一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用。所述酶电极包括基底电极，所述基底电极表面附有碳化蛋壳膜，所述碳化蛋壳膜上固定化有纳米金属颗粒和酶。本发明的酶电极以蛋壳膜和纳米金属颗粒复合材料作载体，来实现酶分子的有效固定和酶与电极之间的直接电子转移，提高酶分子催化活性和传感器的灵敏度。与现有技术相比，本发明的酶电极以蛋壳膜为材料，实现废弃物重复利用，制作方法简单、成本低廉，电极和酶之间的电子传递速率高；本发明的酶生物传感器检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好。
【专利说明】一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物传感器【技术领域】，尤其涉及一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]在生物传感器领域，酶电极占有重要的地位。目前广泛研究的第三代传感器则是利用酶本身与电极间的直接电子转移来完成信号的转换，无需引入媒介体，大大提高了传感器的性能。要实现酶和电极之间比较有效的直接电子转移，就要构造一个合适的薄膜电极界面，而在这个薄膜电极界面的构造中，只有那些生物相容性比较好又能在酶和电极之间的直接电子转移方面起促进作用的材料才是首选。
[0003]多种利用酶或酶-媒介体修饰的电化学传感器已用于底物测定。在生物传感器的研制中，酶的固定化是影响其分析性能的关键步骤。纳米微粒由于其特殊类型的结构，可增强酶的吸附量并保持其生物活性。其具有比表面积大、吸附能力强、良好的生物相容性等优点，可将生物分子强有力地固定在其表面制得的生物传感器上。利用纳米颗粒固定生物分子于电极表面构建传感界面，有利于保持生物分子的活性，为生物传感器的发展开辟了新途径。如中国专利申请CN103207224A公开了一种基于螺旋碳纳米纤维和金胶纳米粒子的复合材料作为血红蛋白的载体的酶生物传感器，促进了血红蛋白与电极间的电子传递，但其制作程序复杂，材料成本较高。
[0004]随着不可再生资源的消耗和环境污染的加剧，人们对低成本和环境友好型高功率能量源的需求越来越迫切。蛋壳膜由于自身具有三维网状结构和电化学稳定性高等特点，可作为一种可持续资源，用于清洁能源存储。如中国专利申请CN103258654A公开了一种基于蛋壳内膜的非对称超级电容器的制造方法，将蛋壳内膜碳化及空气中活化处理后作为高能量、高功率密度的超级电容器材料，其循环稳定性也达到使用水平。
[0005]目前，全球每年消耗I万亿颗蛋类，一颗蛋可以提炼30-40毫克成品碳，而蛋壳膜由于生物兼容性好，将蛋壳膜用于研制生物传感器尚无报道。蛋壳膜作为日常废弃物，能够与蛋白质或酶结合，其为酶在传感器的固定提供良好的微环境，用于高灵敏度酶催化及底物检测值得研究。迄今为止，国内外尚未有利用蛋壳膜材料及纳米颗粒制备的生物传感器。所以发明一种成本低、检测限低、响应时间短、灵敏度高、稳定性好的生物传感器是一个迫切需要解决的重要技术问题。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用。所述酶电极以蛋壳膜和纳米粒子复合材料作载体，来实现酶分子的有效固定和酶与电极之间的直接电子转移，从而达到提高酶分子催化活性、提高传感器灵敏度的目的。
[0007]为实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案:[0008]在第一方面，本发明提供一种酶电极，包括基底电极，所述基底电极表面附有碳化蛋壳膜，所述碳化蛋壳膜上固定化有纳米金属颗粒和酶。
[0009]作为本发明的优选方案，所述基底电极为玻碳电极(GCE)、铟锡氧化物电极(ITO)、热解石墨电极(PG)、碳糊电极(CPE)或金属电极。
[0010]优选地，所述基底电极为Al2O3抛光过的玻碳电极、铟锡氧化物电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极。
[0011]优选地，所述金属电极为金电极或银电极，优选为金电极(Au)。
[0012]作为本发明的优选方案，所述蛋壳膜来源于鸡蛋壳、鸭蛋壳、鹅蛋壳或鹌鹑蛋壳。所述蛋壳膜并不局限于上述来源，任何禽类包括鸵鸟的蛋壳都可以用于提供本发明的蛋壳膜。
[0013]作为本发明的优选方案，所述纳米金属颗粒为纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米铜颗粒、纳米钯颗粒和纳米钼颗粒中的I种或至少2种的组合。可以单独使用I种纳米金属颗粒，也可以组合使用至少2种纳米金属颗粒。
