物上，在使得肾酶与肾酶关联蛋白质结合的条件下保温。可以使用标准方法将肾酶固定在支持物上，所述方法例如但不限于产生包含如下标记的肾酶谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记、麦芽糖结合蛋白(MBP)标记、或者His6-标记，然后将融合蛋白分别与谷胱甘肽-琼脂糖珠、麦芽糖柱或者镍螯合树脂(例如His-Bind树脂，Novagen，Madison，WI)结合。洗涤该固体支持物以除去与其非特异性结合的蛋白质，然后从基质中解离任何肾酶关联蛋白质，从而鉴别肾酶关联蛋白质。
另外，与肾酶特异性结合的蛋白质，例如受体、配体和/或其它肾酶关联蛋白质，可以使用例如酵母双杂交分析鉴别。酵母双杂交分析方法为本领域所熟知，可以使用商购试剂盒根据标准方法进行(例如MATCHMAKERTM系统，Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA及其它这种试剂盒)。因此，一旦综合本文提供的教导，例如“诱饵”蛋白质，肾酶的全部氨基酸和核酸序列，本领域技术人员可易于鉴别与肾酶特异性结合的蛋白质，例如但不限于肾酶受体蛋白质、肾酶配体等等。
本领域技术人员基于本文提供的教导理解本发明包括使用本文别处论述的方法鉴别的任何分子。即与肾酶关联的分子，例如但不限于肾酶受体蛋白、肾酶配体蛋白或者这两者，可用于揭示由肾酶与肾酶关联蛋白的相互作用介导的疾病、障碍或者病变的治疗和诊断方法，所述疾病例如是ESRD、高血压、心血管疾病等等。即本领域技术人员意识到正如在本文别处讨论特异性结合肾酶的抗体所充分阐述的，肾酶关联蛋白质可用于揭示抑制细胞中肾酶活性的治疗方法，通过抑制必需的肾酶受体/配体相互作用及肾酶活性需要的其它肾酶结合相互作用而进行。
通过上述方法鉴别的肾酶关联蛋白质可直接用于抑制肾酶相互作用，通过将细胞与肾酶关联蛋白或其一部分接触而进行，或者它们可用于揭示可抑制与肾酶的肾酶关联相互作用、从而抑制肾酶功能和活性的抗体和/或肽模拟物。因此，本发明可用并包括肾酶关联蛋白质，包括肾酶受体/配体蛋白。
C.诊断和确定治疗的方法本发明包括诊断某些疾病、障碍或者病变的方法，所述疾病例如但不限于ESRD、慢性肾病、高血压、心血管疾病如无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭和动脉粥样硬化。肾酶也可以用作急性肾功能衰竭(即急性肾小管坏死或者ATN)等的诊断标记。
所述方法包括从哺乳动物获得生物学样品，并将样品中肾酶的(表达、量、活性)水平与取自未患有肾病的人的样品中肾酶的水平相对比。与得自未患有ESRD、ANT或高血压的人的样品中肾酶水平相对比，患者样品中肾酶水平较低表明该患者患有ESRD、ANT或高血压。
本发明包括一种评定哺乳动物中ESRD治疗效力的方法。所述方法包括评定治疗ESRD之前、期间和之后一定时间内肾酶的表达、量和/或活性水平，因为ESRD与肾酶表达较低相关。这是因为如先前别处和本文揭示的数据所表明，肾酶的表达、量和/或活性与儿茶酚胺循环相关或使其增高，这是某些疾病的特征(例如ESRD和高血压)。因此，基于肾酶的表达/量/活性评定治疗效力表明如果肾酶的表达、量或活性水平增加则该治疗方法是成功的。
不用进一步描述，本领域技术人员根据前文所述和如下例证的实施例，可以产生和利用本发明的化合物并实践权利要求的方法。如下实施例只是特别指出本发明的优选实施方案，无限制本发明之意。
实施例综述这个实施例中的实验可概括如下。首先，鉴别肾酶。为了分离这种新的肾分泌的蛋白质，利用现有的公共数据库，特别是MammalianGene Collection Project(MGC)。基于如下标准鉴别了共114个编码新的分泌蛋白的候选基因(i)编码新蛋白质的候选基因，与数据库中现有蛋白质具有低于20％相似性/相同性；(ii)预测推定的蛋白质具有信号肽序列(使用两种不同的预测信号肽序列的方法)；(iii)推定的蛋白质不含有跨膜结构域(因为一些膜蛋白质如I型膜蛋白也具有信号肽序列)。
这种策略提供了一些独特的优势分析仅限于新的基因；避开了麻烦的克隆程序，削减了对于感兴趣基因的逐月或逐年的搜索；可以立即确认组织中的基因表达及生物化学和功能研究。使用这种算法，发现在肾脏中高度表达的一个克隆，MGC 12474(见下文)。因此，选择这个克隆进行进一步研究。
发现MGC12474编码具有单胺氧化酶(MAO)活性的蛋白质。MAO是一种含有黄素-腺苷-二核苷酸(FAD)的酶，其将生物单胺转变为相应的醛。这个酶促反应(Massey et al.，2000)通过氧化裂解底物的α-CH键而催化单胺氧化形成亚胺产物，伴随黄素辅因子的还原。然后将该亚胺产物水解为相应的醛和氨。还原的黄素辅酶与氧反应形成过氧化氢和氧化形式的黄素，完成催化循环。
使用在人和小鼠中相同的第226-238位氨基酸衍生的合成肽产生兔抗肾酶多克隆抗体。Western印迹研究示出这种抗体识别与抗HA抗体同样的37Kd肾酶-HA融合蛋白。
另外，发现肾酶分泌进人体血液中(见下文详述)，进一步表明肾酶是一种分泌蛋白的性质。
为了便于蛋白质产物的检测，将在肾酶C末端的HA标记工程化。用抗HA和抗肾酶抗体进行Western印迹揭示了在肾衍生的HEK293细胞的培养基中37Kd的蛋白质，表明肾酶具有一个功能性N末端信号序列，并且分泌进这些研究使用的细胞培养模型中。
此外，使用肾酶特异性多克隆抗体通过western印迹检测人体血液。图3b表明肾酶易于在血液中检测到。为了确定肾脏是否是循环肾酶的主要来源，我们测试了在严重肾脏疾病和肾功能降低的患者中肾酶血液水平是否降低。如图3b所示，在接受血液透析的ESRD患者的血液中实际上无可检测到的肾酶。
进行的实验在下文更详细地描述。
实施例1编码肾酶的基因的鉴别和分析材料和方法MGC数据库的生物信息学分析这个实验所用的所有12,563个独特的人全部-ORF cDNA得自Mammalian Gene Collection Project MGC，将其进行三轮连续筛选。最初的MGC分析在2001年12月24日进行。首先，选择没有GenbankDefinition的基因进行更详细的分析。其次，将在第一轮选择的基因编码的预测氨基酸序列使用BLAST进行分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，选择编码与已知蛋白质低于20％相同性的蛋白质的那些基因。第三，推定的信号序列的存在使用SignalP V2.0(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)和SOSUI signal Beta_Version(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp)评定。然后将通过这两种方法预测的具有信号肽序列的新蛋白质使用Pfam进行结构域搜索。编码感兴趣克隆的cDNA克隆购自ATCC，对两个链均进行测序(Yale University，Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory)并使用BLAST进行分析。
MGCMGC计划是NIH的一种新成就，可以产生全长cDNA资源以便于对人基因进行功能性研究。这个计划提供了全世界研究团体可公开获取的资源。MGC计划需要产生文库、测序和数据库及资料档案库，以及针对获得全部人和其它哺乳动物全长(开放读框)序列和表达基因的克隆的文库构建、测序和分析技术的支持(Rozanski et al.，1999；Tendera et al.，2001)。最重要地，MGC确立了强大的信息学工具以保证选择的克隆潜在地编码完整序列。MGC产生12,563个独特的人全部-ORF cDNA，其中大约20％是新的基因(新基因定义是与已知蛋白质低于20％相似性/相同性)。
DNA序列编码肾酶的MGC12474 cDNA克隆购自ATCC，并且对其两个链进行测序(Yale University Keck Foundation Biotechnology ResourceLaboratory)，使用国立生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的BLASTN分析与公开序列的DNA序列相同性/相似性。
Northern印迹分析从CLONTECH获得人多个组织的Northern印迹，将其与用[α-32P]dCTP标记的肾酶cDNA杂交。杂交在含有标记的探针(～2×106cpm/ml)的Rapid-hyb缓冲液(Amersham Pharmacia Biotech)中在62-68℃进行1-2小时或过夜。将印迹在严格条件下洗涤并曝光于KodakXAR胶片。甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA用作内对照探针以荷载相等RNA。
