专利名称：一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法，属于食品检测领域。
背景技术：
油脂在加工、贮藏、流通、使用等过程中，由于光、热、空气中的氧等作用常会发生酸败变质的复杂变化。一般油脂尤其是富含不饱和脂肪酸的植物油在空气中氧的作用下易氧化酸败，在氧化过程中生成过氧化物和氢过氧化物等中间产物，它们很容易分解而产生挥发性和非挥发性脂肪酸、醛、酮和醇等，这些酸败产物常具有特殊的臭气和苦涩滋味，大大影响油脂的感官性质，并且造成其营养价值大大下降。油脂中的脂质过氧化物的含量是以每千克油脂中活性氧的毫克当量即过氧化值来表示的，过氧化值是判断油脂新鲜程度和质量等级的重要标准。碘量法(GB/T 5538)是油脂过氧化值国际通用的分析方法，简单易行，在普通化验室里就可以进行，但碘量法测定过程易受多种外界因素的影响，如溶液的PH值、温度、加水量及摇动速度、滴定终点的判断等因素，使其测定值的波动性大，重复性差，所以造成该法灵敏度低，同时存在取样量大，难以适应于现代社会所提出的精确、快速、便携、现场化的食品安全检测要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法，它能快速检测食品植物油过氧化值。本发明的原理如下油脂属于低导电或非导电的、疏水性的物质，因此研究测定油脂的过氧化物成分， 就是在有机相测定有机过氧化物，就需要制备有机相过氧化物酶电极。辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP)是一种相对分子量为44000的含有铁卟啉I(X)作为强键合辅助因子的糖蛋白，HRP在室温下很稳定，且容易制得，价格便宜，是商品化较早、应用范围较广的酶制剂，被广泛地应用于酶联免疫分析和构筑生物传感器。玻碳裸电极在扫描电位范围0. 1 -0. 4V内，没有任何波峰出现，说明其对油脂中的过氧化物过氧化月桂酰既无氧化作用也无还原作用；辣根过氧化物酶电极的循环伏安图上出现了一对形状良好的氧化还原峰；并且，Nafion/MB/HRP酶电极的催化还原电流响应Δ Ipred与过氧化月桂酰的浓度 Cmp在2. 5 X ΙΟ"6 2. 3 X 范围内有较好的线性关系，所以检测出样品油的Δ Ipred，按线性回归方程式计算其过氧化物的摩尔浓度，即可再换算成植物油中的过氧化值。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现本发明一种酶电极的制备方法，它包括以下步骤a.电极预处理将玻碳电极(Glass Carbon Electrode)用Al2O3粉研磨抛光，用二次蒸馏水润湿，接着进行超声清洗处理，然后再用二次蒸馏水和丙酮冲洗除去其表面吸附物质，使其成镜面；然后将玻碳电极浸入浓度为0. 2mol/L的硫酸溶液中，用PAR 270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50m V/s,电压范围为-0. 5 +1. 5V，持续扫描lOmin，得到稳定的循环伏安图后，取出玻碳电极，然后用二次蒸馏水洗净，室温干燥后备用。b.辣根过氧化物酶Nafion膜修饰的玻碳电极的制备首先，将5%的Nafion溶液用纯甲醇稀释至0. 3%，然后用微量注射器吸取2 10 μ 1的Nafion和甲醇的混合溶液均勻地滴加到步骤a的玻碳电极的表面，然后用红外干燥器烘干蒸发掉溶剂甲醇，在电极表面形成一薄层Nafion膜，得到Nafion膜电极。其次，配制浓度为lX10_4mol/L的亚甲基蓝(MB)溶液，然后将Nafion膜电极浸入到亚甲基蓝溶液中，保持lOmin，通过离子交换，将亚甲基蓝固定到Nafion的膜电极内，得 Nafion-亚甲基蓝膜电极。