专利名称：重组修饰的纤溶酶的制作方法
背景技术：
人纤溶酶原是包含791个氨基酸残基的单链蛋白。通过对酶原中Arg561-Val562肽键的单一的裂解，导致纤溶酶原激活成为纤溶酶。所得到的纤溶酶分子是双链的二硫键连接的丝氨酸蛋白酶，具有胰蛋白酶样特异性(在Lys和Arg之后裂解)。
纤溶酶的氨基-末端重链(残基1-561，大约60kDa)由五个三环域(kringle)组成，各自包含大约80个氨基酸残基。所述三环域负责纤溶酶原的调控特性，如与激活抑制剂例如Cl-1离子的相互作用；与激活刺激剂例如ε-氨基己酸的相互作用；与哺乳动物和细菌细胞的相互作用；和与其他蛋白的相互作用，如纤溶酶生理学底物血纤蛋白和纤溶酶抑制剂α2-抗纤溶酶。在所有五个三环域中，三环域1是最多功能的一种；业已证实了它的赖氨酸-结合活性负责引起纤溶酶与α2-抗纤溶酶和血纤蛋白的相互作用。参见Wiman，B.，et al.，Biochim.Biophys.Acta 579142-154(1979)；和Lucas，M.A.，et al.，J.Biol.Chem.2584249-4256(1983)。
纤溶酶的C-末端轻链(残基562-791，大约25kDa)是典型的丝氨酸蛋白酶，与胰蛋白酶同源，并且包含典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体His603，Asp646和Ser741。纤溶酶原包含24个二硫键和在Asn289和Thr346上的2个糖基化位点。
业已证实弹性蛋白酶对纤溶酶原的有限的蛋白水解产生三个片段(Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3191-209(1978))。第一个片段，K1-3，包括前三个三环域，并且能够以两种形式分离，Tyr79-Val338和Tyr79-Val354。第二个片段K4相当于第四个三环域，并且包括残基Val355-Ala440。最后一个是C-末端片段(所谓的小-纤溶酶原)，包括残基Val443-Asn791，并且由第五个三环域和丝氨酸蛋白酶结构域组成。小-纤溶酶原能够以与纤溶酶原相同的方式被激活，形成小-纤溶酶。
由于全长纤溶酶原分子的复杂结构，细菌表达系统未证实可用于纤溶酶原的重组生产。纤溶酶原是以不溶性的内含体形式生产的，并且不能够从那种状态再折叠。另外，纤溶酶原在哺乳动物细胞中的表达由于纤溶酶原在细胞内激活形成纤溶酶和所致的细胞毒性而复杂化。用昆虫细胞生产具有完全活性的纤溶酶原是可能的，不过，由于产量低该系统不适合大规模生产。
因此，需要修饰过的重组蛋白，它具备纤溶酶/纤溶酶原的理想特征，同时缺乏某些负面特征，并且能够以较大数量在细菌细胞中生产。
发明概述本发明提供了包含编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽具有与天然人纤溶酶原的三环域同源的单一的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸。所述N-末端三环域可与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源。
在某些实施方案中，所述编码的多肽与SEQ ID NO2所示出的序列的同一性为至少90％，95％，或98％。另外，所述编码的多肽可以是SEQ ID NO2所示出的序列。
所述多核苷酸的核苷酸序列可以是SEQ ID NO1所示出的序列或其简并变体。所述核苷酸序列可以编码一种多肽，其具有与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域同源的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。所述核苷酸序列还可以编码这样的多肽，其具有单一的N-末端三环域，它与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域至少90％相同；和与人纤溶酶原的激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域的同一性为至少90％的C-末端结构域。所述编码的多肽能够结合固定化的赖氨酸。