统计学分析两组之间的比较使用标准的成对Student′s t-检验进行。标准非成对的Student′s t-检验在相同时间用于组比较。所有数据均为平均值±SE，p值＜0.05认为具有统计学显著性差异。
结果为了分离具有重要生物学作用的新蛋白质，对现有公共数据库、特别是Mammalian Gene Collection Project(MGC)进行筛选(Strausberget al.，1999)，使用设计的算法以选择可能由肾分泌的新蛋白质。MGC计划是NIH的一个新成就，在人和小鼠中产生全长cDNA资源以便于对基因产物进行功能性研究(Strausberg et al.，1999；http://mgc.nci，nih.gov)。为了选择编码分泌的蛋白质的候选基因，对MGC公布的所有克隆均进行研究。MGC产生12,563个独特的人全部-ORF cDNA，其中大约20％是新基因(新基因定义为与已知蛋白质低于20％相似性/相同性)。MGC数据分析在2003年8月1日完成，基于如下标准鉴别了共114个编码新的分泌蛋白的候选基因(i)候选基因编码新的蛋白质，与数据库中现有蛋白质低于20％相似性/相同性，(ii)预测推定的蛋白质具有信号肽序列(使用预测信号肽序列的两种不同方法)；(iii)推定的蛋白质不含有跨膜结构域(因为一些膜蛋白如I型膜蛋白也具有信号肽序列)。每个候选基因的组织表达均通过Northern印迹分析进行评定，揭示这些克隆之一在人肾脏中的强力和优先表达(MGC12474，GenBank登记号BC005364)(图1A)。MGC12474具有1,474个核苷酸，其最长的开放读框(第22-1047位核苷酸)编码具有342个氨基酸的一种新蛋白质，计算的分子量为37.8kDa(图2A)。称作肾酶的人基因具有跨越大约311,000bp的7个外显子，位于10号染色体的q23.33上(图2B)。使用MotifScan进行的分析揭示了在N末端的一个信号肽、FAD结合位点(第4-35位氨基酸)和在第11-339位氨基酸的胺氧化酶结构域(图1B)。肾酶与单胺氧化酶A(MAO-A)具有13.2％氨基酸相同性(图1C)，与MAO-B具有弱的相似性(图2C)。
实施例2肾酶由肾分泌基因表达盒的构建(TAP片段)我们使用基于PCR的方案，在两次连续PCR反应之后，将5′-CMV启动子和3′-SV40pA分别加入每个候选克隆的5′-和3′-末端。详细的方法学由Liang等描述。简而言之，这个方法包括两个连续的PCR步骤。第一步使用含有通用TAP末端和特异于靶基因的序列的引物(0.4μg)进行。5′通用末端序列与含有CMV立即早期基因启动子的DNA片段互补，并且用于第二个PCR步骤中以将CMV启动子附着于扩增的基因上。3′通用末端与含有SV40早期基因转录终止子的DNA片段重叠，也用于第二个PCR步骤中以将转录终止子序列附着于扩增的基因上。为了产生含有肾酶的TAP片段，用于第一步PCR的5′-和3′-引物如下5′-oligo＝5′-TGCAGGCACCGTCGTCGACTTAACAatgcgaccccagggccccgccg(SEQID NO6，大写字母是用作锚以进行第二步PCR的5′-TAP通用序列，小写字母是在ATG起始位点起始的克隆2特异性序列)；3′-oligo＝5′CATCAATGTATCTTATCATGTCTGATCAACCAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTttttggtagttcttcaataag(SEQ ID NO7，前25个碱基是3′-TAP通用序列，用作锚以进行第二步PCR，下划线的序列编码HA后接终止密码子TGA，小写字母是从减去终止密码子的3’末端起始的克隆肾酶特异性序列)。用于进行第二步PCR的5′-和3′-引物由厂商提供(Gene Therapy Systems，Inc.San Diego.CA)。
基因输送和表达使用GenePORTER(Gene Therapy Systems，Inc.San Diego.CA)根据厂商推荐的程序进行体外转染。我们始终如一地获得40-60％转染效率，使用绿色荧光蛋白TAP片段作为对照评定。
体外翻译将肾酶cDNA克隆进在插入体5’末端之前含有T7的pDNR-LIB中。对肾酶mRNA进行转录，随后使用single tube protein系统3(Novagen，CA)进行翻译。荧光素酶T7 cDNA用作阳性对照。在补加50μCi[35S]甲硫氨酸(Amersham Pharmacia Biotech，NJ)的50μl反应混合物中使用1μg质粒DNA根据厂商指导进行体外转录-翻译。10μl产物通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后进行放射自显影和Western印迹。
基因输送和表达体外转染使用GenePORTER(Gene Therapy Systems，Inc.)根据厂商推荐的程序进行。使用绿色荧光蛋白TAP片段作为对照，我们始终如一地获得40-60％转染效率。为了测试肾酶是否是一种分泌蛋白，应用基于PCR的方案产生转录活性PCR(TAP)片段，将其直接用于体内表达实验中(Liang et al.，2002)。
肾酶抗体的产生使用重组GST-肾酶融合蛋白作为抗原，兔抗肾酶多克隆抗体由Proteintech Group，Chicago产生。10周后，将兔用GST-肾酶融合蛋白加强。在二次注射抗原后6-8周，从兔中引流血液，并将抗肾酶抗体亲和纯化。
Western印迹分析将HEK 239细胞在补加了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基中生长。细胞在6孔平板中生长至60-80％铺满，然后用含有肾酶-HA融合蛋白的TAP片段转染，使用Geneporter根据厂商指导进行。转染后48-72小时，将来自细胞裂解产物的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，移至硝化纤维素膜上，用抗HA单克隆抗体(Roche Chemicals)免疫印迹。
使用与辣根过氧化物酶(Pierce)缀合的二级抗体检测免疫复合物，并用SuperSignal West Pico Luminol/增强剂溶液(Pierce)观察。为了检测由候选基因编码的蛋白质的分泌性质，将培养基与细胞裂解产物平行进行Western印迹分析。为了检测人血浆肾酶，使用肾酶特异性抗体对10μl血浆进行Western印迹分析。
原位杂交如前所述进行原位杂交。简而言之，将来自MGC克隆#12474的426-bp DNA片段通过限制酶HindIII和PstI消化进行分离。然后将其亚克隆进pBluescriptII KS(+)载体中，在体外转录成DIG标记的RNA探针，用DIG标记试剂盒(Roche Biochemicals)标记。使用反义链检测肾酶，有义链用作对照。这些探针用于与在石蜡中包埋的心和肾组织的切片杂交。成人心和肾组织得自由家族成员同意和大学临床研究伦理协会认可的尸检。将组织用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛固定过夜。尸检耽搁为7小时。将组织通过梯度乙醇脱水，用二甲苯澄清，包埋于石蜡中，制备厚度为5μm的切片。
在脱蜡和水合后，将切片用蛋白酶K(20μg/ml)在37℃消化10分钟。然后用在PBS中的4％多聚甲醛在37℃再固定10分钟。在50℃在含有4×SSC、10％硫酸葡聚糖、1×Denhardt溶液、5mM EDTA、0.1％CHAPS、50％去离子甲酰胺、200μg/ml鲑精DNA和200ng/mlDIG-标记的探针的杂交缓冲液中进行杂交。将玻片在2×SSC中洗涤4次，每次15分钟，然后在50℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤两次，每次15分钟。使用与碱性磷酸酶缀合的抗DIG抗体进行比色检测，随后与NBT/BCIP生色底物保温，使用digoxygenin-核酸检测试剂盒(Roche，Germany)进行。对于人肾酶而言，在NBT/BCIP生色底物溶液中需要约5分钟产生颜色。
结果为了确定肾酶mRNA的组织分布，对人体组织相同进行Northern印迹。图1A描述的结果示出肾酶mRNA在肾中高度表达，在其它组织中水平较低。进行原位杂交研究以确定肾酶mRNA在不同人体组织中的空间分布(图3)。在肾小球、近端小管(图3A，左侧)和心肌细胞(图3B，左侧)中检测到特异信号。这种分布情况通过免疫细胞化学实验证实，如通过检测肾小球、近端小管(图3C，左侧)和心肌细胞(图3D，左侧)中肾酶蛋白而证实。这些结果表明高水平肾酶mRNA表达是组织特异性的，提示其也许具有特异于肾、骨骼肌、心脏和肝脏细胞的功能。
