专利名称：一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用。
背景技术：
血栓性疾病(thrombotic disease, TD)危害心、脑、肺的血管系统,造成急性心肌梗塞、脑梗塞、脑血栓形成、肺动脉栓塞、肢体静脉血栓等疾病。目前临床上用于血栓预防和治疗的药物主要分为3类:抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物。现有溶栓药物还存在缺乏特异性、出血副作用强、药剂量难以控制、半衰期短、易出现再栓塞等问题。方格星虫(Sipunculus nudus)是一种海洋底栖无脊椎动物,隶属于星虫动物门(Sipuncula),方格星虫纲(Sipunculida),星虫科,方格星虫属动物。生活在沿海滩涂一带沙泥底质的海域，涨潮时钻出，退潮时潜伏在沙泥洞中，俗称沙虫、光裸星虫、沙肠子。已报导的大约有300种隶属为全球分布种类，在我国沿海均有分布。星虫有较高药用功效和食疗价值。它性寒，味甘、咸，有滋阴降火、清肺补虚之功效。星虫体内富含多种活性物质，具有抗击疲劳、延缓衰老、增强免疫力、滋阴降火以及清肺化痰等功效。国内外对方格星虫的研究主要集中在形态解剖学特征、繁殖生物学及生理生化等方面。关于星虫纤溶酶相关专利有李肖肖、雷丹青等从方格星虫中提取的纤溶酶(专利号:CN101892210A)其分子量在27_35kDa之间。牛荣丽、唐景财廖共山等从革囊星虫内脏中提取出具有激酶和直接溶解纤维蛋白活性的纤溶酶(专利号:CN102002488A)其分子量在28-32kDa 之间。
发明内容
本发明的一个 目的是提供一种方格星虫纤溶酶。本发明提供的方格星虫纤溶酶，为具有如下I)或2)特征的纤溶酶:1)其分子量为 20KDa-25KDa ;2)等电点为 3.0-3.5。上述方格星虫纤溶酶，为具有如下I)或2)特征的纤溶酶:I)其分子量为24917Da ；
2)等电点为3.211。本发明的另一个目的是提供一种制备上述方格星虫纤溶酶的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:I)将离体的方格星虫内脏依次进行匀浆、盐析，收集盐析产物；2)将所述盐析产物依次经离子交换柱层析和凝胶柱层析，得到方格星虫纤溶酶。上述方法中，所述离子交换柱层析为阴离子交换柱层析；所述阴离子交换柱层析为将所述盐析产物流经阴离子交换柱，用含0.1-1M NaCl的浓度为0.02M、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，检测阴离子交换柱洗脱产物活性，收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物；所述线性洗脱的时间为20h，所述线性洗脱的流速为0.5mL/min ;所述阴离子交换柱具体为DEAE-S^harose FF,030X400mm；所述凝胶柱层析为将所述阴离子交换柱洗脱产物流经葡聚糖凝胶柱，用浓度为
0.02M、pH值为7.5的PBS缓冲液洗脱，检测葡聚糖凝胶柱洗脱产物活性，收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物；所述洗脱的时间为6h，所述洗脱的流速为lmL/min ;所述葡聚糖凝胶柱具体为 Sephadex G-50, 016X600mm。所述检测洗脱产物活性采用的方法具体为纤维素蛋白平板检测，若形成透明圈，则有活性。上述收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物为每IOmin收集一管洗脱产物，收集第45-50管洗脱产物；上述收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物为每IOmin收集一管洗脱产物，收集第18-22管洗脱产物。上述方法中，步骤2)中，在所述离子交换柱层析步骤前，还包括将所述盐析产物溶解后透析除盐的步骤；所述溶解采用的PH值为7.5、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液。在所述阴离子交换柱层析中，在所述检测阴离子交换柱洗脱产物活性的步骤前还包括:将线性梯度洗脱的产物透析除盐的步骤；在所述凝胶柱层析中，在收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物的步骤后还包括:将所述具有活性的凝胶柱层析洗脱产物透析除盐、干燥，得到方格星虫纤溶酶的步骤。上述方法中，所述透析采用截留分子量为IOkDa的透析袋。上述干燥为冷冻干燥。上述方法中，步骤 1)，所述匀浆为将所述方格星虫的内脏与pH为7.5、浓度为