另一方面，本发明提供了多肽，其具有N-末端三环域，与天然人纤溶酶原的三环域同源；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。
在某些实施方案中，所述多肽可具有与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源的N-末端三环域。
在某些实施方案中，所述多肽可以表现出纤维蛋白溶解活性，该活性可以被α2-抗纤溶酶抑制，抑制速度比α2-抗纤溶酶对小-纤溶酶的纤维蛋白溶解活性的抑制速度快至少大约5倍。被α2-抗纤溶酶抑制的速度还可以比对小-纤溶酶的抑制速度快至少大约10倍，20倍，30倍，或40倍。
在某些实施方案中，所述多肽能够结合固定化的赖氨酸。所述固定化的赖氨酸可以是结合在固体支持基质上的选自下列一组的赖氨酸赖氨酸-琼脂糖，赖氨酸-BIOGEL(BioRad，Hercules，CA)，赖氨酸-HYPERD(Pall Life Sciences，East Hills，NY，一种赖氨酸-水凝胶)，赖氨酸-SEPHAROSE(SEPHAROSE是一种交联的琼脂糖)。所述固定化的赖氨酸可以是赖氨酸-SEPHAROSE。
在某些实施方案中，所述多肽可表现出对血纤蛋白原的结合亲和力比小-纤溶酶对血纤蛋白原的结合亲和力低。
在某些实施方案中，所述多肽可表现出对部分裂解的血纤蛋白的结合亲和力比小-纤溶酶对部分裂解的血纤蛋白的结合亲和力高。
在某些实施方案中，所述多肽可以具有位于纤溶酶原激活位点和纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域的N-末端的单一的三环域，其中，所述三环域与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4的氨基酸序列同一性，比与天然人纤溶酶原的三环域5的序列同一性多至少一个残基。对于这些实施方案来说，可以理解的是，本发明多肽的三环域区相对于人纤溶酶原的三环域1和三环域4的天然序列的保守性置换就与三环域5作同一性比较目的而言不被认为与所述天然序列不同。
在某些实施方案中，所述多肽可以具有SEQ ID NO2所示出的氨基酸序列，及其保守性置换。所述多肽可以在相对位置具有与SEQ IDNO2所示出的氨基酸序列的76位上的残基(其为精氨酸)类似的残基。
另一方面，本发明包括含有本发明的多核苷酸的载体，以及含有所述载体的培养的宿主细胞。
附图的简要说明
图1是在通过蛋白酶剪切激活之后天然纤溶酶的示意图。K1-K5是三环域区1-5；而SP是丝氨酸蛋白酶结构域。“α2-AP”是三环域1上的α2-抗纤溶酶结合部位。
图2是本发明的纤溶酶原缺失变体的示意图，使用图1所示的相同的命名，并且显示K2-5的缺失。
图3显示人纤溶酶原的氨基酸序列，显示19个残基的前导序列，编号为-19至-1，并且纤溶酶原序列显示为1-791号残基(参见SEQ IDNO3(人纤溶酶原的cDNA序列；和SEQ ID NO4，所编码的氨基酸序列，如图3所示)。示出了多种特征，包括以下特征Δ-纤溶酶原序列(加阴影的)；三环域1-5(双下划线)；糖基化位点Asn289和Thr346(粗体)；纤溶酶原激活Arg-Val激活位点(粗体)；和三环域1中的赖氨酸-结合部位(加下划线并且具有特定的位置编号)。
图4显示天然人纤溶酶(原)的五个三环域(1-5)之间的多肽序列比较。与三环域1中相同的相对位置上的氨基酸残基相同的氨基酸残基用下划线表示。
图5显示非还原的(泳道1)和还原的(泳道2)Δ-纤溶酶原制剂的8-25％梯度的SDS-PAGE。通过链激酶(泳道3)，组织纤溶酶原激活物(tPA)(泳道4)，和尿激酶(泳道5)将Δ-纤溶酶原激活成Δ-纤溶酶，导致了由通过两个二硫键连接的三环域1(K1)和丝氨酸蛋白酶结构域(SP)组成的双链分子的形成。
图6是通过尿激酶激活Δ-纤溶酶原的示意图。将尿激酶(5.8nM)添加到温度为37℃的在含有1.0mM S-2251的PBS中的5μMΔ-纤溶酶原溶液中。在405nm波长下监测吸光度的增加。