然后，采用牛血清白蛋白-戊二醛交联方法固定辣根过氧化物酶(HRP)，配制均勻混合液10ml，所述混合液由下述物质组成二次蒸馏水10ml、牛血清白蛋白400mg、辣根过氧化物酶5 IOOmg以及戊二醛156mg ；准确吸取10 μ 1的混合溶液均勻滴加到上述的 Nafion-亚甲基蓝膜电极表面，在室温下放置2h，等水分蒸发后，即形成辣根过氧化物酶 Nafion膜修饰电极(Nafion/MB/HRP电极)，即得本发明的酶电极，将制备好的酶电极在4°C 温度下保存备用。优选的，所述的酶电极的制备方法，所述步骤b中选择2 10 μ 1的Nafion甲醇溶液，使酶电极的膜厚度达到1 4 μ m。优选的，所述的酶电极的制备方法，所述步骤b中选择辣根过氧化物酶的浓度为 0. 5 10mg/ml。优选的，所述的酶电极的制备方法，所述PAR 270电化学工作站包括EG & GIC83 型恒电位仪、恒电流仪、方正电脑及操作软件M270电化学软件部分。使用上述的酶电极快速检测植物油过氧化值的方法，它包括以下步骤a.标准曲线准确称取0. 398g过氧化月桂酰标准品加入到IOOml的容量瓶，用无水乙醇溶解并稀释到刻度，其浓度为1.0X10_2mOl/L，得过氧化月桂酰溶液，避光贮存备用；取0. 5ml的0. lmol/L硫酸的水溶液和Iml的1. Omol/L的氯化锂的乙醇溶液加入到电解池中，然后在电解池中加入O 575μ 1的上述过氧化月桂酰溶液，接着在电解池中加入乙醇溶液15ml，1，2 二氯乙烷5ml，再加入乙腈至电解池刻度25ml，使电解池中过氧化月桂酰的浓度为O 2. 3X 10_4mol/L。然后用PAR270电化学工作站来测定权利要求1所述的酶电极的循环伏安图，即分别记录酶电极在空白样和加入标准过氧化月桂酰溶液的循环伏安图；测试条件为，扫描速度0 0. 4V,20mv/s ；在空白样和加入标准过氧化月桂酰溶液样品中，用PAR270电化学工作站来测定权利要求1所述的酶电极的循环伏安图，分别进行三次测量并记录循环伏安图，取其测量的峰电流平均值减去空白时亚甲基兰的还原峰电流后即为过氧化月桂酰的还原响应电流值，以过氧化月桂酰的电流响应值为纵坐标，过氧化月桂酰的浓度为横坐标，得到过氧化月桂酰的电流响应值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，试验过程在25士0. 5°C下进行。b.测定
取0. 5 2g的植物油样品置于25ml的电解池中，随后加入0. 40ml的0. lmol/L 的乙醇硫酸溶液，1. Oml的1. Omol/L的乙醇氯化锂溶液和5ml的1，2 二氯乙烷，然后用乙腈稀释到最终刻度25ml，，搅拌并用N2纯化5 lOmin，用PAR 270电化学工作站来测定权利要求1所述的酶电极的循环伏安图，分别进行三次测量并记录循环伏安图，取其测量的峰电流平均值减去空白时亚甲基兰的还原峰电流后即为油样的还原响应电流值，取其还原电流响应值的平均值作为最后油样过氧化值的测定结果，按线性回归方程式计算其过氧化物的摩尔浓度，再换算成植物油中的过氧化值，得到过氧化值，此过程在25士0. 5°C下进行。本发明与现有技术相比具有的有益效果为本发明的酶电极及快速检测植物油过氧化值的方法在灵敏度和精确性方面优于传统的碘量滴定法，其检测下限可达亚微摩尔的水平。并且，酶电极电化学分析法由于响应时间短，可快速完成对样品的检测，因此可实现现场快速检测。而且酶电极电化学分析法中修饰电极由于可以固定化和修饰电活性物质，有效地提高了其选择性、可以有效消除其他物质的干扰，成为近年来的研究热点，在食品检测中应用越来越多。所以本发明的酶电极及快速检测植物油过氧化值的方法灵敏度高、选择性好、精确度高、响应时间短，是一种简捷快速、方便易行的过氧化值测定方法，具有实现自动化测定的潜力，在食品检测领域将会发挥重要的作用。
图1表示玻碳裸电极在3. OX 10_5mol/L过氧化月桂酰溶液中的循环伏安图。图2表示HRP酶电极在空白溶液中的循环伏安3表示HRP酶电极在3. OX 10_5mol/L过氧化月桂酰的溶液中的循环伏安4表示HRP酶电极对过氧化月桂酰的催化还原电流与浓度的标准曲线
