专利名称：检测志贺氏菌的酶免疫传感器及其制备方法和运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食源性致病菌快速检测技术领域，特别是基于抗原抗体免疫反 应检测志贺氏菌的酶免疫传感器及其制备方法和运用。
背景技术：
在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于食用了各种致病 性微生物污染的食品和饮水造成的。志贺氏菌(Shigdla)是引起急性感染性腹湾 的主要病原体之一，少至IO个细菌即可引起感染，感染人体会出现恶心、呕吐、 腹痛、腹泻(严重脓血便)等症状，甚至危及生命。每年有一百多万人因为感染志 贺氏菌而死亡，死者多为发展中国家的儿童。
志贺氏菌快速检测是进行大批量健康人群的体检和处理突发公共卫生事件 的最关键措施之一，对快速实施预防、治疗具有极为重大的意义。
目前，志贺氏菌常用检测方法包括国标法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、 PCR 及RT-PCR技术，基因芯片和核酸探针技术。国标法取材方便，但样品预处理复 杂、操作过程比较繁琐，检测周期较长，敏感度低；ELISA需要特殊的仪器设备， 检测步骤繁琐、费用高、检测时间长，并且易出现假阳性；PCR、基因芯片和核 酸探针技术所需仪器设备昂贵、检测过程复杂，对检测环境和操作人员专业技 术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害，也易出现假阳性。 因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的志贺氏菌检测方法是食 品生产经营企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门的迫切需要和食品安 全的有力保障。
电化学分析可以实现现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不 经处理，无需分离，所用仪器设备相对简单，这些都使得电化学免疫传感成为一种使用较为广泛的检测方法。近年来，在食源性致病菌检测领域中，免疫传 感器越来越引起人们的重视。它将电化学检测和传统免疫技术相结合的分析方 法，既有很好的特异性，又有较低的检测限。而且与其他技术相比，这种传感 器对仪器设备的要求低，操作简单，更大大地縮短了检测时间。采用丝网印刷 工艺制备的一次性使用电极更进一步降低了检测成本，在大规模地快速、准确 检测食源性致病菌中发挥着重要作用。
自从1991年Iijima发现多壁碳纳米管(multi-wall carbon nanotube)以来，多 壁碳纳米管因其优良的电学、力学性能以及潜在的应用前景而引起广泛关注。 多壁碳纳米管复合材料具有良好的导电性能和有利于保持生物分子活性，非常 适合于生物传感器的制备与应用。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种灵敏、快速、准确、特异性高且经 济的检测志贺氏菌的酶免疫传感器，包括丝网印刷电极，所述丝网印刷电极的 工作电极上涂布有包埋"酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖"混合物的敏感
优选地，所述的碳纳米管为多壁碳纳米管。 进一步地，所述的志贺氏菌为福氏志贺氏菌。
更进一步地，所述的酶标记志贺氏菌抗体为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、尿素水解酶标记的志贺氏菌抗体 中的一种或它们的混合物。
另一方面，本发明提供了上述酶免疫传感器的制备方法，其特征是包括以 下步骤1) 将碳纳米管超声分散在壳聚糖溶胶中，得均一的碳纳米管-壳聚糖复合 物；
2) 将酶标记志贺氏菌抗体与碳纳米管-壳聚糖复合物充分混合均匀，4 °C 放置12 h,制得"酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖"混合物；
3) 将"酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖"混合物涂布在丝网印刷电 极的工作电极表面，室温下干燥；
4) 涂膜后的电极浸泡于含0.2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，4 °C 下放置1 h。
本发明还提供了一种使用上述酶免疫传感器检测志贺氏菌的方法，其特征 是包括以下步骤
1) 待测样本滴于酶免疫传感器的工作电极表面，28 °C孵育30 inin;
2) 免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.6 mmol/L H202 和1.0 mmol/L硫堇的醋酸盐缓冲液，pH值为7.0;
3) 设定适宜的扫描参数，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电 极间的电流值；
4) 测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；
5) 信息处理结果输出。
优选地，数据采集与处理系统采用循环伏安法作为免疫电极表征、定性判 定和定量检测的方法。
本发明的免疫传感器，包埋酶标记志贺氏菌抗体和碳纳米管的膜材料除壳 聚糖外，还可以使用聚四氟乙烯、N，N-二甲基甲酰胺、Nafion、聚乙烯、琼脂糖检测样本可以是腹泻病人的粪便、肛门拭子、呕吐物及污染了的土壤、水 源、食物、餐具等样本，采样必须在无菌操作下进行，所采集的样品必须具有
代表性。冷冻样品应保持冷冻状态，非冷冻样品需在0 5。C保存。如不能及时 送检，应将样本保存于30%甘油缓冲盐水中。.