图7是显示Δ-纤溶酶原与赖氨酸-SEPHAROSE 4B结合的色谱图将0.5mg纯化的Δ-纤溶酶原加样到赖氨酸-SEPHAROSE 4B柱(1×3cm)上，该柱用Tris-缓冲的盐水，pH 7.4平衡。结合的蛋白由0-20mM梯度的ε-氨基己酸(ε-ACA)作为单一的峰从所述柱上洗脱。在280nm处的吸光度和ε-ACA浓度作为洗脱液体积的函数表现在所述曲线图上。
图8显示Δ-纤溶酶原与血纤蛋白的结合。将不同浓度的Δ-纤溶酶原与血纤蛋白凝块一起在微量滴定板中在37℃下温育1小时。在温育之后，用PBS充分洗涤所述凝块，并且向每一个孔中添加0.1mg/mltPA的溶液。在37℃下温育2小时之后，除去液体，并且用1)0μl的1M NaOH重配残留的固体凝块。通过测定这些重配凝块的280nm的吸光度来定量残留血纤蛋白的数量。由Δ-纤溶酶原结合血纤蛋白导致的纤维蛋白溶解的程度在所述曲线图上以Δ-纤溶酶原浓度的函数形式作图(实线)。虚线表示试验数据与结合方程的最佳拟合。
图9显示在非还原的(泳道1)和还原的条件(泳道2)下的起始Δ-纤溶酶原的8-25％梯度的SDS-PAGE，以及同样是在非还原的(泳道3)和还原的(泳道4)条件下的最终的Δ-纤溶酶制剂的8-25％梯度的SDS-PAGE。
图10显示纤溶酶，小-纤溶酶，微-纤溶酶，和Δ-纤溶酶的示意图，以及酶活性的相应表征(针对底物S-2251(D-Val-Leu-Lys-对硝基苯胺(p-nitroanilide)，DiaPharma Group有限公司，West Chester，OH)的kcat和KM)。
图11是Δ-纤溶酶诱导的收缩全血凝块溶解的示意图。向每一个凝块(0.8×7cm)注入1ml体积的载体(酸化盐水，pH 3.6)，纤溶酶(1.0mg/ml)，或Δ-纤溶酶(0.44mg/ml)，并且在37℃下让凝块溶解进行1小时。
本发明的说明为了提供具有全长纤溶酶的血纤蛋白-和抗纤溶酶-结合特性的简单的非糖基化分子，本发明提供了纤溶酶原的缺失突变体。在该突变体(在本文中被称为Δ-纤溶酶原)中，位于与三环域1同源的结构域和激活位点之间的天然氨基酸序列的至少一部分缺失了。一方面，与人纤溶酶原的天然三环域1结构域同源的结构域可以直接连到纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶部分，或它的同源性功能类似物，基本上只有包含纤溶酶原激活位点的间插天然序列保留在这两个结构域之间。
本发明的Δ-纤溶酶(原)可表征为Δ-纤溶酶的较低分子量(37，198Da)可以产生增加的比活性(每毫克蛋白)；缺少天然蛋白中见到的至少两个糖基化位点(参见图3)，结合相对低的分子量，有利于利用相对廉价的细菌和酵母表达系统重组生产这种蛋白；Δ-纤溶酶原可以通过纤溶酶原激活物tPA，尿激酶，和链激酶激活；与天然三环域1同源的结构域的存在，保持了纤溶酶的血纤蛋白-结合特性，这对于溶解血栓的效力来说是重要的；α2-抗纤溶酶-结合部位在与三环域1同源的结构域上的存在使得Δ-纤溶酶能够被纤溶酶的这种生理学抑制剂迅速抑制(一种能够阻止出血的特征)；Δ-纤溶酶的大小较小有利于其被α2-巨球蛋白抑制，相对天然纤溶酶来说进一步减小了出血并发症的机会。在特定实施方案中，三环域5(它保留了对完整的未消化过的血纤蛋白(原)的原始结合部位)的缺乏，使得可以使用Δ-纤溶酶而减少对循环血纤蛋白原的消耗。
一般来说，本发明提供了重组纤溶酶(原)分子，它具有单一的三环域区，位于激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域的N-末端，相对小-纤溶酶(原)来说具有某些优点。尽管本发明的Δ-纤溶酶原多肽只具有一个三环域区，并就这样位于激活位点的N-末端，某些实施方案包括位于所述激活位点的N-末端的额外序列。额外的N-末端序列可来自纤溶酶原的天然三环域区的序列。
本发明的N-末端三环域包括天然纤溶酶(原)的三环域1和4的三环域序列，及其功能性等同物。具体地讲，参见下面的讨论，其中提供了有关保留多肽变体的功能的指南，包括保留参与或影响赖氨酸结合的残基。