[0014]作为本发明的优选方案，所述酶为辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOX)、血红蛋白(Hb)、漆酶、脱氢酶或氧化还原酶中的I种或至少2种的组合。
[0015]在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的酶电极的方法，包括如下步骤:将剥离出的蛋壳膜贴至基底电极表面，在保护性气氛中加热碳化处理形成附在所述基底电极表面的碳化蛋壳膜；将纳米金属颗粒和酶固定化至所述碳化蛋壳膜上形成所述酶电极。
[0016]作为本发明的优选方案，所述基底电极在使用前用Al2O3抛光。虽然Al2O3抛光并非本发明的必须步骤，但是Al2O3抛光能够增加蛋壳膜的附着性，使得基底电极上附着的蛋壳膜更多、更稳定，利于纳米金属颗粒和酶的固化，从而得到的酶电极具有更好、更稳定的性能。
[0017]优选地，所述基底电极在使用前用粒径为0.05?1.0 μ m的Al2O3浆液抛光。
[0018]优选地，所述抛光后分别用乙醇和蒸馏水超声清洗。
[0019]优选地，所述超声清洗的时间为2?5min,例如可选择2?4min、3?5min、3?4min、2 ?3min 等，优选 2 ?3min。
[0020]优选地，所述抛光具体可以是:将基底电极用Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水超声清洗。
[0021]作为本发明的优选方案，所述碳化处理前对贴至基底电极表面的蛋壳膜进行干燥处理。
[0022]优选地，所述干燥处理具体为在烘箱内由室温开始以2?5min内温度上调3?50C的速率上调至60?80°C，整个干燥过程持续4?5h。例如可选择每5min上调5°C、每2min上调5°C、每3min上调4°C、每2min上调3°C，优选为每5min上调5°C ;最高干燥温度为60?80°C，优选为80°C。
[0023]优选地，所述碳化处理在马弗炉中进行。
[0024]优选地，所述碳化处理的温度为500?1000°C，例如可选择550?998°C、600?950°C、635 ?904°C、680 ?836°C、630 ?800°C、500 ?725°C、580 ?700°C、635 ?870°C、500?960 °C等，优选为700?800 °C。
[0025]优选地，所述碳化处理的时间为0.01?10h，例如可选择0.02h、0.05h、0.lh、0.5h、2h、5h、8h、9h 等，优选为 2h。
[0026]优选地，所述碳化处理的升温速率为I~20°C 例如可选择I~10°C min'2 ~5°C.min'3 ~TC.min'4 ~ICTC.min'3 ~8°C.mirf1、10 ~15°C.mirf1 等，优选为 5 ~15 °C.min、
[0027]优选地,所述保护性气氛为氮气、氩气、氦气、氢气和一氧化碳中的I种或至少2种的组合。
[0028]优选地，所述保护性气氛的气体流量为50~300mL/h，例如可选择100~200mL/h、50 ~120mL/h、80 ~150mL/h、150 ~300mL/h 等，优选为 100 ~200mL/h。
[0029]优选地，采用包埋法和/或交联法将所述纳米金属颗粒和酶同时固定化至所述碳化蛋壳膜上。
[0030]优选地，先采用电沉积将所述纳米金属颗粒沉积至所述碳化蛋壳膜上，再采用直接吸附法、共价结合法、包埋法和/或交联法将所述酶固定化至所述碳化蛋壳膜上。
[0031]在第三方面，本发明提供一种酶生物传感器，包括作为工作电极的第一方面所述的酶电极，以及参比电极和对电极。
[0032]优选地，所述参比电极为饱和甘汞电极、氢电极、银I氯化银电极或汞I氧化汞电极，更优选为饱和甘汞电极。
[0033]优选地，所述对电极为钼丝电极或碳电极。
[0034]在第四方面，本发明提供如第一方面所述的酶电极在测定溶液中的底物浓度中的应用。
[0035]优选地，所述应用中以循环伏安和/或计时电流的方式测定溶液中的底物浓度。
[0036]优选地，所述循环伏安方式的测试电位扫描速率为25~200mV/s，例如可选择25 ~50mV/s、50 ~90mV/s、50 ~120mV/s、80 ~150mV/s、100 ~150mV/s，优选为 50 ~100mV/s。
[0037]优选地，所述底物为H2O2、葡萄糖或酚类污染物；所述酚类污染物例如苯酚、五氯酚等。