为了测试候选基因是否编码分泌的蛋白质，应用基于PCR的方案产生转录活性的PCR(TAP)片段，将其直接用于体内表达实验中(6)。为了便于蛋白质产物的检测，对在肾酶C末端的HA标记进行工程化(避开N末端是为了保持信号肽的完整性)。如图4a所示，将5′-CMV启动子和3′-SV40pA与肾酶-HA融合，将TAP片段转染进HEK293细胞中。使用抗HA抗体进行的Western印迹揭示了在培养基中一种预期为37Kd的表达的蛋白质产物(图4b)，这与推定的N末端信号肽序列的存在一致。
与膜结合的或者限于胞内区室的MAO-A、MAO-B和PAO不同，肾酶分泌进入血液中，在血液中可以通过Western印迹检测到。胺氧化酶活性已经在人血浆中测定，确信其是由血管粘着蛋白1(VAP-1)介导的，血管粘着蛋白1是由平滑肌、脂肪细胞和内皮细胞分泌的含铜氨基脲(semicarbizide)敏感的胺氧化酶(Salmi et al.，2001)。VAP-1的底物特异性和抑制剂谱与肾酶非常不同。其代谢苄胺和甲胺，并且由氨基脲和羟胺抑制。因此，肾酶是唯一已知分泌进入血液循环中并且代谢循环儿茶酚胺的胺氧化酶。
肾酶表达看起来限于肾、心脏、骨骼肌和小肠。肾呈现最高表达水平，并且看起来与大量循环肾酶相关。肾酶水平确实在进行透析的晚期肾病(ESRD)患者中显著降低。这不能排除与严重肾功能衰竭相关的代谢异常可以降低心脏和骨骼肌分泌肾酶的可能性。虽然如此，但很可能肾是循环肾酶集合的重要提供者。
令人感兴趣地，最近的研究表明血浆多巴胺和去甲肾上腺素水平和交感紧张在ESRD患者中持续增加(Joles et al.，2004；Zoccali et al.，2002；Hausberg et al.，2002)。最近的研究也发现突然的情绪压力可增加交感刺激，导致心肌震颤(Wittstein et al.，(2005)Neurohumoralfeatures of myocardial stunning due to sudden emotional stress，NewEngland Journal of Medicine.352，539-548)。升高的交感紧张可引起心血管并发症的发生，如高血压、左心室肥大和机能障碍。这些扰乱很可能导致在ESRD患者中观察到的高死亡率。因此，血液中低水平肾酶可能导致在ESRD患者中观察到的交感紧张升高，给予肾酶可降低心血管并发症的发生并改善生存。
实施例3肾酶在体外降解儿茶酚胺并且在体内调节心脏功能和体循环血压体外转录/翻译将MGC12474克隆克隆进在插入体5’末端之前含有T7的pDNR-LIB中。将肾酶mRNA进行转录，随后使用single tube protein系统3(Novagen，Cat#70192)翻译。荧光素酶T7 cDNA用作阳性对照。体外转录-翻译使用1μg质粒DNA在补加了50μCi的[35S]甲硫氨酸(Amersham Pharmacia Biotech)的50μl反应混合物中根据厂商指导进行。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离10μl产物，随后进行放射自显影和Western印迹。
GST-肾酶重组蛋白的产生将肾酶编码区(nt 24-1052)用有义引物5′-TTTT GGA TCC ATGGCG CAG GTG CTG ATC GTG(SEQ ID NO8)和反义引物3′-TTTTGAA TTC CTA AAT ATA ATT CTT TAA AGC(SEQ ID NO9)扩增。在用Bam HI和Eco RI消化后，将PCR片段克隆进pGEX-4T(Promega)中，使之与N末端GST标记(26kDa)同框。在通过DNA测序核实正确的克隆之后，将重组GST-肾酶质粒转化进大肠杆菌BL21中以进行重组融合生产。转化后，将6L细菌培养物在37℃在220rpm生长16小时，在最后的3.5小时中加入IPTG(0.5mM)。在IPTG诱导时还加入10μM的FAD。肾酶的存在通过用40μg的总细菌裂解物蛋白质进行Western印迹而证实。
肾酶蛋白可以直接从细菌裂解物中纯化，使用GSTrap柱根据一步方法进行。结合缓冲液含有PBS pH7.0(140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4，pH7.0。洗脱缓冲液50mMTrisTM-HCl和10mM还原的谷胱甘肽，pH8.0。为了进行样品制备，将10g大肠杆菌样品离心并重悬于在冰上的结合缓冲液中。对样品超声以释放GST-肾酶融合蛋白。柱纯化程序如下1)用5柱体积的结合缓冲液平衡柱；2)以0.2ml/min的流速加入样品；3)用5-10柱体积的结合缓冲液洗涤或者直至流出物中无物质；4)用5-10柱体积的洗脱缓冲液洗脱。
影响GST融合蛋白或者其它谷胱甘肽结合蛋白与GSTrap结合的最重要的参数之一是流速。由于GST与谷胱甘肽之间的结合动力学相对较低，因此重要的是在样品加入期间保持低流速以使得结合能力达到最大。用于洗脱的体积和时间对于不同批次的蛋白质可以不同。也许需要使用较高浓度的谷胱甘肽进行额外的洗脱。对于GST融合蛋白应监测在柱中的流经液、洗涤液和洗脱的物质，使用SDS-PAGE组合Western印迹(如果需要)进行监测。
GST-肾酶变性尿素使得肾酶蛋白变性是经深入研究和争论的一个主题。肾酶变性的研究如下进行1.制备两种蛋白质样品，将其在含有50mM Tris-HCl(pH8)的50μl样品缓冲液中进行比较，蛋白质终浓度为大约1mg/ml。
2.将50μl样品(来自步骤1)加入18mg固体尿素中进行蛋白质变性，尿素终浓度为6M。
3.加入5μl新鲜制备的100mM DTT(于高级别H2O中制备)使蛋白质还原，涡旋混合。将溶液在室温保温1小时。
GST-肾酶重折叠变性肾酶有效重折叠。产生和纯化为均质的肾酶用8M尿素在中性pH变性，并使用多种缓冲液快速稀释。用中性pH缓冲液的快速稀释产生低的蛋白质恢复。在重折叠溶液中蛋白质浓度的降低不改良蛋白质的恢复。用碱性缓冲液快速稀释也产生低的蛋白质恢复。然而，用弱酸性缓冲液稀释示出具有部分酶活性的定量蛋白质恢复，表明恢复的蛋白质仍滞留在部分重折叠的状态。因此，我们进一步研究了在低温(4℃)在酸性缓冲液中形成的部分重折叠肾酶的有效重折叠程序。肾酶的酶活性在pH4保持恒定。在相同的pH滴定但保温时间少于12小时产生较低的酶活性。在室温进行的重折叠实验产生聚集，活性几乎为在4℃的一半。我们推断尿素变性的肾酶在酸性pH下在低温进行快速稀释产生特异性构象，其然后可通过滴定为生理pH而被转变为天然状态。这个方法如下进行1.纯化肾酶蛋白质作为内含体并溶解于中性缓冲的8M尿素中。根据蛋白质的需要用DTT补充该缓冲液，2.将蛋白质浓度调节为0.1mg/ml，3.依次对透析缓冲液透析1000μl每种蛋白质，4.将1000μl蛋白质溶液缓慢加入每个透析管中，同时轻轻混合溶液，5.根据缓冲液顺序在4℃透析12小时，6.通过离心5分钟收集肾酶，7.用移液管将液体小心移至干净的试管中。这应该含有重折叠的可溶蛋白质，8.如下评定成功的重折叠最好进行功能性分析以确定是否存在活性蛋白质。错误折叠的或者聚集的蛋白质具有与正确折叠的蛋白质不同的活性。当在可溶级分中获得＞30％的输入蛋白质或者活性时，实现成功的重折叠。
实验中使用的缓冲液包括如下缓冲液缓冲液150mM MES pH 5.5，10mM NaCl，0.4mM KCl，2mMMgCl2，2mM CaCl2，0.75M盐酸胍，0.5％Triton X-100，1mM DTT，0.1mM FAD；缓冲液250mM MES pH 5.5，10mM NaCl，0.4mM KCl，2mMMgCl2，2mM CaCl2，0.5M精氨酸，0.05％聚乙二醇3,550，1mM GSH，0.1mM GSSH；缓冲液350mM MES pH 5.5，10mM NaCl，0.4mM KCl，1mMEDTA，0.4M蔗糖，0.75M盐酸胍，0.5％Triton X-100，0.05％聚乙二醇3,550，1mM DTT；
缓冲液450mM MES pH 5.5，200mM NaCl，10mM KCl，2mMMgCl2，2mM CaCl2，0.5M精氨酸，0.5％TritonX-100，1mM GSH，0.1mM GSSH；缓冲液550mM MES pH 5.5，200mM NaCl，10mM KCl，1mMEDTA，0.4M蔗糖，0.75M盐酸胍，1mM DTT；缓冲液650mM MES pH 5.5，200mM NaCl，10mM KCl，1mMEDTA，0.5M精氨酸，0.4M蔗糖，0.5％Triton X-100，0.05％聚乙二醇3,550，1mM GSH，0.1mM GSSH。