0.02mol/L的磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A ;所述盐析包括如下步骤:A、向所述上清液A加入硫酸铵至质量百分含量为30%,混匀、静置、离心收集上清液B ；B、向所述上清液B中加入硫酸铵至质量百分含量为70%,混匀、静置、离心,收集沉淀，得到盐析产物。上述方法中，所述方格星虫的内脏与所述磷酸缓冲液的配比为250g:1L ；所述匀浆在0_4°C条件下进行；所述匀浆具体在0°C条件下进行；所述静置均为4_10°C静置2_8h,所述静置均具体为4°C静置2h ；所述离心均为在4_10°C、离心力为4000-8000g下离心10_30min ;所述离心均具体为在4°C、离心力为5000g下离心lOmin。由上述的方法制备得到的方格星虫纤溶酶也是本发明保护的范围，所述方格星虫纤溶酶分子量具体为24917Da、等电点具体为3.211。上述的方格星虫纤溶酶在降解纤维蛋白原中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明提供的方法，可以从方格星虫中提取纤溶酶，且该纤溶酶的分子量为24917Da、等电点为3.211 ;与目前现有的纤溶酶相比，分子量小，具有直接降解或通过激活纤溶酶原降解纤维蛋白原(血栓)的激酶活性，由于其具有更小的分子量，更容易进行蛋白表达，也更易于制备预防和治疗由血栓引起的相关疾病的药物。
图1为SDS-PAGE测方格星虫纤溶酶SNF分子量图2为MALD1-T0F/MS测方格星虫纤溶酶SNF分子量图3为等点聚焦测定方格星虫纤溶酶SNF的等电点图4为标准和加热琼脂糖纤维蛋白平板
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、方格星虫纤溶酶的制备1、匀浆取2kg活方格星虫(购买自厦门水产市场)，洗净解剖，取250g内脏，加入ILρΗ7.5 的 0.02mol/L 磷酸缓冲液(PBS) (PBS 配方:NaCll.169g、KC10.2g、Na2HP043.63g、KH2PO40.24g和水混合，调节pH值为ρΗ7.5)，冰浴匀浆((TC )，然后5000g，4°C离心lOmin，收集上清液A。2、盐析在上述上清液A中加入硫酸铵至其质量百分含量为30%，混匀后4°C静置2h，5000g，4°C离心IOmin收集上清液B ;再向上清液B中加入硫酸铵至终浓度为70% (质量百分含量)，混匀后4°C静置2h，5000g，4°C离心IOmin收集沉淀为盐析产物。
3、纯化I)阴离子交换柱层析向上述沉淀加入pH7.5,0.02mol/L的PBS缓冲液溶解，用截留分子量为IOkDa的
透析袋透析除盐，得到透析后产物。将上述透析后产物经阴离子交换柱DEAE-S印harose FF (上海宝曼生物科技有限公司，玻璃层析柱030x400mm)进行线性梯度洗脱，洗脱缓冲液为含0.1-1M NaCl的0.02M,PH7.8的Tris-HCl缓冲液；洗脱时NaCl的初始浓度为0.1M，在20h (洗脱总时间)达到1M，流速为0.5mL/min,每IOmin收集一管,分光光度仪在280nm检测多肽特征吸收峰,合并第45-50管单个峰样品，再经截留分子量为IOkDa的透析袋透析除盐，采用纤维素蛋白平板检测峰活性(方法可见实施例2所示)，形成透明圈为活性峰，收集活性峰对应的样品。2)凝胶柱层析将上述活性峰对应的样品经葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50 (GE HealthcareBioscience，货号:17-0043-01，玻璃层析柱016 X 6(J0mm)进行分离，以 0.02M，pH7.5 的 PBS缓冲液洗脱，流速为lmL/min,每IOmin收集一管,洗脱总时间为6h ;分光光度仪在280nm检测多肽特征吸收峰，合并第18-22管单个峰样品单个峰样品，采用纤维素蛋白的平板(方法可见实施例2所示)检测峰活性(若形成透明圈，则为活性峰。)，收集活性峰对应的样品，(凝胶柱层析溶液盐浓度低可直接测活性)再将活性峰对应的样品经截留分子量为IOkDa透析除盐后冷冻干燥，-20°C保存备用，得到纤溶酶SNF。实施例2、方格星虫纤溶酶的鉴定1、纤溶酶的分子量、等电点鉴定I) Native-Page 电泳检测