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。如图所示，图1表示玻碳裸电极在3. OX 10_5mOl/L过氧化月桂酰溶液中的循环伏安图。横坐标为电压，纵坐标为电流，玻碳裸电极在扫描电位范围0. 1 -0.4V内，没有任何波峰出现，说明其对过氧化月桂酰既无氧化作用也无还原作用。图2表示HRP酶电极在空白溶液中的循环伏安图。横坐标为电压，纵坐标为电流， Nafion/MB/HRP酶电极在空白溶液中的循环伏安图上出现了一对形状良好的氧化还原峰， 这说明亚甲基蓝能有效地在HRP和电极表面传递电子。图3表示HRP酶电极在3. OX 10_5mol/L过氧化月桂酰的溶液中的循环伏安图。横坐标为电压，纵坐标为电流，当溶液中含3. 0 X 10_5mOl/L的过氧化月桂酰时，其还原峰电流与空白溶液时相比增加了 40%，说明过氧化月桂酰的存在会使还原峰电流增大，而且随着过氧化月桂酰浓度的增加，其还原峰电流会继续增大。图4表示HRP酶电极对过氧化月桂酰的催化还原电流与浓度的标准曲线。横坐标为过氧化月桂酰的浓度，纵坐标为电流，HRP酶电极的催化还原电流响应Δ Ipred与过氧化月桂酰的浓度Cuip在2. 5X ΙΟ"6 2. 3X IO-4M范围内有较好的线性关系。实施例1
大豆油过氧化值的测定1、酶电极的制备方法a.电极预处理将玻碳电极(Glass Carbon Electrode)用Al2O3粉研磨抛光，用二次蒸馏水润湿， 接着进行超声清洗处理，然后再用二次蒸馏水和丙酮冲洗除去其表面吸附物质，使其成镜面；然后将玻碳电极浸入浓度为0. 2mol/L的硫酸溶液中，用PAR 270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50m V/s,电压范围为-0. 5 +1. 5V，持续扫描lOmin，得到稳定的循环伏安图后，取出玻碳电极，然后用二次蒸馏水洗净，室温干燥后备用。b.辣根过氧化物酶Nafion膜修饰的玻碳电极的制备首先，将5%的Nafion溶液用纯甲醇稀释至0. 3 %，然后用微量注射器吸取5 μ 1 的Nafion和甲醇的混合溶液均勻地滴加到步骤a的玻碳电极的表面，然后用红外干燥器烘干蒸发掉溶剂甲醇，在电极表面形成一薄层Nafion膜，得到Nafion膜电极。其次，配制浓度为IX 10_4mol/L的亚甲基蓝(MB)溶液，然后将Nafion膜电极浸入到亚甲基蓝溶液中，保持lOmin，通过离子交换，将亚甲基蓝固定到Nafion的膜电极内，得 Nafion-亚甲基蓝膜电极。然后，采用牛血清白蛋白-戊二醛交联方法固定辣根过氧化物酶(HRP)，配制均勻混合液10ml，所述混合液由下述物质组成二次蒸馏水10ml、牛血清白蛋白400mg、辣根过氧化物酶70mg以及戊二醛156mg ；准确吸取10 μ 1的混合溶液均勻滴加到上述的 Nafion-亚甲基蓝膜电极表面，在室温下放置池，等水分蒸发后，即形成辣根过氧化物酶 Nafion膜修饰电极(Nafion/MB/HRP电极)，即得本发明的酶电极，将制备好的酶电极在4°C 温度下保存备用。2、用酶电极快速检测大豆油过氧化值a.标准曲线准确称取0. 398g过氧化月桂酰标准品加入到IOOml的容量瓶，用无水乙醇溶解并稀释到刻度，其浓度为ι. οX 10-2mol/L，得过氧化月桂酰溶液，避光贮存备用。取0. 5ml的0. lmol/L硫酸的水溶液和Iml的1. Omol/L的氯化锂的乙醇溶液加入到电解池中，然后在电解池中分别加入0，75 μ 1，125 μ 1，225 μ 1，375 μ 1，500 μ 1， 575 μ 1的上述过氧化月桂酰溶液，接着在电解池中加入乙醇溶液15ml，1，2 二氯乙烷5ml， 再加入乙腈至电解池刻度25ml，使电解池中过氧化月桂酰的浓度为0，3.0X10_5mol/L， 5. OX l(T5mol/L，9. OX l(T5mol/L，1· 5 X 10、ol/L，2. OX l(T4mol/L，2. 