胺氧化酶分析肾酶的酶学分析使用Amplex Red单胺氧化酶分析试剂盒(Molecular Probes，Cat#A-12214)进行，其提供了一步荧光测定方法以使用荧光小平板读出器持续测定胺氧化酶活性。这个分析基于在辣根过氧化物酶偶联反应中检测H2O2，使用10-乙酰基-3，7-二羟基-吩噁嗪(Amplex Red reagent)进行，这种试剂是H2O2的一种高灵敏性和稳定的探针。实验根据厂商指导进行，最终底物浓度为2mM。
结果结构分析表明肾酶含有氨基氧化酶结构域，提示其在胺氧化中也许起作用。因此，我们使用一系列胺作为底物测试了其是否具有氧化酶活性。大肠杆菌中的肾酶融合蛋白通过使用GST基因融合系统将肾酶cDNA克隆进含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的pGEX表达载体中而产生。如图4a所示，肾酶特异性地以如下顺序代谢儿茶酚胺多巴胺＞肾上腺素＞去甲肾上腺素。其酶活性不受含有FAD的胺氧化酶MAO-A和MAO-B的抑制剂影响(图4b)。
使用谷胱甘肽琼脂糖柱将GST-肾酶融合蛋白纯化为均质(图5a)。纯化的融合蛋白分子量为大约64KD，与GST标记的分子量(26KD)加上预测的肾酶分子量(37.8KD)的总和一致。由于肾酶在肾脏中高度表达并且是一种分泌蛋白，因此可想像得到肾酶存在于血液循环中，及ESRD患者具有降低水平的肾酶。当用肾酶特异性抗体通过Western印迹分析血浆样品时(图5B)，发现在进行血液透析的ESRD患者中的肾酶水平实际上不可检测到，而正常个体的血液循环肾酶浓度为大约7mg/l。
我们随后使用一系列胺作为底物检测了肾酶是否具有氧化酶活性。如图6所示，当多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素(2mM)用作底物时，GST-肾酶融合蛋白具有显著的氧化酶活性。因此，可以推断肾酶是一种代谢多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的新蛋白质。
实施例4肾酶调节体循环血压血液动力学测定将Sprague Dawley大鼠(150-250g)用inactin(100mg/kg)麻醉。将一导管(PE-240)置于气管中以保护气道及置于左颈静脉(PE-50)中以经静脉内注入由正常盐水和6.25％牛白蛋白组成的维持溶液，流速为1.5ml/100g体重/小时。通过直肠温度计监测基础温度，及使用加热垫将体温保持在37℃。通过插入在左颈动脉中并与压力传感器(ADInstruments，CO，USA)连接的PE-50导管连续监测动脉血压和心率。使用PowerLab/8SP数据采集系统(ADIntruments)对血液动力学记录进行数字化处理、贮存和分析。在完成手术程序后将大鼠留置1小时以恢复，随后30分钟作为对照期。然后实验组接受静脉内推注于0.5ml PBS中的0.5mg重组肾酶。对照组注射于0.5ml PBS中的0.5mgBSA或0.5mg重组谷胱甘肽转移酶。持续测定血压和心率并记录。
血压是心输出量和周围血管阻力的函数，是由交感神经系统调节的。循环中的儿茶酚胺控制心率、心肌收缩力和阻力血管的紧张性。由于肾酶在血液中循环并降解儿茶酚胺，因此我们检测其在体内对血液动力学参数的作用。在一次静脉内推注重组肾酶的30秒内，收缩压、舒张压和平均动脉血压分别降低23.5±1.3％、32.6±2.9％和28.9±2.7％(n＝4，p＜0.001)。如图7A所示(上组)，血压在2分钟内复原，之后逐渐降低达到最低点(在60-90分钟内)，收缩压、舒张压和平均动脉血压低于基线16.5±1.5％、14.3±1.2％和14.8±1.1％(n＝4，p＜0.01)(图7A，下组)。心率最初保持不变，在60分钟略微降低(6.4％)(图7A，下组)。在对照组中，血压和心率不受注入的白蛋白或者GST的影响(图7B)。这些数据表明肾酶的降血压作用很可能是加速的儿茶酚胺降解的结果，其防止预期的脉搏增加(应答低血压)并且降低心肌收缩力及减少血管阻力。或者，肾酶可以结合关联受体并直接调节心肌收缩力和血管阻力。
表1
实施例5动物模型大鼠残肾模型(rat remnant kidney model，RRKM)可以如(Wada，M et al；J Clin Invest 1997 Dec 15；100(12)2977-83)所述使用大鼠部分(5/6)肾切除术或者大鼠残肾模型。首先将雄性大鼠(2-3月龄，体重大约150-200g)进行单侧肾切除术(左肾或右肾)。在腹部中心线作2.0cm皮肤切口，切口头端距剑骨尾端1.0cm。沿着中心线作2.0cm肌肉切口。分离右肾并清除周围的脂肪和结缔组织，以清楚地观察肾动脉和静脉及输尿管，因为它们进入肾门。小心进行分离以使得对肾上腺的破坏最小。将缚线(3/0silk)置于肾动脉、静脉和输尿管周围。然后在近肾端切断这些管腔，取出肾，小心操作以使得肾上腺不被破坏。手术程序的第二步包括在进行第一步7-10天后将剩余的肾的2/3切除。由于肾实体和功能的丧失导致血浆肌酸酐(Cr)和BUN水平显著升高。在接下来的几周后，存活动物的血浆Cr和BUN水平略微下降朝向正常值，但是仍是升高的。然后肾功能表现为相对保持恒定或者稳定一段时间。之后，动物进入慢性肾衰竭阶段，其中肾功能基本上线性降低直至死亡。
作为手术对照，将年龄、体重匹配的大鼠进行“假”手术操作，其中去除肾的被膜但是未切除肾组织。
模型肾衰竭的干预模型在这个模型中，进行肾切除术的大鼠和假手术的大鼠在手术后均饲养5-6个月。在这个时间点，存活的肾切除动物进入慢性肾衰竭阶段。
将大鼠分为8个组，每组15只大鼠。两组肾切除的大鼠用作对照(Nx对照)，其中一组根本不接受处理，另一组接受仅注射运载体缓冲液。另外，假手术的两组用作对照(假对照)，其中一组仅接受运载体缓冲液，另一组以100μg/kg体重接受可溶肾酶。还应用4个肾切除大鼠实验组，通过SQ注射接受10、100、500μg/kg体重的肾酶。肾酶处理的和仅运载体处理的大鼠每天接受两次注射，共进行4-8周。
在所有组中在进行肾酶处理之前和期间检测血浆BUN、Cr。预期肾酶对于Nx大鼠提供治疗益处(减缓慢性肾衰竭的进展)。在肾酶处理结束时进行组织学研究以检测肾小球硬化、小管破坏、间质硬化和微动脉瘤迹象。
慢性肾衰竭的预防模型为了检测肾酶(肾治疗剂)预防、抑制或者延缓慢性肾衰竭发生的能力，将大鼠进行如上所述的部分肾切除术或者假手术。在开始肾酶治疗之前在手术第二步之后将大鼠恢复大约2周。在这个时间点，存活的动物经过急性肾衰竭阶段并且还未进入慢性肾衰竭。将大鼠分为两组，每组12只大鼠。一组仅接受运载体缓冲液(Nx对照)，而另一组接受100μg/kg体重的肾酶处理，每日经SQ给予两次。给予肾酶或者运载体持续大约8-9周。
在所有组中在注射肾酶之前和期间均检测血浆BUN和Cr。预期肾酶防止、抑制或者延缓慢性肾衰竭的发生。在肾酶处理结束时也进行组织学研究，以检测肾小球硬化、小管破坏、间质硬化和微动脉瘤迹象。
高血压模型原发性高血压和心血管研究中通常使用自发型高血压远交大鼠(SHR)。雄性、12周龄或更老的大鼠可信地呈现平均收缩压高于200mmHg。肾酶的抗高血压作用可以在SHR中测试。
将SHR大鼠分为两组，每组12只大鼠。一组仅接受运载体缓冲液，而另一组接受100μg/kg体重的肾酶，每日经SQ给予两次。持续给予肾酶或者运载体大约2-6周。通过可植入的遥测装置每天检测大鼠血压。
充血性心力衰竭模型充血性心力衰竭(CHF)模型在文献中已经充分描述，包括大动物和小动物。技术人员可以使用这些模型测试肾酶的预防和治疗作用。例如，如Delehanty et al(Delehanty JM et al.，Am J Physiol.1994 Mar；266(3 Pt 2)H930-5)所述，可以使用快速心室起搏模型以在犬类(即狗)中诱导CHF。将狗进行225次/分钟起搏，持续8周产生心力衰竭，这可通过与以100次/分钟起搏8周的狗相比增高的左心房血压、相对于时间的左心室血压下降的一阶导数(first derivative)及降低的心输出量而表明。快速起搏的狗还呈现增高的血浆NE和降低的心肌NE含量。
也可以使用其它CHF动物模型。例如，如前所述将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠进行左冠状动脉结扎(Greenen，D.L.et al.，J.Appl.Physiol.6392-96(1987)；Buttrick，P.et al.，Am.J.Physiol.26011473-11479(1991))以诱导心肌梗塞。将大鼠用戊巴比妥钠(60)mg/kg，ip)麻醉，通过气管切开术插管，并通过呼吸机换气。在进行左侧胸廓切开术后，将左冠状动脉从距其根部大约2mm之处用7-0丝状缝合线结扎。假手术动物进行相同的程序，但是将缝合线在冠状动脉之下穿过然后除去。在结扎后4-6周内，大鼠的心肌梗塞可发展成为心力衰竭。在临床患者中，心肌梗塞或者冠心病是导致心力衰竭的最常见因素。在这个模型中充血性心力衰竭比较好地模拟在大多数病人中的充血性心力衰竭。
