专利名称：用于残留农药检测的酶电极的制作方法
技术领域：
本实用新型的技术方案涉及通过测试电化学变量分析材料的生物化学电极，具体说是一种用于残留农药检测的酶电极。
背景技术：
农药残留对全球生态平衡和食品安全的威胁越来越受到人们的关注。农作物上残留的有机磷类农药会导致食用者中毒，其毒性作用已有报道。食用者如果超量食用农作物上残留的农药会发生急性中毒，长期食用则会形成慢性中毒，直至致癌、致畸。
强有力的检测手段是有效控制残留农药危害人体的基础。目前，残留农药检测方法主要是色谱法，这类方法灵敏、特异，但所用仪器昂贵，分析费时且成本高，限制了该方法在大规模的残留农药监测和现场实时检测中的应用。基于生物学原理的一些检测技术，如免疫分析法、生物传感器等，具有高效、快速、低成本的特点，它们在残留农药监测中使用的开发一直受到人们的关注。尤其是生物传感器，它是近几十年内发展起来的一种新的传感器技术，已经在临床诊断、工业控制、食品和药物分析、生物药物开发、环境分析、军事领域、生物技术和生物芯片诸多方面得到广泛的应用。将生物传感器用于残留农药检测的研究工作，也已有一些报道。李发生.应用胆碱酯酶生物传感器分析测定有机磷及重金属等潜在环境污染物.环境科学研究.1994，(4)一文介绍采用硝化纤维素为载体的固定化丁酰胆碱酯酶膜与银基汞膜电极耦合制得安培胆碱酯酶生物传感器。以该传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极组成双电极系统，用示波极谱仪接收电流信号，分析测定了有机磷(包括农用杀虫剂)和重金属等两类酶抑制剂，在较宽的浓度范围内示波峰电流值与抑制剂浓度的对数值之间具有良好的线性关系，最低检出下限可达到2.0×10-6mg/L。魏福祥等.胆碱酯酶生物传感器测定有机磷农药敌敌畏.河北科技大学学报.2003(4)一文报道以固定化乙酰胆碱酯酶作敏感物质、银基汞膜电极作基础电极，制备了安培型生物传感器。采用单扫描伏安法考察了传感器对有机磷农药敌敌畏的响应特性。以乙酰硫代胆碱作底物，在0.05mol/L pH＝7.0的硼砂缓冲溶液中，底物水解产物硫代胆碱在-0.33V处有灵敏的还原峰。在1.0×10-8～1.0×10-6mol/L浓度范围内对敌敌畏进行了测定，校准曲线呈现良好的线性关系，r＝0.9988。抑制率为5％时，对敌敌畏的检出限为2.8×10-10mol/L。Mulchandani等结合流动注射技术研制的流动注射安培型有机磷水解酶生物传感器(FIAB)，通过检测有机磷的水解产物对硝基苯酚，来判断有机磷的浓度。该FIAB能够检测低至20nmol/L的对氧磷和甲基对硫磷，对有机磷类农药具有很好的选择性(Flow injection amperometric enzymebiosensor for direct determination of organphosphate nerve agents，Environ.Sci.Technol.2001，(35))。Jeanty等用流动注射乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷农药对氧磷及其衍生物，检测限可达到4×10-9mol/L(Detection of paraoxon by continuous flow system basedenzyme sensor，Biosensors and Bioelectronics.1998，(13))。上述方法中涉及的生物传感器仅限用于通过酶固定方法和材料的改变来提高生物传感器的测量范围和检出限的实验室研究，尚无法批量生产并用于检测实际之中。CN 01253887.6披露了一种探测农药残留用的量热式生物传感器，由被测液处理单元和检测单元组成，被测液处理单元包括前处理器、过滤器、样液容器、缓冲液容器、导管、蠕动泵、脉冲阻尼器、微量注射泵，检测单元包括内、外胆组成的恒温器、半导体制冷器、三通，检测酶柱、参考酶柱，温度检测元件置于酶柱两侧，检测酶柱出口液体的温度差，输出和处理、显示单元及微处理机连接。这种量热式生物传感器的组成结构复杂、成本昂贵、更不便于携带，特别是由于实际检测应用中，被抑制的酶的活性很难逆转，酶反应层的再次固定活化会成为首要问题。因此，研制和开发易于产业化的、廉价的一次性用于残留农药检测的酶电极就非常必要。
现易于产业化的电极生产的最佳方法莫过于采用丝网印刷技术。CN 85102225薄形防水气体扩散电极的制造方法、CN 99812560.1制造气体扩散电极的丝网印刷方法、CN00130620.0固体氧化物燃料电池的复合阳极材料及电极制作方法和CN 02157282.8染料敏化纳米薄膜太阳电池电极的制备方法四篇专利文献中披露的就是用丝网印刷技术来制作几种特定用途电极的方法。然而采用丝网印刷技术产业化制作一次性用于残留农药检测的酶电极的相关报道尚未见到。
实用新型内容本实用新型所要解决的技术问题是提供一种用于残留农药检测的酶电极，它易于产业化制作和一次性使用。