[0038]优选地，所述底物浓度范围为5μ M~10mM，例如可选择10 μ10 μ M_2mM、100 μ M-2.5mM、200 μ M_4mM、500 μ M_6mM，优选为 5 μ M_5mM。
[0039]优选地，所述溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的I种或至少2种的组合。
[0040]与现有技术相比，本发明的优点体现在:
[0041](I)成本低:本发明所用的蛋壳膜，材料易得，制备时只需简单处理，故工艺简单、成本低廉，而且可以减少生活垃圾的污染，利于低碳社会的构建；
[0042](2)电子传递速率高:本发明所用的蛋壳膜碳化后形成三维多孔交联结构，能够促进电极和酶之间的电子传递；纳米金属颗粒导电性较强，能够进一步增强电子传递速率；
[0043] (3)酶的固定化效果好:蛋壳膜表面的多孔结构，增大了电极的比表面积，增大酶的吸附量；将纳米金属颗粒固定于蛋壳膜上，紧贴于电极表面，由于纳米金属颗粒的微观尺度特征及良好的生物相容性，能够增加酶的固定化效果；
[0044](4)检测灵敏度高:纳米金属颗粒-蛋壳膜材料能增强酶生物传感器的灵敏度、响 应区间，具有快捷准确、重复性好的特点。
【具体实施方式】
[0045]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
[0046]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0047]实施例1
[0048]一种基于蛋壳膜修饰的酶电极和酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0049](I)将玻碳电极(GCE)分别用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3浆在麂皮的抛光机上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗3min。
[0050](2)所述蛋壳膜选用鸡蛋壳内膜，将鸡蛋壳内膜剥离并清水清洗，剪成小片后放在抛光后的玻碳电极表面，并在室温下放入烘箱中，从室温开始升温，每5min升温5°C，升温到80°C，干燥4h。
[0051](3)将干燥后的载膜玻碳电极放入石英玻璃管中，将石英玻璃管放入马弗炉，在N2保护气氛中加热碳化处理，N2流速100mL/h,气流稳定后开马弗炉,升温速率5°C.mirT1,升到800°C后保持2h，之后降温到室温，得到碳化的蛋壳膜修饰电极(CESM/GCE)。
[0052](4)采用恒电流沉积法在鸡蛋壳膜电极表面直接沉积金纳米颗粒(AuNPs)，得到纳米金颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极；将辣根过氧化物酶(HRP)溶于pH为7.0的PBS缓冲溶液中，将制得的纳米金颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极浸入酶溶液，吸附24h后取出，然后用PBS缓冲溶液洗去未吸附的酶，得到HRP/AuNPs/CESM/GCE酶电极。
[0053](5)将饱和甘汞电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，上述制得的酶电极作为工作电极。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.6V-0.6V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0-1200s，每间隔30s进行一次H2O2加样，H2O2加入浓度为I μ M-5mM。
[0054]通过扫描电镜、循环伏安测试、计时安培电流测试知:此例所得碳化鸡蛋壳膜具有三维多孔结构，孔径约I?5μπι，纳米金较为均匀地分布于蛋壳膜表面，直径约为50?IOOnm ；HRP/AuNPs/CESM/GCE酶电极对H2O2的检测灵敏度较高，检测限为3 μ Μ，线性检测范围5 μ M-3mM。实验后，将修饰电极于4°C下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的96% 个月后，其响应信号仍为初始信号的92%，这表明HRP/AuNPs/CESM/GCE具有较好的稳定性，可较好地应用于酶生物传感器。
[0055]实施例2