中风(脑血管意外)模型中风(stroke)是由于脑的血液供应异常导致的突发功能丧失。中风根据严重程度的不同水平而存在“短暂性缺血性发作”或者“TIA”(非永久性失能)、“部分非进展性中风”、“完全性中风”(永久的灾难性神经缺陷)等类型。
有中风倾向的自发性高血压(SHR-SP)大鼠通常用于中风模型。这个实验可用于测试肾酶在中风的预防/治疗中的可能的有益作用。将雄性8周龄SHR-SP大鼠随机分为两组。对照大鼠给予普通食物和含有1％NaCl的水作为饮用溶液，对照组接受运载体注射。治疗组接受经SQ注射的肾酶(100μg/kg，每日两次)持续4-8周。收缩压在神志清醒的动物通过tail-cuff方法测定，这两组中的中风率使用磁共振成像(MRI)、组织病理学和神经行为测试进行测定。
关节硬化模型已知儿茶酚胺导致血管损伤，并且在存在高脂血症的情况下导致加速的和恶化的动脉粥样硬化(Kukreja RS et al，Atherosclerosis.(1981)40(3-4)291-8.)。因此，肾酶可预防/治疗动脉粥样硬化。如Kukreja etal(Kukreja RS et al，Atherosclerosis.1981 Nov-Dec；40(3-4)291-8.)所述，晚期大动脉和冠状动脉粥样硬化可以利用两个程序在恒河猴中产生(a)给予7个月高脂肪和高胆固醇食物，及(b)将这种饮食结合每日i.v.注射肾上腺素(50μg/kg体重)。进行了程序(b)的猴将明显产生晚期动脉粥样硬化，以大动脉和冠状动脉内存在纤维状斑的形式表现，这些损害预期在其它组中频率很低。总血清胆固醇与游离血清胆固醇的比率显著增加，大动脉胆固醇含量在给予导致动脉粥样化的饮食和肾上腺素注射的猴中非常高。这些模型可用于测试肾酶对于预防和治疗动脉粥样硬化的作用。
测试肾酶的另一种模型包括apoE敲除小鼠(Zhang SH，ReddickRL，Piedrahita JA，Maeda N.，(1992)Spontaneous hypercholesterolemiaand arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E，Science，258，468-471)。apoE敲除小鼠是通过基因靶向技术在胚胎干细胞中破坏apoE基因而产生的。ApoE是一种糖蛋白，是由肝脏合成的极低密度脂蛋白(VLDL)和肠道合成的乳糜微粒的结构成分。其也是参与细胞中胆固醇转运活性的高密度脂蛋白(HDL)亚类的成分。apoE的最重要作用之一是介导乳糜微粒和含有apoE的VLDL颗粒与低密度脂蛋白(LDL)受体的高度亲和性结合。这样可以使得肝脏特异性吸收这些颗粒，这是胆固醇转运所必需的，防止富含胆固醇的残渣在血浆中积聚。apoE基因的纯合失活导致动物血清中没有apoE。小鼠看起来发育正常，但是它们呈现出的血浆胆固醇是正常血清血浆胆固醇的5倍，并且呈现自发动脉粥样硬化损害。这与在具有与LDL受体结合缺陷的变体形式apoE基因及处于早期发生动脉粥样硬化危险中和增高的血浆甘油三酯和胆固醇水平的人体中产生的疾病一致。apoE敲除小鼠广泛用作动脉粥样硬化模型以研究修饰导致动脉粥样硬化过程的干预治疗方案，并且在本发明中可用于测试使用肾酶的这种治疗方案的作用。
实施例6进一步研究除了前述实施例之外，本发明人还计划或进行了一些研究。一项研究包括在大约300个对象中临床评定肾酶水平与肾功能之间的关系。迄今有70人登记。在大约6-7周可获得初步结果。在另一项研究中，本发明人将评价在慢性肾衰竭的大鼠模型中，通过皮下注射长期给予肾酶对于慢性肾病的进展和心血管并发症的发生的作用。在又一项研究中，本发明人将评价在大鼠模型中肌内注射CMV-肾酶载体的效力。
讨论本发明鉴别的肾酶是使用功能性基因组数据库在人体中鉴别的第三种单胺氧化酶。与MAO-A和MAO-B相似，肾酶代谢儿茶酚胺，如多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NA)和肾上腺素(EP)。肾酶具有一些与MAO-A和MAO-B不同的重要独特特征。首先，与MAO-A和MAO-B相比，肾酶主要在肾脏中表达，提示肾酶在外周代谢儿茶酚胺中具有独特的作用。据信循环的单胺的代谢是由许多胞内酶进行的(Eisenhofer et al.，2001)，包括MAO-A、MAO-B、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)和磺基转移酶。因为这些酶具有胞内定位，限制循环儿茶酚胺的寿命的主要机制是通过主动转运至细胞内而摄取，不是由酶代谢。这与MAO-A和MAO-B的主要作用依赖于胺的代谢及神经递质水平的调节和胞内胺的贮存的观点一致。
其次，与位于线粒体外膜中的MAO-A和MAO-B不同，肾酶是一种分泌蛋白，提示儿茶酚胺清除可发生在细胞外空间，挑战了儿茶酚胺必需由细胞吸收以进行分解代谢的传统想法。肾酶于血液中循环，在此其分解代谢血清儿茶酚胺。可能肾酶时时“微调”血浆儿茶酚胺水平。
第三，肾酶在肾脏中高度表达，提示肾通过肾酶催化途径参与儿茶酚胺降解。本文提供的数据与肾酶在全身水平以及在局部肾水平调节儿茶酚胺的假说一致。可以想像得到，与分解代谢胞内胺的MAO-A和MAO-B联合，肾酶是氧化胞外儿茶酚胺的一种重要酶，因此有助于调节全面的交感紧张。
肾酶在近端小管中最富集，其在正常个体的血液循环中存在，提示近端小管中的肾酶蛋白质可以通过基底膜分泌进血液循环中，在此分解代谢其底物，因此在全身水平调节儿茶酚胺稳态。
可能肾酶在肾小管腔内也发挥其生物学功能，因为肾酶是小蛋白，可易于滤过至肾单位腔内。另外，肾酶可以由近端小管通过顶端膜直接分泌，在此其代谢通过肾小球过滤及由肾小管细胞再次重新产生的底物如多巴胺(Wang et al.，2001)。肾酶在内腔代谢儿茶酚胺的意义是调节内腔儿茶酚胺水平，由此调节盐和水的再吸收。
近来的研究已经示出血浆多巴胺(Cuche et al.，1986；Prinseau etal.，1986)和去甲肾上腺素(Zoccalie et al.，2002)在ESRD患者中持续升高。儿茶酚胺水平的这些改变对于心血管疾病的发病非常重要，所述心血管疾病如无症状型左心室机能障碍(Benedict et al.，1996)、慢性充血性心力衰竭(Rouleau et al.，1994)和动脉粥样硬化(Rozanskiet-al.，1999)。心血管并发症中高度交感紧张的重要性通过干预研究也得以支持(Tendera et al.，2001)。在ESRD患者中，增加的循环儿茶酚胺可以使得尿毒症患者易感一系列心血管并发症，包括左心室肥大及心律不齐(Zoccali et al.，2002)。ESRD患者中儿茶酚胺升高的机制还不太清楚。本发明关于肾酶的揭示(肾酶分解代谢儿茶酚胺并且在肾脏中高度表达)可以解释这些患者中儿茶酚胺紊乱的发病机制，因为这些患者丧失其肾脏实体(与ESRD患者中红细胞生成素分泌减少相似)。
在ESRD患者中观察到肾酶显著降低不令人惊奇，因为肾酶主要在肾中表达，这是ESRD患者已经丧失功能的器官。肾酶分解代谢儿茶酚胺结合ESRD患者中儿茶酚胺水平增高的事实，明显提示肾酶是维持儿茶酚胺稳态的一种关键蛋白质，MAO-C是引起儿茶酚胺紊乱而引起高血压、心血管疾病如无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭和动脉粥样硬化的遗漏因子(missing factor)。
前文进行的详细描述只是为了更清楚地理解本发明，而无任何限制本发明之意，本领域技术人员可对本发明进行修改。
本发明结合其特异性实施方案已经加以描述，应理解对本发明可以进行进一步修改，本申请涵盖根据本发明的原理所作出的任何变化、应用或者调整，包括违背本发明揭示但在本领域已知或者惯例实践中的任何调整，本发明可根据上文所述基本特症及随后所附权利要求书的要求加以应用。
参考文献本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开包括但不限于下文列出的文献，其以其全文并入参考。