本实用新型解决该技术问题所采用的技术方案是用于残留农药检测的酶电极，它包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极和对电极，在电极基片上，印制或粘接上由导电材料薄膜形成的接线端子与电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子与电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，电极连线在电极基体的中间部分，其表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体，接线端子和对电极是裸露的导电材料薄膜，工作电极的基体面上涂覆有由包埋酶技术形成的反应层，其特征在于电极基片是用有机绝缘材料制作的利用丝网印刷技术制成的丝网印刷电极基片，反应层是由用包埋酶技术固定在工作电极上的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶组成的双酶结构层，酶分子之间是由戊二醛交联。
在本实用新型用于残留农药检测的酶电极的构成中，还可以用一绝缘材料薄片制作的上盖覆盖在整个电极的最上面，并露出全部工作电极、对电极、接线端子和一小部分电极连线。
本实用新型用于残留农药检测的酶电极的工作电极的形状是实心圆形或实心方形，对电极的形状是围在工作电极基体外面的空心圆环形或_形。
本实用新型用于残留农药检测的酶电极各组成部分的尺寸为丝网印刷电极基片长38～42mm、宽7～8mm、厚0.3～0.5mm；接线端子长3～5mm、宽0.8～2mm；电极连线长25～30mm、宽0.8～1.2mm；工作电极为直径2～3mm的实心圆形片或长2～3mm、宽2～3mm的实心方形片；对电极为内径3～4mm、线体宽0.8～1.2mm的圆环形片或长3.3～5.2mm、高3.3～5.2mm、线体宽0.8～1.2mm的_形片；上盖为长35～39mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm距一宽边3～5mm上方中部开有直径为4～5mm的圆形窗口的绝缘材料薄片或为长24～29.5mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm的绝缘材料薄片；两条平行电极连线之间的间距为2.5～3.5mm，工作电极与对电极之间的间距为0.5～1mm，接线端子位于丝网印刷电极基片一宽边顶端，电极连线距离丝网印刷电极基片长边0.55～1.95mm。
本实用新型的有益效果是由于本实用新型用于残留农药检测的酶电极是利用丝网印刷技术制成的丝网印刷电极基片作为酶反应层的载体，与已有的处于研究阶段的用于残留农药检测的生物传感器相比，其优点在于(1)丝网印刷电极以丝网印刷版作模具，所制作传感器电极的大小和形状可以改变，易微型化和集成化，又由于丝网印刷技术的应用，使制作电极的工艺成本降低，适于产业化生产中价廉的要求，因此有利于制成一次性生物传感器产品，方便客户使用。
(2)丝网印刷技术不受承印物大小和形状的限制，其灵活性和实用性的特点使其在制作电极时不受形状、大小等限制，可制成不同规格的酶电极产品，丰富产品种类。
(3)由于丝网印刷技术适合于进行工业化的大规模生产，使得电极在生产上可以批量定制，它不受企业大小的限制，大企业机械化可以进行生产，乡镇企业、个体手工业也可以进行生产。
(4)丝网印刷电极规格小，重量轻，易于携带，方便、实用。
用本实用新型以丝网印刷电极为固定载体固定乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶形成双酶结构的酶电极组建的生物传感器，可实现对敌百虫等有机磷农药的快速在线检测，检测时间可控制在10分钟左右，检出限为1×10-10M。检测反应原理如下乙酰胆碱(Ach)在乙酰胆碱酯酶(AchE)的催化下可以分解为乙酸和胆碱胆碱(Ch)进一步在胆碱氧化酶(ChOx)的催化作用下分解为甜菜酸和过氧化氢
H2O2在电极表面发生氧化电化学反应产生电子， 根据上述反应，H2O2通过氧化电化学反应产生电子，当产生的电子转移到电极表面即产生安培电流，而残留农药如有机磷类、重金属等会抑制乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱底物的催化活性，使产生的安培电流发生变化，根据电流变化的大小可以测定残留农药的含量。
图1-1是有1个圆形工作电极的本实用新型酶电极的整体正视图。
图1-2是去除上盖的有圆形工作电极的本实用新型酶电极的正视图。
图1-3是有1个圆形工作电极的本实用新型酶电极的结构剖视正面视图。
图1-4是有1个圆形工作电极的本实用新型酶电极的结构剖视斜面视图。
图2-1是有1个方形工作电极的本实用新型酶电极的整体正视图。
图2-2是去除上盖的有方形工作电极的本实用新型酶电极的正视图。
图2-3是有1个方形工作电极的本实用新型酶电极的结构剖视正面视图。
图2-4是有1个方形工作电极的本实用新型酶电极的结构剖视斜面视图。