[0056]一种基于蛋壳膜修饰的酶电极和酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0057](I)将热解石墨电极(PG)分别用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3浆在麂皮的抛光机上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗5min。
[0058](2)所述蛋壳膜选用鸭蛋壳内膜，将鸭蛋壳内膜剥离并清水清洗，剪成小片后放在抛光后的热解石墨电极表面，并在室温下放入烘箱中，从室温开始升温，每5min升温:TC，升温到70°C，干燥5h。
[0059](3)将干燥后的载膜热解石墨电极放入石英玻璃管中，将石英玻璃管放入马弗炉，在N2保护气氛中加热碳化处理，N2流速150mL/h，气流稳定后开马弗炉，升温速率IO0C.mirT1，升到800°C后保持2h，之后降温到室温，得到碳化的鸭蛋壳膜修饰电极(CESM/PG)。
[0060](4)采用包埋法将葡萄糖氧化酶(GOX)和钯纳米颗粒(PdNPs)固定化至鸭蛋壳膜电极表面，在pH为7.0的PBS缓冲溶液中清洗，得到GOX/PdNPs/CESM/PG酶电极。
[0061](5)将饱和甘汞电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，上述制得的酶电极为工作电极。循环伏安测试的扫描速率为100mV/S，扫描范围-0.6V-0.6V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0-900s，每间隔30s进行一次葡萄糖加样，加入浓度为 10 μ M_5mM。
[0062]通过扫描电镜、循环伏安测试、计时安培电流测试知:此例所得碳化鸭蛋壳膜具有三维多孔结构，孔径约I?10 μ m，纳米钯较为均匀地分布于蛋壳膜表面，直径约为30?50nm, GOX/PdNPs/CESM/PG酶电极对葡萄糖的检测灵敏度较高，检测限为10 μ Μ，线性检测范围50μΜ-2.5mM。实验后，将修饰电极于4°C下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的94% 个月后，其响应信号仍为初始信号的90%，这表明GOX/PdNPs/CESM/PG酶电极具有较好的稳定性，可较好地应用于生物传感器。
[0063]实施例3
[0064]一种基于蛋壳膜修饰的酶电极和酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0065](I)将碳糊电极(CPE)分别用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3浆在麂皮的抛光机上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗4min。
[0066](2)所述蛋壳膜选用鹌鹑蛋壳内膜，将鹌鹑蛋壳内膜剥离并清水清洗，剪成小片后放在抛光后的碳糊电极表面，并在室温下放入烘箱中，从室温开始升温，每IOmin升温5°C，升温到75°C，干燥4h。
[0067](3)将干燥后的载膜碳糊电极放入石英玻璃管中，将石英玻璃管放入马弗炉，在氦气保护气氛中加热碳化处理，氦气流速100mL/h，气流稳定后开马弗炉，升温速率IO0C 升到700°C后保持2h，之后降温到室温，得到碳化的鹌鹑蛋壳膜修饰电极(CESM/CPE)。
[0068](4)采用聚多巴胺将银纳米颗粒(Ag NPs)和血红蛋白(Hb)原位交联至鹤鹁蛋壳膜电极表面，在PH为7.0的PBS缓冲溶液清洗，放于4°C冰箱内干燥，得到Hb/Ag NPs/CESM/CPE酶电极。
[0069](5)将饱和甘汞电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，上述制得的酶电极为工作电极。循环伏安测试的扫描速率为80mV/s，扫描范围-1?IV，于pH为7.0的PBS缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为O-1OOOs，每间隔50s进行一次H2O2加样，加入浓度为 10 μ M-7mM。
[0070]通过扫描电镜、循环伏安测试、计时安培电流测试知:此例所得碳化鹌鹑蛋壳膜具有三维多孔结构，孔径约5~10 μ m，纳米银较为均匀地分布于蛋壳膜表面，直径约为50~IOOnm ；Hb/Ag NPs/CESM/CPE酶电极对H2O2的检测灵敏度较高，检测限为10 μ Μ，线性检测范围75μΜ-3.6mM。实验后，将修饰电极于4°C下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的92% 个月后，其响应信号仍为初始信号的90%，这表明Hb/Ag NPs/CESM/CPE具有较好的稳定性，可较好地应用于生物传感器。
