专利名称：通过fad依赖性单加氧酶直接电化学再生的酶促氧合方法
背景技术：
未反应烃的选择性氧化作用仍代表着合成有机化学的最具挑战性前沿之一。尤其需要处理的是反应物活化和反应选择性之间的精密平衡。“经典的”化学氧供体如过氧化物、次氯酸盐、亚碘酰苯或二环氧乙烷[1]缺乏氧化更复杂的底物所需要的选择性。
另外，最具催化能力的化学方法尚未得到充分的发展，因此催化剂的转换数和频率以及立体辨别能力偏低[2，3]。另一方面，自然界已发展出恰好符合前述标准的通用催化工具。
单加氧酶通常以完全的区域选择性和立体选择性方式催化高度多样化的氧化反应，其催化剂性能达到每分钟数百个转换数[4]。活性氧化类别从单加氧酶活性位点的分子氧原位产生，从而使不良副反应最小化。因此，单加氧酶是用于合成有机化学的有前途的催化剂[5-8]。然而，单加氧酶是辅因子依赖性酶，其需要提供还原当量用于O2活化。通常，那些还原当量源自昂贵且不稳定的烟酰胺辅因子(NAD(P)H)[9-11]。而且，单加氧酶经常由复杂的多酶体系组成，该多酶体系完成从NAD(P)H到末端加氧酶的电子转移。由于其复杂的分子结构和NAD(P)H依赖性，单加氧酶的制备性应用，除少数例外[8，12-16]，一直以来在很大程度上限制于使用代谢活性微生物的完整细胞方法[5，8，17-19]。
考虑到模仿天然单加氧酶循环的复杂性，直接向氧合循环中引入还原力可以大幅度简化生物催化的氧化反应。由于所使用的还原力是可控制的并且负极用作电子的免试剂源，所以电化学还原法成为选择方法之一。在这方面，血红素依赖性单加氧酶类目前已成为优选的研究对象。在单加氧酶的血红素-铁中心和负极之间的电传递是通过直接接触[20，21]和经由介导电子转移的人工[22]或生物氧化还原传递[23-25]而建立。
与对P450单加氧酶的多种研究活动相反，令人惊奇的是，用于黄素依赖性单加氧酶类的相似方法尚没有报道，因为该酶类催化合成性氧化反应如羟基化[12，26，27]、Baeyer-Villiger氧化[28，29]、和环氧化作用[30]。
来自假单胞菌(Pseudomonas sp.)VLB120的苯乙烯单加氧酶(StyAB)催化广范围苯乙烯衍生物的特异性(S)-环氧化作用[31，32]。该酶由催化环氧化反应的FAD依赖性单加氧酶组分(StyA)和递送还原当量从NADH经FADH2到StyA的NADH依赖性还原酶组分(StyB)组成[33]。
先前我们已经证明，由于StyB可以被化学还原剂置换而不损害反应的立体化学过程或反应速率，所以StyB不直接参与环氧化反应[34]。通过使用作为转移氢化催化剂的有机金属络合物[Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+连同作为还原当量的化学计量性来源的甲酸盐实现FADH2的原位再生。
发明描述以下发明涉及由FAD依赖性单加氧酶催化的从离析物E到产物P的酶促氧合方法，其特征在于FAD依赖性单加氧酶是由直接的电化学还原再生。
离析物E的化学特性可以是广泛多样的，只要单加氧酶，特别是FAD依赖性单加氧酶能够接受离析物E作为氧合底物即可。优选的离析物E是化合物取代的苯乙烯和苯乙烯衍生物，特别优选的是表1中提到的底物。
根据本发明的单加氧酶优选来自假单胞菌的苯乙烯单加氧酶(StyAB)[31，32]。其它的优选酶列于图9。
电酶促环氧化作用的最初实验是使用反式-β-甲基苯乙烯作为底物进行的。使用相对Ag/AgClsat的-550mV负极电势以恒电势电解。当反应介质中缺少StyA或FAD时，没有检测到产物形成。另一方面，在全部反应组分存在下电解形成了可水解的、更具极性的产物，经确认该产物实际上是对映体纯(1S，2S)-1-苯基丙烯氧化物[36]。同样地，广泛多样的不同取代的芳乙烯化合物可以被转化成为超过98％光学纯的对应的(S)环氧化物(表1)。
表1取代苯乙烯衍生物的电酶促环氧化作用 一般条件10mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.5)，T＝30℃，c(StyA)＝2.13μM，c(FAD)＝300μM，c(触酶)＝480UmL-1，c(反式-β-甲基苯乙烯)＝2mM，负极14cm2。T＝25℃，15分钟后测定活性。