3 X l(T4mol/L。然后用PAR 270电化学工作站来测定酶电极的循环伏安图，即分别记录酶电极在空白样和加入标准过氧化月桂酰溶液的循环伏安图；测试条件为，扫描速度0 0. 4V,20mv/s ；在空白样和加入标准过氧化月桂酰溶液样品中，用PAR 270电化学工作站来测定酶电极的循环伏安图，分别进行三次测量并记录循环伏安图，取其测量的峰电流平均值减去空白时亚甲基兰的还原峰电流后即为过氧化月桂酰的还原响应电流值，以过氧化月桂酰的电流响应值为纵坐标，过氧化月桂酰的浓度为横坐标，得到过氧化月桂酰的电流响应值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线(如图4所示)及线性回归方程式，Δ Ipred = 0. 0155XCLHP+0. 091此处，Δ Ipred为Nafion/MB/HRP酶电极对过氧化月桂酰的催化还原电流(为酶电极对一定浓度的过氧化月桂酰溶液的还原峰电流减去酶电极对空白溶液时的还原峰电流)，μ A ;CLHp为过氧化月桂酰或其它过氧化物的浓度，μ mol/L ；相关系数R2 = 0. 996。试验过程在25 士 0.5 °C下进行。b.测定取1. 6g大豆油置于25ml的电解池中，随后加入0. 40ml的0. lmol/L的乙醇硫酸溶液，1. Oml的1. Omol/L的乙醇氯化锂溶液和5ml的1，2 二氯乙烷，然后用乙腈稀释到最终刻度25ml，搅拌并用N2纯化8min，用PAR 270电化学工作站来测定酶电极的循环伏安图， 分别进行三次测量并记录循环伏安图，取其测量的峰电流平均值减去空白时亚甲基兰的还原峰电流后即为油样的还原响应电流值，取其还原电流响应值的平均值作为最后油样过氧化值的测定结果，按线性回归方程式计算其过氧化物的摩尔浓度，再换算成植物油中的过氧化值，得到过氧化值，此过程在25士0. 5°C下进行。为了验证该方法的有效性，同时利用标准碘量法分析测定同一大豆油样。每个油样的分析测定重复三次，取其平均值作为最后油样过氧化值的测定结果。表1 Nafion/MB/HRP酶电极法和标准碘量法分析大豆油样品过氧化值的结果比较
权利要求
1.一种酶电极的制备方法，其特征是，它包括以下步骤a.电极预处理将玻碳电极(Glass Carbon Electrode)用Al2O3粉研磨抛光，用二次蒸馏水润湿，接着进行超声清洗处理，然后再用二次蒸馏水和丙酮冲洗除去其表面吸附物质，使其成镜面；然后将玻碳电极浸入浓度为0. 2mol/L的硫酸溶液中，用PAR 270电化学工作站进行循环伏安法扫描处理，扫描速度为50m V/s,电压范围为-0. 5 +1. 5V，持续扫描lOmin，得到稳定的循环伏安图后，取出玻碳电极，然后用二次蒸馏水洗净，室温干燥后备用；b.辣根过氧化物酶Nafion膜修饰的玻碳电极的制备首先，将5%的Nafion溶液用纯甲醇稀释至0. 3%，然后用微量注射器吸取2 10 μ 1 的Nafion和甲醇的混合溶液均勻地滴加到步骤a的玻碳电极的表面，然后用红外干燥器烘干蒸发掉溶剂甲醇，在电极表面形成一薄层Nafion膜，得到Nafion膜电极；其次，配制浓度为lX10_4mol/L的亚甲基蓝(MB)溶液，然后将Naf ion膜电极浸入到亚甲基蓝溶液中，保持lOmin，通过离子交换，将亚甲基蓝固定到Nafion的膜电极内，得 Nafion-亚甲基蓝膜电极；然后，采用牛血清白蛋白-戊二醛交联方法固定辣根过氧化物酶(HRP)，配制均勻混合液10ml，所述混合液由下述物质组成二次蒸馏水10ml、牛血清白蛋白400mg、辣根过氧化物酶5 IOOmg以及戊二醛156mg ；准确吸取10 μ 1的混合溶液均勻滴加到上述的 Nafion-亚甲基蓝膜电极表面，在室温下放置池，等水分蒸发后，即形成辣根过氧化物酶 Nafion膜修饰电极(Nafion/MB/HRP电极)，即得本发明的酶电极，将制备好的酶电极在4°C 温度下保存备用。