[0071]实施例4
[0072]—种基于蛋壳膜修饰的酶电极和酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0073](1)将金电极(Au)分别用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3浆在麂皮的抛光机上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗5min。
[0074](2)所述蛋壳膜选用鸡蛋壳内膜，将鸡蛋壳内膜剥离并清水清洗，剪成小片后放在抛光后的金电极表面，并在室温下放入烘箱中，从室温开始升温，每5min升温5°C，升温到80°C，干燥 4h。
[0075](3)将干燥后的载膜金电极放入石英玻璃管中，将石英玻璃管放入马弗炉，在N2保护气氛中加热碳化处理，N2流速200mL/h,气流稳定后开马弗炉,升温速率15°C ?mirT1,升到800°C后保持2h，之后降温到室温，得到碳化的鸡蛋壳膜修饰电极(CESM/Au)。
[0076](4)采用恒电流沉 积法在鸡蛋壳膜电极表面直接沉积钼纳米颗粒(Pt NPs)，电解完毕后取出电极，在超纯水中清洗，室温下自然干燥，得到纳米钼颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极。
[0077](5)用注射器将漆酶(Lac)溶液(pH为7.0的PBS缓冲溶液)滴加于制得的纳米钼颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极表面，放于4°C冰箱内干燥，然后用PBS缓冲溶液洗去未吸附的酶，得到 Lac/Pt NPs/CESM/Au 酶电极。
[0078](6)将饱和甘汞电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，上述制得的酶电极作为工作电极。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-1~IV，于pH为7.0的PBS缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0-1200S，每间隔30s进行一次邻苯二酚加样，加入浓度为?ο μ
[0079]通过扫描电镜、循环伏安测试、计时安培电流测试知:此例所得碳化鸡蛋壳膜具有三维多孔结构，孔径约I~10 μ m，纳米钼较为均匀地分布于蛋壳膜表面，直径约为50~200nm ；Lac/Pt NPs/CESM/Au酶电极对邻苯二酚的检测灵敏度较高，检测限为14 μ Μ，线性检测范围60 μ M-4mM。实验后，将修饰电极于4°C下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的94% 个月后，其响应信号仍为初始信号的90%，这表明Lac/Pt NPs/CESM/Au具有较好的稳定性，可较好地应用于生物传感器。
[0080]实施例5
[0081]一种基于蛋壳膜修饰的酶电极和酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0082](I)将玻碳电极(GCE)分别用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3浆在麂皮的抛光机上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗3min。[0083](2)所述蛋壳膜选用鸡蛋壳内膜，将鸡蛋壳内膜剥离并清水清洗，剪成小片后放在抛光后的玻碳电极表面，并在室温下放入烘箱中，从室温开始升温，每5min升温5°C，升温到60°C，干燥5h。
[0084](3)将干燥后的载膜玻碳电极放入石英玻璃管中，将石英玻璃管放入马弗炉，在N2保护气氛中加热碳化处理，N2流速300mL/h，气流稳定后开马弗炉，升温速率20°C 升到1000°C后保持0.01h，之后降温到室温，得到碳化的蛋壳膜修饰电极(CESM/GCE)。