本发明中检测方法原理在电化学反应体系中，酶催化底物H202生成相应
的酶促反应物H20，酶由还原态变为氧化态；此时氧化态的酶催化电子媒介体 硫堇由还原态变为氧化态，而酶自身则由氧化态变为还原态；氧化态的电子媒 介体在电极表面得到电子后又变为还原态，同时产生响应电流。
采用常用的循环伏安法(Cyclic voltammetry， CVO作为免疫传感器表征、定 性判定和定量检测的方法。当被检测物中含有志贺氏菌时，细菌抗原与包埋在 工作电极上的酶标记志贺氏菌抗体发生反应，生成抗原抗体复合物；当免疫传 感器置于电解池中时，抗原抗体复合物在空间上阻碍了硫堇向多壁碳纳米管和 辣根过氧化物酶活性中心靠近，使得媒介体和底物难以靠近多壁碳纳米管和辣 根过氧化物酶，极大地阻碍了电子传递，导致硫堇的氧化还原反应减弱，使响 应曲线中还原峰电流较免疫反应前显著降低，根据响应曲线峰值的变化量即可 判断待测物中是否含有志贺氏菌和所含有的志贺氏菌浓度。
如图1所示，为本发明装置的免疫传感器在不同阶段的电流响应曲线图。将 同一传感器在不同阶段置于电解池检测底液中(0.6 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L 硫堇+0.111101丄？117.0醋酸缓冲溶液)检测响应电流，比较同一免疫传感器在 不同阶段产生的响应电流变化。
其中曲线a为裸丝网印刷电极在检测底液中的电流响应曲线。裸丝网印刷 电极出现的是一对稳定的硫堇氧化还原峰。
曲线b为碳纳米管-壳聚糖膜修饰电极在检测底液中的电流响应曲线。其氧化还原峰信号显著增强，是由于多壁碳纳米管能增大电子转移速度和有效地传 递电子所致。
曲线C为酶标记抗体-碳纳米管-壳聚糖复合物修饰的免疫传感器在检测底液 中的电流响应曲线，曲线中的氧化还原峰信号进一步增大。
曲线d为免疫传感器与检测样本孵育后在检测底液中的电流响应曲线。可 以看出，氧化还原峰电流明显减小，表明抗原-抗体免疫反应生成的免疫复合物 在空间上阻碍了硫堇向碳纳米管和酶的活性中心靠近，极大地阻碍了电子传递， 导致硫堇的氧化还原反应减弱，从而使得还原峰电流显著降低。
以AI-Ipl-Ip2 (即免疫反应前后催化电流的减小值)作为判断样品中是否 含有福氏志贺氏菌的依据。当K》0.3 pA时为阳性，表示被测样本中含有志贺 氏菌；当K〈0.3pA时为阴性，表示被测样本中不含志贺氏菌。
本发明的检测志贺氏菌的酶免疫传感器将免疫技术与电化学检测相结合， 是一种电流型酶免疫传感器。它将多壁碳纳米管和酶的化学放大功能与免疫传 感器的特异性相结合，融合二者的优点，使其同时具备免疫反应的特异性和电 化学分析的灵敏性，能准确地进行低含量物质的检测。本发明的检测志贺氏菌 的酶免疫传感器为一次性使用，容易制备且测试操作简单方便、价格低廉、特 异性强、灵敏度高、响应时间短。
本发明的制备上述酶免疫传感器的方法，采用多壁碳纳米管-壳聚糖基质直 接将酶标记抗体固定在丝网印刷电极的工作电极表面，极大地简化了免疫传感 器的制备步骤，对福氏志贺氏菌的检测具有特异性，且检测的选择性好、灵敏 度高、准确性较好。
本发明检测志贺氏菌的方法，操作简单，可定性判定和定量检测细菌浓度 的一次性酶免疫传感器，可实现对志贺氏菌的直接检测，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低廉，适用于基层或现场检测志贺氏菌。
本发明适用于在医疗诊断、食品工业和环境保护领域快速检测志贺氏菌。 为进一步说明本发明的特点和效果，以下结合附图对本发明作进一步描述。
图1是本发明装置的传感器在不同阶段于电解池检测底液中的电流响应曲
线；
图2福氏志贺氏菌标准电流-浓度曲线。
具体实施例方式
实施例l:制备酶免疫传感器
将2.0 mg多壁碳纳米管超声分散在10 mL质量体积百分数为1%的壳聚糖 溶胶中，得到均一的多壁碳纳米管-壳聚糖复合物-,
将多壁碳纳米管-壳聚糖复合物与标记辣根过氧化物酶的抗福氏志贺氏菌抗 体溶液等体积充分混合；混合液4 °C放置12 h;
取3 pL上述混合液滴涂于一次性丝网印刷电极的工作电极表面，并于室温 下放置3 5h，使之干燥成膜；
将涂膜后的免疫电极浸泡于含0.2% BSA (牛血清白蛋白)的PBS磷酸盐缓 冲溶液中，4。C下放置lh，用二次蒸馏水冲洗干净，除去与电极非牢固结合的 壳聚糖抗体膜及封闭非特异性吸附位点，制得的酶免疫传感器。
酶免疫传感器浸于PBS溶液(0.01 mol/LpH7.4)中在4t:下保存备用。
实施例2:检测志贺氏菌的方法
将实施例1中所述的酶免疫传感器通过导线与电化学工作站(CHI 1030A)相连，计算机与电化学工作站相连。
把酶免疫传感器放入电解池，电解池的检测底液为含有0.6 mmol/L 11202和 1.0mmol/L硫堇的醋酸盐缓冲液，pH值为7.0。设定电化学工作站的CV测定 参数电位扫描范围-0.1 -0.6 V,扫描速率为O.l V/s，对酶免疫传感器的工作 电极施加电压，测得辅助电极与工作电极间的电流值Ipl为1.946 mA。