定义如在本文中使用的，术语多肽的“结构域”和“区”一般是同义的，除非作出了相反的说明。在与诸如“三环域”或“丝氨酸蛋白酶”等的公认的结构或功能命名一起引用时，所述术语会引入与至少某些特征相关的多肽特征，这些特征被普遍认可并且理解为与对应所述命名的多肽结构相关。
在本文中使用的″培养的宿主细胞″表示包含业已通过任何方法导入细胞的异源DNA的原核或真核细胞，所述方法例如电穿孔，磷酸钙沉淀，显微注射，转化和病毒感染等。
在本文中使用的″异源的″表示″具有不同的天然来源″或表示非天然状态。例如，如果培养的宿主细胞是用来自其他生物，特别是来自其他物种的DNA或基因转化的，所述基因相对于该培养的宿主细胞来说是异源的，并且相对于携带所述基因的培养的宿主细胞的后代来说也是异源的。类似地，“异源的”表示来自并且插入相同的天然原始细胞类型的核苷酸序列，不过它是以非天然状态存在的，例如，不同的拷贝数或处于不同的调控元件的控制下。
″载体″分子是可以插入异源核酸的核酸分子，随后可以将它导入合适的培养的宿主细胞。载体优选具有一个或多个复制起点，以及一个或多个可以插入重组DNA的位点。载体通常具有便利手段，通过它可以从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞，例如，它们编码耐药性基因。常见的载体包括质粒，病毒基因组，和(主要是在酵母和细菌中)″人工染色体″。
在本文中使用的术语″转录控制序列″表示核酸序列，如起始序列，增强子序列和启动子序列，其诱导，抑制，或以其他方式控制可操作地与它连接的蛋白编码核酸序列的转录。
术语″多肽″在本文中可以与术语″肽″和″蛋白″交换使用。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可以交换使用，并且可以表示包含对本文所述目的必要的信息的任何核酸。就是说，所述核酸可以是DNA或RNA，是单链的或双链的，或其他核酸，只要所述多聚物能够体现合适的信息就行，例如就所编码的肽而言，并且可以包括互补序列，例如，核酸聚合体的正义链和反义链。
术语多肽的″变体″表示改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有″保守性″改变，其中，置换的氨基酸具有类似的结构或化学特性，例如，用异亮氨酸置换亮氨酸。另外，变体可以具有″非保守性″变化，例如，用色氨酸置换甘氨酸。类似的次要变化还可以包括氨基酸缺失或插入或这两者。一种具体形式的″变体″多肽是″功能性等同的″多肽，即，表现出与本发明的多肽实例大体上类似的体内或体外活性的多肽，正如下面更详细地披露的。可以使用本领域众所周知的计算机程序寻找决定哪一个氨基酸残基可以被置换，插入或缺失，而又不消除生物学或免疫学活性的指南，例如，DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)。另外，下面提供了具体的指南，包括在被以全文形式收作本文参考的引用的参考文献中提供的指南。
在本文中使用的术语“N-末端”和“C-末端”表示它们所应用的任何氨基酸序列或多肽结构域或结构的相对位置。根据本说明书可以了解相对定位。就是说，“N-末端”特征位于比在相同上下文中讨论的另一特征至少更靠近多肽分子的N-末端(所述另-个特征可能称为处于第一种特征的“C-末端”)。类似地，在本文中术语“5’-”和“3’-”可用于表示多核苷酸中的特征的相对位置。
在这里所指的Δ-纤溶酶原/纤溶酶多肽表示具有“与天然人纤溶酶原的三环域同源”的N-末端结构域，表现出与纤溶酶原的天然三环域类似的结构和功能特征。另外，在本文中所指的Δ-纤溶酶原/纤溶酶多肽具有“与三环域1同源”的N-末端结构域，表现出类似于天然三环域1的特征，至少达到所述多肽对ω-氨基羧酸类(和功能性同系物，如反-4-氨甲基环己烷-1-羧酸，一种环酸)的亲和力比三环域5高的程度。例如，参见Chang，Y.，et al.，Biochemistry 373258-3271(1998)，被收作本文参考，有关用于比较分离的三环域多肽与以下化合物的结合的条件和方案5-氨基戊酸(5-APnA)；6-氨基己酸(6-AHxA)，又被称作ε-氨基己酸(εACA)；7-氨基庚酸(7-AHpA)；和反-4-氨甲基环己烷-1-羧酸(t-AMCHA)。