[0085](4)采用恒电流沉积法在鸡蛋壳膜电极表面直接沉积金纳米颗粒(AuNPs)，得到纳米金颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极；将血红蛋白(Hb)溶于pH为7.0的PBS缓冲溶液中，将制得的纳米金颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极浸入酶溶液，吸附24h后取出，然后用PBS缓冲溶液洗去未吸附的酶，得到Hb/AuNPs/CESM/GCE酶电极。
[0086](5)将饱和甘汞电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，上述制得的酶电极作为工作电极。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.6V-0.6V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0-1200s，每间隔30s进行一次H2O2加样，H2O2加入浓度为I μ M-5mM。
[0087]通过扫描电镜、循环伏安测试、计时安培电流测试知:此例所得碳化鸡蛋壳膜具有三维多孔结构，孔径约2~5μπι，纳米金较为均匀地分布于蛋壳膜表面，直径约为50~IOOnm ;Hb/AuNPs/CESM/GCE酶电极对H2O2的检测灵敏度较高，检测限为5 μ Μ，线性检测范围10μΜ-3πιΜ。实验后，将修饰电极于4°C下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的95% 个月后，其响应信号仍为初始信号的90%，这表明Hb/AuNPs/CESM/GCE具有较好的稳定性，可较好地应用于酶生物传感器。 [0088]实施例6
[0089]一种基于蛋壳膜修饰的酶电极和酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0090](I)将玻碳电极(GCE)分别用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3浆在麂皮的抛光机上抛光至镜面，每次抛光后用清水洗去表面污物，之后依次用乙醇和蒸馏水分别超声清洗3min。
[0091](2)所述蛋壳膜选用鸡蛋壳内膜，将鸡蛋壳内膜剥离并清水清洗，剪成小片后放在抛光后的玻碳电极表面，并在室温下放入烘箱中，从室温开始升温，每5min升温5°C，升温到80°C，干燥4h。
[0092](3)将干燥后的载膜玻碳电极放入石英玻璃管中，将石英玻璃管放入马弗炉，在N2保护气氛中加热碳化处理，N2流速50mL/h,气流稳定后开马弗炉,升温速率1°C ?mirT1,升到500°C后保持10h，之后降温到室温，得到碳化的蛋壳膜修饰电极(CESM/GCE)。
[0093](4)采用恒电流沉积法在鸡蛋壳膜电极表面直接沉积金纳米颗粒(AuNPs)，得到纳米金颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极；将辣根过氧化物酶(HRP)溶于pH为7.0的PBS缓冲溶液中，将制得的纳米金颗粒-鸡蛋壳膜修饰电极浸入酶溶液，吸附24h后取出，然后用PBS缓冲溶液洗去未吸附的酶，得到HRP/AuNPs/CESM/GCE酶电极。
[0094](5)将饱和甘汞电极作为参比电极，钼丝电极作为对电极，上述制得的酶电极作为工作电极。循环伏安测试的扫描速率为50mV/s，扫描范围-0.6V-0.6V，于pH为7.0的缓冲溶液中进行，计时安培电流测试的时间为0-1200s，每间隔30s进行一次H2O2加样，H2O2加入浓度为I μ M-5mM。[0095]通过扫描电镜、循环伏安测试、计时安培电流测试知:此例所得碳化鸡蛋壳膜具有三维多孔结构，孔径约1.5?5 μ m，纳米金较为均匀地分布于蛋壳膜表面，直径约为50?IOOnm ；HRP/AuNPs/CESM/GCE酶电极对H2O2的检测灵敏度较高，检测限为4 μ M，线性检测范围10 μ M-2.8mM。实验后，将修饰电极于4°C下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；20天后，其响应信号为初始信号的94% 个月后，其响应信号仍为初始信号的91%，这表明HRP/AuNPs/CESM/GCE具有较好的稳定性，可较好地应用于酶生物传感器。