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<210>4<211>2107<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4aaaagcccgg gccgaacggc cccgccgcag agactcagcg cggatcgctg ctccctctcg 60ccatggcgca ggtgctgatc gtgggcgccg ggatgacagg aagcttgtgc gctgcgctgc 120tgaggaggca gacgtccggt cccttgtacc ttgctgtgtg ggacaaggct gaggactcag 180ggggaagaat gactacagcc tgcagtcctc ataatcctca gtgcacagct gacttgggtg 240ctcagtacat cacctgcact cctcattatg ccaaaaaaca ccaacgtttt tatgatgaac 300tgttagccta tggcgttttg aggcctctaa gctcgcctat tgaaggaatg gtgatgaaag 360aaggagactg taactttgtg gcacctcaag gaatttcttc aattattaag cattacttga 420aagaatcagg tgcagaagtc tacttcagac atcgtgtgac acagatcaac ctaagagatg 480acaaatggga agtatccaaa caaacaggct cccctgagca gtttgatctt attgttctca 540caatgccagt tcctgagatt ctgcagcttc aaggtgacat caccacctta attagtgaat 600gccaaaggca gcaactggag gctgtgagct actcctctcg atatgctctg ggcctctttt 660atgaagctgg tacgaagatt gatgtccctt gggctgggca gtacatcacc agtaatccct 720gcatacgctt cgtctccatt gataataaga agcgcaatat agagtcatca gaaattgggc 780cttccctcgt gattcacacc actgtcccat ttggagttac atacttggaa cacagcattg 840aggatgtgca agagttagtc ttccagcagc tggaaaacat tttgccgggt ttgcctcagc 900caattgctac caaatgccaa aaatggagac attcacaggt accaagtgct ggtgtgattc 960taggatgtgc gaagagcccc tggatgatgg cgattggatt tcccatctga cttcctggaa 1020attggagcac acagtcaggt tttatttgat tttttttttt aaggatacca cttcacagcc 1080tttaggatag ctattattta gaagcaaaac agaagataaa tgttggcaag gatgtggaga 1140tattggattc ccttgtgcag tgccggtggg aatgtaaaat gatgtagcta ctatggaaaa 1200tgatacggca atttctttag aaatgaaata tagaattgcc gtatgatctg cagttccaca 1260tctggatatc tatccaaaag aagtgaaagt agggacttga acgaacattt gtacaccaat 1320gttcacagcg gctttattca caacagccaa aaggtggaag caacccagtg tccatggata 1380gatgaataga taaataaaat gtggtataaa catacaatgg gctattgttt agccttaaaa 1440gggaaggaaa ttctgacatg ctgcaatatg gatgaagctt aaagtcatta tgcaaagtgg 1500aataagccta tcacaaaaaa taatattaca taattctact tatatgagga atctagagca 1560gtcagtttca cagagacaga aaatagaatg gtggttgcca agggctggga gaagagggca 1620atggagagtg agtgtttagt gggtcagagt tttagtttgg gaaggtaaaa agttctggag 1680atggatgatg gttatgggtg ctcaacagtg tgaatgtact taatgccaca gaactgcaca 1740tttaaatgtg gttaaaatca tcacttttat gttatgtata tttaccacaa taaataaaga 1800agttgatatt tcttatactt acaaagagga gaagggcatt tgcaaatcaa caagaagtgt 1860gaggcccctc tctctagcag aaaaatagac taaatctatt tctttatctt ttaacatcct 1920gtttaaggga aatgccaaaa caaatgggaa aaaatacaca cacacaaata tatatgaaca 1980tgttttgcct catgagtaat caaaatgtgt acatatgtat gtttatgtat gtgtgtttat 2040
atttaaaatc gtgttctgcc ttatgagtaa acaaaaagta tacaaattaa aaactataat 2100gaaacgt2107<210>5<211>1924<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ggggaagtct tgtgagatct gatggttttg taaagggcag ttgtacatat gctatcttgc 60ctgccaccac taattagtga atgccaaagg cagcaactgg aggccgtgag ctactcctct 120cgatatgctc tgggcctctt ttatgaagct ggtacgaaga ttgatgtccc ttgggctggg 180cagtacatca ccagtaatcc ctgcatacgc ttcgtctcca ttgataataa gaagcgcaat 240atagagtcat cagaaattgg gccttccctc gtgattcaca ccactgtccc atttggagtt 300acatacttgg aacacagcat tgaggatgtg caagagttag tcttccagca gctggaaaac 360attttgccgg gtttgcctca gccaattgct accaaatgcc aaaaatggag acattcacag 420attttgtttg gtgggggaag tggatgtgca cacagaagag cttgagacca cccgtacgtt 480tacattatcc cctcatgaga ttaatttctg gttacaaatg ctgctgccaa ctgtcctggc 540caaatgactc tgcatcacaa acctttcctt gcatgtggag gggatggatt tactcagtcc 600aactttgatg gctgcatcac ttctgcccta tgtgttctgg aagctttaaa gaattatatt 660tagtgcctat atccttattc tctacatgtg tattgggttt ttattttcac aattttctgt 720tattgattat tttgttttct attttgctaa gaaaaattac tggaaaattg ttcttcactt 780attatcattt ttcatgtgga gtataaaatc aattttgtaa ttttgatagt tacaacccat 840gctagaatgg aaattcctca caccttgcac cttccctact tttctgaatt gctatgacta 900ctccttgttg aaggaaaagt ggtacttaaa aaataacaaa cgactctctc aaaaaaatta 960cattaaatca caataacagt ttgtatgcca aaaacttgat tatccttatg aaaatttcaa 1020ttctgaataa agaataatca cattatcaaa gccccatctt aagtcttcgg atgtgtcctt 