所提到的“与三环域4同源”的三环域是以与上文所提到的术语“与三环域1同源”类似的方式定义的。就是说，如上文所讨论的，它们表现出与天然人纤溶酶原的三环域1类似的功能特征。这些多肽还如上所述能结合固定化的赖氨酸。
本发明的多肽结合固定化的赖氨酸。在本文中使用的短语“结合固定化的赖氨酸”表示如此表征的多肽与小-纤溶酶原相比，在使用赖氨酸-SEPHAROSE作为层析介质进行柱层析时，其前进延迟。通常，本发明的多肽可以使用含有特异性配体例如εACA的溶液作为洗脱剂从所述层析介质(赖氨酸亲和树脂)中洗脱。
另外，除了上面提到的Chang等的文献之外，本领域技术人员可以查阅其他参考文献，以确定哪些残基可以通过保守性或非-保守性置换，缺失或添加加以改变，以便得到本发明范围内的缺失突变体。例如，以下参考文献提供了有关可能对ω氨基羧酸的结合起着重要作用的天然三环域中的特定残基的信息授予Ji等的美国专利号6,538,103；授予Suzuki的美国专利号6,218,517；Douglas，J.T.，et al.，Biochemistry 41(10)3302-10(2002)；Zajicek，J.，et al.，J.Mol.Biol.，301(2)333-47(2000)；Lee，H.，et al.，Arch BiochemBiophys.，375(2)359-63(2000)；Castellino，F.和S.McCance，Ciba Found Symp.21246-60(1997)；McCance，S.，et al.，J.Biol.Chem.，26932405-32410(1994)；Rejante，M.R.和M.Llinas，Eur.J.Biochem.，221(3)939-49(1994)；Wu，T.P.，et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis，5(2)157-66(1994)；Hoover，C.J.，et al.，Biochemistry，32(41)10936-43(1993)；Menhart，N.，et al.，Biochemistry，328799-8806(1993)；Thewes，T.，et al.，J.Biol.Chem.，265(7)3906-3915(1990)；Novokhatny，V.，et al.，ThrombRes.，53(3)243-52(1989)；Motta，A.，et al.，Biochemistry，26(13)3827-36(1987)；Novokhatny，V.，et al.，J.Mol.Biol.，179215-232(1984)；Lerch，P.G.，et al.，Eur.J.Biochem.，107(1)7-13(1980)；Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3191-209(1978)；和Wiman，B.和D.Collen，Nature 272，549-545(1978)，所有文献都以全文形式收作本文参考。
由于本发明人业已认识到可以制备有价值的简化的纤溶酶(原)分子，它具有N-末端三环域，具有有利的功能性特征(可以通过检测本文所述的对固定化的赖氨酸的结合而部分地进行评价)，本发明可以包括位于激活位点N-末端的其他血纤蛋白-结合结构域或区。例如，本发明可以包括这样的多肽，其中，纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域连到选自下列一组的血纤蛋白-结合三环域包括但不局限于人纤溶酶原的三环域4，tPA的三环域2，或载脂蛋白(a)的三环域。另外，本发明可以包括这样的多肽，其中，纤溶酶的丝氨酸蛋白酶结构域连接到任何其他已知的血纤蛋白-结合分子上，例如，tPA或纤连蛋白的“指状”结构域，或血纤蛋白-特异性IgG的FAB片段。