[0096] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0097]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0098]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0099]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1.一种酶电极，包括基底电极，所述基底电极表面附有碳化蛋壳膜，所述碳化蛋壳膜上固定化有纳米金属颗粒和酶。
2.根据权利要求1所述的酶电极，其特征在于，所述基底电极为玻碳电极、铟锡氧化物电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极； 优选地，所述基底电极为Al2O3抛光过的玻碳电极、铟锡氧化物电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极； 优选地，所述金属电极为金电极或银电极，优选为金电极。
3.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于，所述蛋壳膜来源于鸡蛋壳、鸭蛋壳、鹅蛋壳或鹌鹑蛋壳。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酶电极，其特征在于，所述纳米金属颗粒为纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米铜颗粒、纳米钯颗粒和纳米钼颗粒中的I种或至少2种的组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的酶电极，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、血红蛋白、细胞色素C、漆酶、脱氢酶或氧化还原酶中的I种或至少2种的组合。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的酶电极的方法，包括如下步骤:将剥离出的蛋壳膜贴至基底电极表面，在保护性气氛中加热碳化处理形成附在所述基底电极表面的碳化蛋壳膜；将纳米金属颗粒和酶固定化至所述碳化蛋壳膜上形成所述酶电极。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基底电极在使用前用Al2O3抛光； 优选地，所述基底电极在使用前用粒径为0.05~1.0 μ m的Al2O3浆液抛光； 优选地，所述抛光后分别用乙醇和蒸馏水超声清洗； 优选地，所述超声清洗的时间为2~5min。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述碳化处理前对贴至基底电极表面的蛋壳膜进行干燥处理； 优选地，所述干燥处理具体为在烘箱内由室温开始以2~5min内温度上调3~5°C的速率上调至60~80°C，整个干燥过程持续4~5h ; 优选地，所述碳化处理在马弗炉中进行； 优选地，所述碳化处理的温度为500~1000°C ； 优选地，所述碳化处理的时间为0.01~IOh ； 优选地，所述碳化处理的升温速率为I~20°C.rniiT1 ； 优选地,所述保护性气氛为氮气、氩气、氦气、氢气和一氧化碳中的I种或至少2种的组合； 优选地，所述保护性气氛的气体流量为50~300mL/h ； 优选地，采用包埋法和/或交联法将所述纳米金属颗粒和酶同时固定化至所述碳化蛋壳膜上； 优选地，先采用电沉积将所述纳米金属颗粒沉积至所述碳化蛋壳膜上，再采用直接吸附法、共价结合法、包埋法和/或交联法将所述酶固定化至所述碳化蛋壳膜上。
9.一种酶生物传感器，包括作为工作电极的权利要求1-5任一项所述的酶电极，以及参比电极和对电极； 优选地，所述参比电极为饱和甘汞电极、氢电极、银I氯化银电极或汞I氧化汞电极，更优选为饱和甘汞电极；优选地，所述对电极为钼丝电极或碳电极。
10.如权利要求1-5任一项所述的酶电极在测定溶液中的底物浓度中的应用； 优选地，所述应用中以循环伏安和/或计时电流的方式测定溶液中的底物浓度； 优选地，所述循环伏安方式的测试电位扫描速率为25~200mV/s ； 优选地，所述底物为H2O2、葡萄糖或酚类污染物； 优选地，所述底物浓度 范围为5 μ M~IOmM ; 优选地，所述溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的I种或至少2种的组合。
【文档编号】G01N27/327GK103954669SQ201410169559
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】赵赫, 曹宏斌, 范壮军, 刘晨明 申请人:中国科学院过程工程研究所