然而，尽管电酶促氧合反应的立体辨别符合用完整细胞[31，32]和无细胞反应[34，35]所得到的数值，但是环氧化作用速率相对较差。在起始速率的研究中，已测定出高达2.1Umg-1的特异性StyA活性[33]。因此，表1中所述速率仅组成部分的(少于2％)StyA催化电势。为了确定存在的电酶促环氧化反应限速因子，我们还考察了不同反应参数对电酶促环氧化反应速率的影响。
如
图10所示，电酶促环氧化反应的速率与所使用的生物催化剂浓度相关。观察到不依赖生物催化剂浓度的特异性StyA活性为35.5+2.1 U g-1。该特异性活性是温度依赖性的，在其它条件相同时，随着反应温度从例如25℃增加至37℃环氧化作用活性增加2.5倍[36]。因此，乍一看，StyA似乎是电酶促反应中的限速因素。然而，与最大值相比StyA的催化性能较差，这表明仍有其它因素严重限制着电酶促环氧化反应速率。
将相对Ag/AgClsat的负极电势从-550降低至-650mV并不显著影响反应进程[36]，表明从负极到FAD的电子转移并非FADH2再生的限速因素。然而，作为非均相反应，FADH2的再生可以通过向负极表面的传质来限制。实际上，我们观察到，高达至少500μM的增加的FAD浓度导致产生增加的环氧化作用速率[36]。这些结果与先前结果相悖，在先前的结果中，使用FADH2的均相再生观察到10和20μM之间的限定的最佳FAD浓度[33，34]。关于该点，FADH2的自催化氧化作用[37]解释了FAD浓度高于20μM时环氧化作用速率的下降。在这种情况下，由于负极表面FAD的可用性增加，增加的FADH2生成速率可以使该作用失效。倘若后者的假设正确并且负极FADH2再生受到扩散限制的影响，负极表面也应影响再生速率。因此，研究了负极表面相与反应体积比率的影响。如图11所示，特异性StyA活性(此处描述为转换频率[每分钟的催化循环])与负极面积和反应体积的比率直接相关。
总之，这些观察表明，在电酶促环氧化反应中的StyA活性受限于环氧化反应的FADH2的可用性。由于还原的黄素在分子氧存在下并不稳定[37]，我们研究了通气对电酶促环氧化反应速率的影响(图12)。
有趣的是，我们发现增加通气速率急剧加速环氧化物形成速率。没有活跃的空气通入时，在反应中测定的特异性StyA活性在30Ug-1范围(图12)。另外，仅总体形成约50μM的环氧化物，说明超过80％的溶解氧被酶促环氧化作用之外的反应消耗。另一方面，高通气率增加特异性StyA活性高达215Ug-1，相当于最大StyA活性的约10％。这是令人感兴趣的，因为关于P450单加氧酶的直接还原再生的研究从总体限制性的酶促氧合反应鉴定了电化学再生反应的氧化解偶联[22，24，38]。例如，Vilker和合作者发现，如果在应用负极电势和在正极原位再生氧之前用氩清除电解缓冲液，则P450cam驱动的樟脑羟基化急剧增加。考虑到如体系1所列出的FADH2氧化作用机制[37]可以解释这一明显的矛盾。
体系1FADH2的非StyA相关氧化作用的主要机制[37]。k1＝1×106M-1s-1；k1＝5×108M-1s-1；k2＝8×107M-1s-1因此，由可逆的同比例形成的半醌自由基阴离子限制还原黄素的非酶支持氧化的总体速率。因此，在我们的实验中c(O2)不影响FADH2的非酶支持再次氧化的速率。另一方面，分子氧直接参与形成有催化活性的4α-过氧黄素。假设这是StyA催化的环氧化反应的总限速步骤，这将足以解释环氧化作用速率对通气速率的依赖。后者的假定得到使用FAD依赖性对羟基苯乙酸酯-3-羟化酶的类似结果支持，其中发现4α-过氧黄素的形成是限速的和O2依赖性的[39]。未来实验将更加仔细地检查O2原位浓度对电酶促反应的影响。