在特定实施方案中，位于Δ-纤溶酶原的N-末端三环域的某些位置上的残基相对天然人纤溶酶原的三环域1来说是保守的。这些可以是处在与赖氨酸结合相关的位置上的残基，并且包括Pro136-Pro140，Pro143-Tyr146，以及Arg153-Tyr156(位置编号如图3所示)。本发明的Δ-纤溶酶原的某些实施方案在153位上可以具有Arg。在其他实施方案中，所述残基的具体位置可以略有改变，而仍然出现在所述多肽的结构和功能类似的位置上(即相对N-末端结构域的三环域结构；参见Chang，Y.，et al.正如上文所讨论的)。在某些实施方案中，Δ-纤溶酶(原)多肽的N-末端三环域区与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4的百分同一性，比与天然人纤溶酶原的三环域5的百分同一性大至少一个残基。
另外，本发明的具体实施方案可以通过与具有类似结构域组成(即，三环域-丝氨酸蛋白酶(K-SP))的小-纤溶酶(原)相比进行功能性表征(参见Sottrup-Jensen，L.，et al.，Progress in ChemicalFibrinolysis and Thrombolysis，Vol.3，(EdsJ.F.Davidson，et al.)Raven Press，New York(1978))。在优选实施方案中，本发明的Δ-纤溶酶表现出被α2-抗纤溶酶抑制的速度增加，例如，比对小-纤溶酶的抑制速度快大约一或两个数量级那么多。另外，在特定实施方案中，Δ-纤溶酶能结合固定化的赖氨酸(例如，赖氨酸-SEPHAROSE)。
Δ-纤溶酶原的三环域被表征为“N-末端”仅表示该结构域存在于激活位点的N-末端，而不表示不存在位于所述结构域本身的N-末端的额外氨基酸残基。另外，介于与三环域1同源的结构域和纤溶酶原的激活位点之间的残基的数量和身份可以改变，而又不超出本发明的范围。本领域技术人员能够确定能获得本发明的优点(ω氨基羧酸的三环域1-样结合，而又不会显著增加缺失突变体的大小或导入潜在有问题的糖基化位点)的这些变体，在本文公开内容和本文引用的文献有关三环域1功能和结构的指南的基础上无需进行过多实验。
因此，本发明涉及多核苷酸，多肽，生产所述多肽的重组方法，包含所述多核苷酸的载体，用于生产所述多肽的表达系统，以及包含所述表达系统的培养的宿主细胞。
正如所指出的，一方面本发明涉及编码本文所披露的多肽或具有其保守性氨基酸置换的多肽的多核苷酸。下面将更详细地提供有关选择“保守性”氨基酸置换的指南。在一种实施方案中，所述多核苷酸是DNA。
另一方面，本发明涉及制备载体的方法，包括将本发明的多核苷酸插入载体。另一方面，本发明涉及通过本发明方法生产的载体。
另一方面，本发明涉及制备培养的宿主细胞的方法，包括将本发明的载体导入培养的宿主细胞。另一方面，本发明涉及通过本发明方法生产的培养的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及通过包括以下步骤的方法生产的本发明的分离的多肽(a)将包含编码所述多肽的多核苷酸的载体导入培养的宿主细胞；(b)培养所述宿主细胞；和(c)回收所述多肽。另一方面，本发明涉及用于生产多肽的方法，包括(a)在表达所述载体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收多肽。
另一方面，本发明涉及包含至少一种本发明的多核苷酸的细胞。
在一种实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1所示出的核苷酸序列。在另一种实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO2所示出的氨基酸序列。
多核苷酸本发明的多核苷酸包括具有可能涉及一个或多个核苷酸的置换，缺失和/或添加的变体。所述变体可以在编码区，非编码区，或这两个区改变。编码区的改变可以产生保守性或非保守性氨基酸置换，缺失或添加。其中特别优选的是沉默置换，添加和缺失，这种变化不会改变Δ-纤溶酶(原)蛋白或其部分的特性和活性。在这一方面同样特别优选的是保守性置换(参见下文)。