1080gaatcaataa ttttgcaaat tatacaaaac aagatttttc caaaatgtag gtaacagagt 1140gtaattctta tttctcattt atcccccaag ttattaagtg atcctgaatt gtaggtcata 1200tatgtcatca tcttagtgtg gagggcaact tgactgataa agagaccttc cttcagattt 1260tcagaaagta taagattcca catgattttc ccagccacac agtacttttt aactttcaaa 1320caaattccag tcctaatatg aaagataaaa attaaataga aacagagaga aagtatatcg 1380atccttacct tttgctatat tttatagctg ttgctgttac tttatgggct ctccagtatg 1440tgctgtggca tttagactgt gtcgagttta atgaatttaa cacaacaaaa aatttactga 1500accagaaaat agatgcactt aaaatagttc aatatttgcc aagttggtgg ttcagcatat 1560cacccacatg cttcagtgac ctgaccccac gacttgctag ctggagagaa atcaatctcc 1620agccttccaa accagctacc tgttgctaat ttgaaaagca aaatgatgag ttctatttca 1680gcattttgaa aggagaaaaa tcattgcagc ctctcaaact aacaaaagtt caacaaaaga 1740cttcttactg taatagtgtt taaagtttca cacttacatg tccactgtca tacatacaca 1800tacacaggca caggcagaac ttgcttctat agctgcaaag tgggttttat gaccctatag 1860catattatta tatgtttcct cttagcaata aattggtgaa aaacttaaat gccaaaaaaa 1920aaaa 1924
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Glu Ala Pro Val Ala Tyr Thr Leu Asp Asp Thr Lys Pro Glu Gly Asn325 330 335Tyr Ala Ala Ile Met Gly Phe Ile Leu Ala His Lys Ala Arg Lys Leu340 345 350Ala Arg Leu Thr Lys Glu Glu Arg Leu Lys Lys Leu Cys Glu Leu Tyr355 360 365Ala Lys Val Leu Gly Ser Leu Glu Ala Leu Glu Pro Val His Tyr Glu370 375 380Glu Lys Asn Trp Cys Glu Glu Gln Tyr Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Thr385 390 395 400Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Leu Thr Gln Tyr Gly Arg Val Leu Arg Gln405 410 415Pro Val Asp Arg Ile Tyr Phe Ala Gly Thr Glu Thr Ala Thr His Trp420 425 430Ser Gly Tyr Met Glu Gly Ala Val Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Arg435 440 445Glu Ile Leu His Ala Met Gly Lys Ile Pro Glu Asp Glu Ile Trp Gln450 455 460Ser Glu Pro Glu Ser Val Asp Val Pro Ala Gln Pro Ile Thr Thr Thr465 470 475 480Phe Leu Glu Arg His Leu Pro Ser Val Pro Gly Leu Leu Arg Leu Ile485 490 495Gly Leu Thr Thr Ile Phe Ser Ala Thr Ala Leu Gly Phe Leu Ala His500 505 510Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Val515 520
权利要求
1.一种分离的多肽，其包含与SEQ ID NO2所示氨基酸序列具有至少大约15％序列相同性的氨基酸序列。
2.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
3.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO2的第17-342位氨基酸残基的氨基酸序列。
4.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽不包括在N末端的信号肽。
5.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽包含FAD结合位点。
6.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是活性肾酶蛋白。
7.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是哺乳动物肾酶蛋白。
8.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是人肾酶蛋白。
9.权利要求1-3任一项的分离的多肽，其中所述多肽进一步包含辅因子。
10.权利要求9的分离的多肽，其中所述辅因子是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或其类似物。
11.权利要求9的分离的多肽，其中所述辅因子是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
12.一种组合物，其包含或者基本上由权利要求1-11任一项的分离的多肽和一种药物可接受的载体、稀释剂或者运载体组成。
13.权利要求12的组合物，其中所述组合物是针对口服或者可注射给予方式配制的。
14.权利要求12的组合物，其中所述组合物是立即释放或者控制释放剂型形式。
15.权利要求12的组合物，其中所述多肽是微晶形式。
16.权利要求12的组合物，其中所述多肽被包囊于纳米颗粒中。
17.一种组合物，其包含或者基本由一种多肽和一种药物可接受的载体、稀释剂或者运载体组成，其中所述多肽具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者SEQ ID NO2的第17-342位残基的氨基酸序列。
18.一种产生活性肾酶多肽的方法，包括将黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与权利要求1-8任一项的分离的多肽结合。
19.权利要求18的方法，其中所述辅因子是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或其类似物。
20.权利要求19的方法，其中所述酶辅因子是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
21.一种获得肾酶蛋白的方法，包括从至少一种体液中分离蛋白质，从而获得肾酶蛋白。
22.权利要求21的方法，其中所述体液选自血液、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、全血、脑脊液组织培养基及细胞提取物。
23.权利要求21的方法，其进一步包括通过使用离子交换层析、吸附层析、配体结合亲和性层析、凝胶渗透层析或者其任意组合而进一步纯化获得的肾酶蛋白。
24.一种获得肾酶蛋白的方法，包括从产生所述肾酶蛋白的细胞、细胞培养物、组织、组织培养物、器官或者器官培养物中分离蛋白质，从而获得肾酶蛋白。
25.一种获得肾酶蛋白的方法，包括在培养基中培养细胞，由此产生所述肾酶蛋白，从所述细胞和/或培养基中分离所述蛋白质，从而获得肾酶蛋白。
26.一种抗体，其与权利要求1-11任一项的分离的多肽特异性结合。