迄今为止，新的电酶促环氧化反应制备性应用的一个特殊挑战是其相对低的长期稳定性。通常，反应在1-1.5小时后终止。从目前获得的结果可以得出一些定性结论。首先，可以检测到总体反应时间与所应用的总蛋白质含量相关(比较图10)，其次，反应时间随着通气率下降(图12)。两个观察到的现象都指向该反应条件下生物催化剂的低稳定性。该StyA的低稳定性可以部分归因于StyA暴露于局部高浓度的部分还原的氧(源自O2的负极还原)引起的负极表面对StyA的吸附[40]。另外，O2的非均相摄取导致在液-气界面产生剪切力和表面张力使生物催化剂的三维结构不稳定。先前研究表明了额外“牺牲”蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)[35]的有益影响，StyA的非均相化，如通过固定到Eupergit C也是可行的。以在多种条件下增加生物催化剂稳定性为目的的进一步研究正在进行。
总之，我们的研究首次证明了黄素依赖性单加氧酶的直接电化学再生。仅由电能驱动，由相应的芳乙烯化合物合成光学纯的环氧化物。因此，由3个多肽(StyA、StyB和NADH再生酶)和2个辅因子(NADH和FAD)组成的相当复杂的天然电子传递链可以被消减至最简生物催化环氧化反应所决定必须的成分。目前，已表明电酶促方法对于简化这类复杂酶系统是有效的，其可以延伸至其它酶促氧合反应[41]，使得仅使用电化学槽中的所分离单加氧酶和FAD可进行合成性反应，如氧化脱硫作用[42]、芳香环的特异性羟基化[43-45]、对映体选择性Baeyer-Villiger反应[46]以及甚至选择性的卤化反应[47]。
实验部分具有可获得的最高纯度的化学药品购自Fluka(Buchs，瑞士)并且在使用前不再纯化。
如前所述，StyA自重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)JM101富集[35]。冻干生物催化剂的纯度约为70％(如通过SDS凝胶电泳所测定)。
电解在恒温搅拌反应器中进行。使用圆柱形的碳毡作为负极(工作电极)并调节相对于饱和Ag/AgClsat参比电极的电势。工作电极的大小在指定的宏观范围内(对应于27.1±2.1mgcm-2的平均值)。选择隔开的或未隔开的电解槽。对于隔开的电解槽，Pt丝对电极被置于透析膜上；或者另外使用Pt箔(直径1cm)。在反应器中补入所指示反应组分之后，使用相对Ag/AgClsat的-550mV负极电势。对于隔开的电解槽，由非均相空气通入提供O2(使用Hewlett Packard皂膜式流量计估计通气速率)；在未隔开的电解槽的情况下，O2在对电极产生。
如通过使用先前报道方案的HPLC所测定，基于产物形成测定反应速率(及其计算的酶性能)[34，35]。
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权利要求
1.由FAD依赖性单加氧酶催化的从离析物E到产物P的酶促氧合方法，其特征在于通过直接的电化学还原再生FAD依赖性单加氧酶。
2.根据权利要求1的方法，其中氧合反应是环氧化作用。
3.根据权利要求1的方法，其中氧合反应是氧化脱硫作用。
4.根据权利要求1的方法，其中氧合反应是对映体选择性Baeyer-Villiger反应。
5.根据权利要求1的方法，其中氧合反应是芳香族分子的羟基化。
6.根据权利要求1的方法，其中FAD依赖性单加氧酶是4-羟基苯乙酸酯-单加氧酶。
7.根据权利要求1的方法，其中FAD依赖性单加氧酶是吡咯-2-羧酸酯-单加氧酶。
8.根据权利要求1的方法，其中FAD依赖性单加氧酶是氯苯酚-4-羟化酶。
9.根据权利要求1的方法，其中离析物E是取代的或未取代的苯乙烯。
10.根据权利要求1的方法，其中FAD依赖性单加氧酶是来自假单胞菌的苯乙烯单加氧酶(Sty AB)。
全文摘要
由FAD依赖性单加氧酶催化的酶促氧合和直接电化学再生FAD依赖性单加氧酶的方法。
文档编号C12P7/00GK1954077SQ200580015356
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月11日 优先权日2004年5月13日
发明者A·施米德, F·霍尔曼, K·霍夫施泰特尔, T·哈比歇尔, B·豪尔 申请人:巴斯福股份公司