本发明的其他实施方案包括核酸分子，包含具有与以下序列至少90％，更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸(a)编码具有SEQ ID NO2所示出的完整氨基酸序列的Δ-纤溶酶原多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO2所示出的氨基酸序列的Δ-纤溶酶原多肽的核苷酸序列；和(c)与上面的(a)或(b)中的任意核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在说到多核苷酸的核苷酸序列与编码Δ-纤溶酶原多肽的参考核苷酸序列至少例如95％“相同”时，表示所述多核苷酸的核苷酸序列与所述参考序列相同，所不同的是，所述多核苷酸序列在编码Δ-纤溶酶原多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括多至5个点突变。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多至5％的核苷酸可以缺失或用其他核苷酸置换，或可以将数目高至参考序列总核苷酸5％的核苷酸插入所述参考序列。所述参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或位于两个末端位置之间的任何位置，单独分散在参考序列的核苷酸之中或者在参考序列内的一个或多个连续的组中。
正如上文所指出的，可以通过确定它们的百分同一性比较两个或多个多核苷酸序列。同样可以通过确定它们的百分同一性比较两个或多个氨基酸序列。无论是核酸或肽序列，两个序列的百分同一性一般被描述为两个比对序列之间的完全匹配的数目除以较短序列的长度并且乘以100。核酸序列的近似比对是通过Smith和Waterman的局部同源性算法提供的，见Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)。该算法可以扩展到用于肽序列，采用由Dayhoff开发的评分矩阵，见Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3353-358，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.，USA，并且由Gribskov统一化，见Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)。这种算法对于核酸和肽序列的一种实施是由Genetics Computer Group(Madison，Wis.)在他们的BESTFIT应用程序中提供的。该方法的预设参数披露于以下文献中Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，Version 8(1995)(可以从Genetics Computer Group，Madison，Wis.获得)。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员很容易意识到与SEQ ID NO1所示出的核酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的大量的核酸分子都能够编码Δ-纤溶酶原多肽。实际上，由于所述核苷酸序列的简并变体都编码相同的多肽，这对本领域技术人员来说是显而易见的，甚至不需要进行本文所披露的任何功能分析或测定。本领域还可以理解的是，对于不是简并变体的这类核酸分子来说，也会有合理数量的核酸分子编码具有Δ-纤溶酶原多肽活性的多肽。这是因为技术人员完全了解不太可能或不可能显著影响蛋白功能的氨基酸置换(例如，将一种脂肪族氨基酸置换为另一种脂肪族氨基酸)。
最近，在较长的多核苷酸序列的合成生产方面的进展业已能够合成生产编码显著更长的多肽的核酸，而不使用传统克隆技术。这些服务的商业提供者包括Blue Heron有限公司，Bothell，WA(http//www.blueheronbio.com)。由Blue Heron有限公司所采用的技术披露于美国专利6,664,112；6,623,928；6,613,508；6,444,422；6,312,893；4,652,639；美国公开专利申请号20020119456A1；20020077471A1；和公开的国际专利申请(
发明者J·A·亨特, V·诺沃哈特尼 申请人:泰勒克里斯生物治疗学公司