2.根据权利要求1所述的酶电极的制备方法，其特征是，所述步骤b中选择2 10μ 1 的Nafion和甲醇的混合溶液，使酶电极的膜厚度达到1 4 μ m。
3.根据权利要求1所述的酶电极的制备方法，其特征是，所述步骤b中选择辣根过氧化物酶的浓度为0. 5 10mg/ml。
4.根据权利要求1所述的酶电极的制备方法，其特征是，所述PAR270电化学工作站包括EG&G M283型恒电位仪、恒电流仪、方正电脑及操作软件M270电化学软件部分。
5.使用权利要求1所述的酶电极快速检测植物油过氧化值的方法，其特征是，它包括以下步骤a.标准曲线准确称取0. 398g过氧化月桂酰标准品加入到IOOml的容量瓶，用无水乙醇溶解并稀释到刻度，其浓度为1.0X10_2mOl/L，得过氧化月桂酰溶液，避光贮存备用；取0. 5ml的0. lmol/L硫酸的水溶液和Iml的1. Omol/L的氯化锂的乙醇溶液加入到电解池中，然后在电解池中加入O 575μ 1的上述过氧化月桂酰溶液，接着在电解池中加入乙醇溶液15ml，1，2 二氯乙烷5ml，再加入乙腈至电解池刻度25ml，使电解池中过氧化月桂酰的浓度为O 2. 3X 10_4mol/L，然后用PAR 270电化学工作站来测定权利要求1所述的酶电极的循环伏安图，即分别记录酶电极在空白样和加入标准过氧化月桂酰溶液的循环伏安图；测试条件为，扫描速度0 0. 4V,20mv/s ；在空白样和加入标准过氧化月桂酰溶液样品中，用PAR 270电化学工作站来测定权利要求1所述的酶电极的循环伏安图，分别进行三次测量并记录循环伏安图，取其测量的峰电流平均值减去空白时亚甲基兰的还原峰电流后即为过氧化月桂酰的还原响应电流值，以过氧化月桂酰的电流响应值为纵坐标，过氧化月桂酰的浓度为横坐标，得到过氧化月桂酰的电流响应值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，试验过程在25士0.5°C下进行；b.测定取0. 5 2g的植物油样品置于25ml的电解池中，随后加入0. 40ml的0. lmol/L的乙醇硫酸溶液，1. Oml的1. Omol/L的乙醇氯化锂溶液和5ml的1，2 二氯乙烷，然后用乙腈稀释到最终刻度25ml，搅拌并用&纯化5 lOmin，用PAR 270电化学工作站来测定权利要求 1所述的酶电极的循环伏安图，分别进行三次测量并记录循环伏安图，取其测量的峰电流平均值减去空白时亚甲基兰的还原峰电流后即为油样的还原响应电流值，取其还原电流响应值的平均值作为最后油样过氧化值的测定结果，按线性回归方程式计算其过氧化物的摩尔浓度，再换算成植物油中的过氧化值，得到过氧化值，此过程在25士0. 5°C下进行。
全文摘要
本发明属食品检测领域，具体涉及一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法，它包括选用玻碳电极，先制备Nafion-亚甲基蓝膜电极，然后采用牛血清白蛋白-戊二醛交联方法固定辣根过氧化物酶，得到最终辣根过氧化物酶电极，然后用该电极快速检测植物油的过氧化值。该方法灵敏度高、选择性好、精确度高、响应时间短、干扰少，优于传统的碘量滴定法，是一种简捷快速、方便易行的过氧化值测定方法，具有实现自动化现场测定的潜力。
文档编号G01N27/416GK102435650SQ201110392099
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月1日 优先权日2011年12月1日
发明者任媛媛, 李书国, 石亚丽, 薛文通, 袁涛 申请人:河北科技大学