图中，1.丝网印刷电极基片，2.反应层，3.接线端子，4.电极连线，5.工作电极，6.对电极，7.上盖，8.圆形窗口。
以下结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。但本实用新型的权利要求并不仅限于此。
具体实施方式
图1-1表明从外表观察有圆形工作电极的本实用新型酶电极的整体，可以看到接线端子(3)，上盖(7)，圆形窗口(8)和露在上盖(7)外面的部分丝网印刷电极基片(1)及一小部分电极连线(4)，露在圆形窗口(8)外面的实心圆形工作电极(5)和圆环形对电极(6)。
图1-2表明将上盖(7)拿去后，可以看到完整的丝网印刷电极基片(1)，接线端子(3)，电极连线(4)，实心圆形工作电极(5)和圆环形对电极(6)。两条平行电极连线之间的间距为2.5mm～3.5mm，工作电极与对电极之间的间距为0.5mm～1mm，接线端子位于丝网印刷电极基片一宽边顶端，电极连线距离丝网印刷电极基片长边0.55～1.95mm。
图1-3和图1-4表明有1个实心圆形工作电极的本实用新型酶电极的各个构成部件。图中，丝网印刷电极基片(1)长38～42mm、宽7～8mm、厚0.3～0.5mm；接线端子(3)长3～5mm、宽0.8～2mm；电极连线(4)长25～30mm、宽0.8～1.2mm；工作电极(5)为直径2～3mm的实心圆形片；对电极(6)为内径3～4mm、线体宽0.8～1.2mm的圆环形片；上盖(7)为长35～39mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm距一宽边3～5mm上方中部开有直径为4～5mm的圆形窗口(8)的绝缘材料薄片；反应层(2)是大小与工作电极(5)完全相同的、用包埋酶技术固定在工作电极(5)上的、酶分子之间由戊二醛交联的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的双酶结构层。
图2-1表明从外表观察有方形工作电极的本实用新型酶电极的整体，可以看到接线端子(3)，上盖(7)，实心方形工作电极(5)、_形对电极(6)和露在上盖(7)外面的部分丝网印刷电极基片(1)及一小部分电极连线(4)。
图2-2将上盖(7)拿去后，可以看到完整的丝网印刷电极基片(1)，接线端子(3)，电极连线(4)，实心方形工作电极(5)和_形对电极(6)。两条平行电极连线之间的间距为2.5mm～3.5mm，工作电极与对电极之间的间距为0.5mm～1mm，接线端子涂覆位于丝网印刷电极基片一宽边顶端，电极连线距离丝网印刷电极基片长边0.55～1.95mm。
图2-3和图2-4表明有1个正方形工作电极的本实用新型酶电极的各个构成部件。图中，丝网印刷电极基片(1)长38～42mm、宽7～8mm、厚0.3～0.5mm；接线端子(3)长3～5mm、宽0.8～2mm；电极连线(4)长25～30mm、宽0.8～1.2mm；工作电极(5)为长2～3mm、宽2～3mm的实心方形片；对电极(6)为长3.3～5.2mm、高3.3～5.2mm、线体宽0.8～1.2mm的_形片；上盖(7)为长24～29.5mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm的绝缘材料薄片；反应层(2)是大小与工作电极(5)完全相同的、用包埋酶技术固定在工作电极(5)上的、酶分子之间由戊二醛交联的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的双酶结构层。
实施例1在用丝网印刷技术制作的聚碳酸酯做成的丝网印刷电极基片上，将金箔用喷涂法印制形成两条电极的基体，它们的上端裸露为接线端子，它们的中间部分表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体为电极连线，其中一条下端部分涂覆包埋酶技术形成的反应层为工作电极，另一条下端部分裸露为对电极，最后用粘接剂将聚碳酸酯做成的上盖覆盖在电极上面，但必须裸露出接线端子、工作电极和对电极。
上述反应层的具体制备方法为第一步，依次用0.5μm和0.3μmAl2O3粉末将导电材料电极抛光，再用50％的HNO3进行处理，最后分别用丙酮和二次蒸馏水充分冲洗3次；第二步，将配比为V/V＝1/8的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶加入温度为35℃、最终浓度为5％的明胶和PH＝7.0、浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，取10μL上述混合液滴加到作为工作电极的一条电极基体的下端裸露部分表面，均匀地涂成酶膜，在室温下干燥；第三步，等完全干燥后用2％戊二醛和浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液1μL～2μL滴加到第二步中涂成的酶膜上，使两种酶在戊二醛作用下相互交联10分钟，然后用0.02M的磷酸盐缓冲液洗去多余的戊二醛，将制成的酶电极置于4℃下冰箱中，保存24小时后使用。上述方法中所用溶液的百分比浓度均为重量/体积比浓度，所用的磷酸盐缓冲液的配方是Na2HPO41.15克，KCl0.2克，NaCl8.0克，KH2PO40.2克，定容于1000mL的容量瓶中，pH＝7.4。