以无菌操作取呕吐、腹泻病人的肛门拭子经富集培养、分离培养后，于8000 r/min离心5min，取下层菌泥，用pH 7.4的PBS稀释成待测样本。将待测样本 滴于免疫传感器的工作电极表面，28 °C下孵育30min，使样本中的细菌与免疫 传感器工作电极表面的抗体产生免疫反应。把免疫传感器放入电解池。设定电 化学工作站的扫描速率为0.1 V/s，对工作电极施加电压，检测辅助电极和工作 电极间的电流值Ip2为1.051 (iA。
将上述测定获得的电流信息输入电化学工作站的数据采集与处理系统；采 用常用的循环伏安法作为免疫传感器表征、定性判定和定量检测的方法；最后 计算机输出处理信息结果，厶1=1.946 1.051 nA =0.895 nA>0.3 nA，表明被
测样本中含有福氏志贺氏菌。 实施例3
采用实施例1中所述的免疫传感器和实施例2中志贺氏菌的检测方法，对 不同浓度志贺氏菌进行测定，制作标准电流-浓度曲线，具体是用福氏志贺氏菌 标准样配制101Q cfti/mL的PBS溶液，并逐级稀释到104 cfli/mL。制作出标准曲 线，如图2所示。其检测下限104cfU/mL;线性区间104cfii/mL 10"cfli/mL; 线性相关系数t R2=99.54%。以无菌操作取呕吐、腹泻病人的肛门拭子，样品处理及检测方法同实施例2，
最后得AI-0.9312pA，对照标准电流-浓度曲线，计算出被测样本中含有的福氏 志贺氏菌浓度为3 X 107 cfU/mLa
权利要求
1. 检测志贺氏菌的酶免疫传感器，其特征是包括丝网印刷电极，所述丝网印刷电极的工作电极上涂布有包埋“酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖”混合物的敏感膜。
2. 如权利要求l所述检测志贺氏菌的酶免疫传感器，其特征是所述的碳纳米 管为多壁碳纳米管。
3. 如权利要求2所述检测志贺氏菌的酶免疫传感器，其特征是所述的志贺氏 菌为福氏志贺氏菌。
4. 如权利要求3所述检测志贺氏菌的酶免疫传感器，其特征在于所述的酶标 记志贺氏菌抗体为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、 青霉素酰化酶、尿素水解酶标记的志贺氏菌抗体中的一种或它们的混合物。
5. 制备权利要求1所述酶免疫传感器的方法，其特征是包括以下步骤1) 将碳纳米管超声分散在壳聚糖溶胶中，得均一的碳纳米管-壳聚糖复合 物；2) 将酶标记志贺氏菌抗体与碳纳米管-壳聚糖复合物充分混合均匀，4 QC 放置12 h，制得"酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖"混合物；3) 将"酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖"混合物涂布在丝网印刷电 极的工作电极表面，室温下干燥成膜；4) 涂膜后的电极浸泡于含0.2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，4 °C 下放置1 h。
6. 检测志贺氏菌的方法，其特征是包括以下步骤1)待测样本滴于如权利要求1所述酶免疫传感器的工作电极表面，28 °C 孵育30 min;2) 免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.6 mmol/L H202 和1.0 mmol/L硫堇的醋酸盐缓冲液，pH值为7.0;3) 设定适宜的扫描参数，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电 极间的电流值；4) 测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；5) 信息处理结果输出。
7.如权利要求6所述的检测志贺氏菌的方法，其特征在于数据采集与处理系 统采用循环伏安法作为免疫电极表征、定性判定和定量检测的方法。
全文摘要
本发明公开了一种灵敏、快速、准确、特异性高且经济的检测志贺氏菌的酶免疫传感器，包括丝网印刷电极，所述丝网印刷电极的工作电极上涂布有包埋“酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚糖”混合物的敏感膜。它将多壁碳纳米管和酶的化学放大功能与免疫传感器的特异性相结合，融合二者的优点，使其同时具备免疫反应的特异性和电化学分析的灵敏性，能准确地进行低含量物质的检测。本发明还公开了该酶免疫传感器的制备方法以及运用，可实现对志贺氏菌的直接检测，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低廉，适用于基层或现场检测志贺氏菌。
文档编号G01N27/333GK101532980SQ20091009757
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月16日 优先权日2009年4月16日
发明者詹学佳, 赵广英 申请人:浙江工商大学