27.一种抗体，其与哺乳动物肾酶蛋白或其片段特异性结合。
28.权利要求26或27的抗体，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体和合成抗体。
29.一种预防、治疗或改善哺乳动物中肾酶介导的病变、障碍或疾病的方法，包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1-8任一项的分离的多肽。
30.权利要求29的方法，其中所述病变、障碍或疾病选自肾脏病变、障碍或者疾病；心血管病变、障碍或者疾病；心脏病变、障碍或者疾病；中枢神经系统(CNS)病变、障碍或者疾病；及其任意组合。
31.权利要求30的方法，其中所述心血管病变、障碍或者疾病选自高血压、无症状型左心室机能障碍、慢性充血性心力衰竭(CHF)、心肌梗塞(MI)、心律不齐、中风、动脉粥样硬化，及其任意组合。
32.权利要求31的方法，其中所述高血压选自慢性高血压、收缩期高血压、孤立收缩期高血压、糖尿病高血压、肺高血压、急性严重高血压、及其任意组合。
33.权利要求30的方法，其中所述肾脏病变、障碍或者疾病选自晚期肾病(ESRD)、慢性肾衰竭、及其任意组合。
34.一种为需要治疗的哺乳动物提供肾酶治疗的方法，所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求1-8任一项的分离的多肽。
35.一种预防、治疗或减轻ESRD的方法，所述方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的权利要求1-8任一项的分离的多肽。
36.一种预防、治疗或者减轻CNS病变、障碍或者疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的肾酶抑制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述CNS病变、障碍或者疾病选自抑郁症、焦虑、躁狂症、精神分裂症、及其任意组合。
38.权利要求36的方法，其中所述肾酶抑制剂选自小分子抑制剂、抗体、核酶、干扰核糖核酸、反义核酸分子，及其组合。
39.权利要求36-38任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。
40.一种预防、治疗或者减轻需要治疗的哺乳动物中肾酶介导的病变、障碍或者疾病的基因治疗的方法，所述方法包括给予哺乳动物分离的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1所示核酸序列或者包含SEQ ID NO1的第24-1049位残基的核酸序列。
41.权利要求40的方法，其中所述分离的核酸进一步包含与SEQID NO1所示核酸序列或者包含SEQ ID NO1的第24-1049位残基的核酸序列可操纵地连接的启动子。
42.权利要求40的方法，其中所述分离的核酸使用病毒载体给予。
43.一种预防、治疗或者减轻需要治疗的哺乳动物中肾酶介导的病变、障碍或者疾病的基因治疗方法，所述方法包括(a)用SEQ IDNO1所示核酸序列或者包含SEQ ID NO1的第24-1049位残基的核酸序列离体对哺乳动物细胞进行工程化；及(b)将经工程化的细胞回送到该哺乳动物中。
44.一种预防、治疗或者减轻需要治疗的哺乳动物中高血压的方法，所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的肾酶激动剂，从而提高肾酶的表达及预防、治疗或减轻哺乳动物高血压。
45.一种预防、治疗或减轻需要治疗的哺乳动物中ESRD的方法，所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的肾酶激动剂，从而增加的肾酶表达并预防、治疗或者减轻哺乳动物ESRD。
46.一种诊断或者有助于诊断哺乳动物的病变、障碍或者疾病、或者诊断或者有助诊断哺乳动物对病变、障碍或者疾病易感性的方法，其中所述病变、障碍或者疾病与哺乳动物中肾酶表达改变相关，所述方法包括检测哺乳动物中肾酶表达水平，并将所述哺乳动物中所述肾酶表达水平与不患有所述病变、障碍或者疾病的哺乳动物中肾酶表达水平相对比，从而诊断或者有助于诊断哺乳动物患有所述病变、障碍或者疾病或者对其的易感性。
47.权利要求46的方法，其中所述病变、障碍或者疾病选自ESRD、高血压、ANT、心血管疾病及其组合。
48.权利要求46的方法，其中所述病变、障碍或者疾病是CNS病变、障碍或者疾病。
49.一种鉴别增加肾酶在细胞中表达的化合物的方法，所述方法包括将肾酶在其中表达的细胞与化合物接触，并将与所述化合物接触的所述细胞中的肾酶表达水平与另外未与所述化合物接触的相同细胞中肾酶表达水平相对比，其中在与所述化合物接触的细胞中肾酶表达水平高于另外未与所述化合物接触的相同细胞中肾酶表达水平表明所述化合物增加肾酶在所述细胞中的表达。
50.一种鉴别降低肾酶在细胞中表达的方法，所述方法包括将肾酶在其中表达的细胞与一种化合物接触，将与所述化合物接触的所述细胞中肾酶表达水平与另外未与所述化合物接触的相同细胞中肾酶表达水平相对比，其中在与所述化合物接触的细胞中肾酶表达水平低于另外未与所述化合物接触的相同细胞中肾酶表达水平表明所述化合物降低肾酶在所述细胞中的表达。
51.一种通过权利要求49或者50的方法鉴别的化合物。
52.一种鉴别权利要求1-8任一项的分离的多肽的结合配偶体的方法，所述方法包括(a)将所述分离的多肽与一种潜在的结合配偶体接触；并(b)确定所述潜在结合配偶体是否影响所述多肽的活性，从而鉴别结合配偶体。
53.一种分离的核酸分子，其包含与包含启动子/调节序列的核酸可操纵地连接的SEQ ID NO1所示核酸序列。
54.一种分离的核酸分子，其包含与包含启动子/调节序列的核酸可操纵地连接的SEQ ID NO1所示核酸序列的第24-1049位残基。
55.一种分离的核酸分子，其包含与编码启动子/调节序列的核酸序列可操纵地连接的、与SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少大约40％序列相同性的核酸序列。
56.权利要求55的分离的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包含编码与之共价连接的标记多肽的核酸序列。
57.一种包含权利要求55或56的核酸分子的载体。
58.一种重组细胞，其包含权利要求55的核酸分子、权利要求56的核酸分子或者权利要求57的载体。
59.一种产生肾酶多肽的方法，所述方法包括培养能表达所述肾酶多肽的重组细胞，所述肾酶多肽由一种核酸分子编码，该核酸分子具有与SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少大约40％序列相同性的核酸序列。
60.一种分离的肾酶多肽，其由权利要求59的方法产生。
61.权利要求59的方法，其中所述核酸分子编码肾酶蛋白，该蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少大约95％相同。
62.一种分离的肾酶蛋白，其通过权利要求61的方法产生。
63.一种产生肾酶多肽的方法，所述方法包括(a)在使得核酸分子表达的条件下培养包含权利要求53的分离的核酸分子的重组细胞；并(b)收获由所述细胞产生的所述肾酶蛋白。
64.一种分离的肾酶多肽，其通过权利要求63的方法产生。
65.一种分离的核酸分子，其与一种核酸序列互补，所述核酸序列与SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少大约40％序列相同性，其中所述互补核酸分子是反义方向。
66.权利要求65的分离的核酸分子，其进一步包含与其可操纵地连接的启动子/调节区。
67.一种产生肾酶多肽的方法，所述方法包括培养能表达编码肾酶多肽的核酸的重组细胞，所述肾酶多肽由一种核酸分子编码，该核酸分子具有与SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少大约40％序列相同性的核酸序列，其中所述互补核酸是反义方向。
68.权利要求67的方法，其中所述核酸序列进一步包含与其可操纵地连接的启动子/调节区。
69.一种分离的肾酶多肽，其通过权利要求67或68的方法产生。
全文摘要
本发明提供了哺乳动物单胺氧化酶C(MAO－C)、也称为肾酶的的鉴别、分离和应用。
文档编号C12P21/04GK101076586SQ200580015867
公开日2007年11月21日 申请日期2005年3月21日 优先权日2004年3月19日
发明者徐建朝, 加里·迪西尔 申请人:耶鲁大学