上述丝网印刷电极基片长38～42mm、宽7～8mm、厚0.3～0.5mm；接线端子长3～5mm、宽0.8～2mm；电极连线长25～30mm、宽0.8～1.2mm；工作电极为直径2～3mm的实心圆形片；对电极为内径3～4mm、线体宽0.8～1.2mm的圆环形片；上盖为长35～39mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm距一宽边3～5mm上方中部开有直径为4～5mm的圆形窗口的绝聚碳酸酯薄片；两条平行电极连线之间的间距为2.5mm～3.5mm，工作电极与对电极之间的间距为0.5mm～1mm，接线端子位于丝网印刷电极基片一宽边顶端，电极连线距离丝网印刷电极基片长边0.55～1.95mm。
实施例2除导电材料用碳以外，其它与实施例1相同。
实施例3除导电材料用铂以外，其它与实施例1相同。
实施例4除导电材料用银以外，其它与实施例1相同。
实施例5
除工作电极为长2～3mm×宽2～3mm的实心方形片；对电极长3.3～5.2mm、高3.3～5.2mm、线体宽0.8～1.2mm的_形片子；上盖为长24～29.5mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm的绝缘材料薄片以外，其它与实施例1相同。
实施例6除导电材料用碳以外，其它与实施例5相同。
实施例7除导电材料用铂以外，其它与实施例5相同。
实施例8除导电材料用银以外，其它与实施例5相同。
权利要求1.一种用于残留农药检测的酶电极，它包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极和对电极，在电极基片上，印制或粘接上由导电材料薄膜形成的接线端子与电极连线与工作电极连成一体的一条电极基体和接线端子与电极连线与对电极连成一体的另一条电极基体，电极连线在电极基体的中间部分，其表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体，接线端子和对电极是裸露的导电材料薄膜，工作电极的基体面上涂覆有由包埋酶技术形成的反应层，其特征在于电极基片是用有机绝缘材料制作的利用丝网印刷技术制成的丝网印刷电极基片，反应层是由用包埋酶技术固定在工作电极上的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶组成的双酶结构层，酶分子之间是由戊二醛交联。
2.按照权利要求1所述的一种用于残留农药检测的酶电极，其特征在于用一绝缘材料薄片制作的上盖覆盖在整个电极的最上面，并露出全部工作电极、对电极、接线端子和一小部分电极连线。
3.按照权利要求1所述的一种用于残留农药检测的酶电极，其特征在于工作电极的形状是实心圆形或实心方形，对电极的形状是围在工作电极基体外面的空心圆环形或_形。
4.按照权利要求3所述的一种用于残留农药检测的酶电极，其特征在于酶电极各组成部分的尺寸为丝网印刷电极基片长38～42mm、宽7～8mm、厚0.3～0.5mm；接线端子长3～5mm、宽0.8～2mm；电极连线长25～30mm、宽0.8～1.2mm；工作电极为直径2～3mm的实心圆形片或长2～3mm、宽2～3mm的实心方形片；对电极为内径3～4mm、线体宽0.8～1.2mm的圆环形片或长3.3～5.2mm、高3.3～5.2mm、线体宽0.8～1.2mm的_形片；上盖为长35～39mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm距一宽边3～5mm上方中部开有直径为4～5mm的圆形窗口的绝缘材料薄片或为长24～29.5mm、宽7～8mm、厚0.1～0.3mm的绝缘材料薄片；两条平行电极连线之间的间距为2.5～3.5mm，工作电极与对电极之间的间距为0.5～1mm，接线端子位于丝网印刷电极基片一宽边顶端，电极连线距离丝网印刷电极基片长边0.55～1.95mm。
专利摘要一种用于残留农药检测的酶电极，属于生物化学电极，它包括电极基片、接线端子、电极连线、工作电极和对电极，电极基片是用有机绝缘材料制作的利用丝网印刷技术制成的丝网印刷电极基片，工作电极上涂覆的反应层是由用包埋酶技术固定在工作电极上的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶组成的双酶结构层，酶分子之间是由戊二醛交联。本实用新型用于残留农药检测的酶电极易于产业化制作和一次性使用。
文档编号G01N27/30GK2723998SQ20042002959
公开日2005年9月7日 申请日期2004年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者陈强, 宋昭, 黄加栋, 吴宝艳, 史海滨, 李二虎, 贺秉军, 吕宪禹 申请人:南开大学