将实施例1得到的纤溶酶样品和2X样品溶解液(1.0%溴酚蓝0.5ml, Tris-HCl(0.5mol/L，pH6.8) 2.5mL，50% 甘油 2.5mL)混合，用 10% (m/V)分离胶，5% (m/V)浓缩胶的Native-Page检测,结果实施例1得到的纤溶酶为单一电泳条带的纤溶酶。2)纤溶酶的酶纯度将实施例1得到的纤溶酶样品和2 X样品溶解液(10%SDS4.0mL, 1.0%溴酚蓝0.5ml, Tris-HCl (0.5mol/L, ρΗ6.8) 2.5mL, 50% 甘油 2.5mL, β -巯基乙醇 1.0mL)混合，于100°C加热3min，使蛋白质变性，用12% (m/V)分离胶，5% (m/V)浓缩胶的SDS-PAGE进行酶纯度检测，结果如图1所示，为分子量约为25kDa的单一电泳条带(箭头所示)。3)纤溶酶的分子量酶解:将实施例1得到的纤溶酶放入Eppendorf管中，每管加入200-400 μ LIOOmmoI/L NH4HC03/30%ACN 脱色，冻干后加入 5 μ L2.5-lOng/ μ L 测序级Trypsin(Promega)溶液(酶与被分析蛋白质质量比一般为1: 20-1: 100),37°C反应过夜，20小时左右；吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入100 μ L60%ACN/0.1%TFA,超声15分钟，合并前次溶液，冻干；用Ziptip (millipore)进行脱盐,得到脱盐产物。再将上述脱盐产物与5mg/mLHCCA基质1:1混合后，用4800串联飞行时间质谱仪(4800Plus MALDI T0F/T0FTM Analyzer) (Applied Biosystems, USA)进行质谱分析，测定纤溶酶的分子量。激光源为355nm波长的Nd = YAG激光器，加速电压为2kV。结果如图2所示，实施例1得到的纤溶酶的大小为24917Da。4)纤溶酶的等电点采用等点聚焦测 定(B10-RAD公司PROTEAN IEF Cell)实施例1得到的纤溶酶的等电点，结果如图3所示，可以看出，实施例1得到的纤溶酶等电点为3.211。2、方格星虫纤溶酶的活性鉴定采用纤维蛋白平板法测定纤溶酶的酶活，具体方法如下:在直径9cm的平皿中加入生理盐水配制的ImL的凝血酶(美国Sigma, T-4648,1000U, 10U/mL)，然后加入6mL0.5% (质量百分含量)的纤维蛋白原溶液(由溶质和溶剂组成；溶质为牛纤维蛋白原购自美国Sigma产品编号F8630，溶剂为0.02M，pH7.5的PBS缓冲液)，再加入2% (质量百分含量)琼脂糖水溶液6mL，快速晃匀，室温(25°C)静置60min，得到纤维蛋白平板。制成的平板分两组，一组不加热，一组加热。加热的平板为在85°C加热30min(灭活纤维蛋白原中的纤溶酶原)。用打孔器分别在两组平板上打直径3mm孔，分别加入IOuL方格星虫纤溶酶SNF溶液(由实施例1得到的纤溶酶SNF溶解在0.02M，pH7.5的PBS缓冲液中，且纤溶酶SNF的蛋白浓度经BCA蛋白含量测定试剂盒检测为301.8ug/mL)入孔，37°C保温18h，用游标卡尺测量纤溶圈横纵直径，以尿激酶标准品为对照。以尿激酶标准品(美国Sigma产品编号U0633)浓度为横坐标，不同浓度尿激酶溶圈横纵直径积为纵坐标作图(标曲函数式:Y=2.5892Χ-3.9728，R2=0.9959)。纤溶酶的酶活力单位为将纤溶酶的横纵纤溶圈直径乘积按尿激酶标准曲线查出酶活力单位。结果如图4所示。采用BCA蛋白含量测定试剂盒进行纤溶酶的蛋白含量为301.8ug/mL (每ml方格星虫纤溶酶SNF溶液中蛋白含量)；纤溶酶比活力为上述测定的酶活力单位与蛋白含量的比，纤溶酶(SNF)的比活力为 13674U/mg 蛋白。上述结果进一步证明，实施例1得到的为纤溶酶。`
权利要求
1.一种方格星虫纤溶酶，为具有如下I)或2)特征的纤溶酶:1)其分子量为20KDa-25KDa ;2)等电点为 3.0-3.5。
2.根据权利要求1所述的方格星虫纤溶酶，其特征在于:所述方格星虫纤溶酶，为具有如下I)或2)特征的纤溶酶:1)其分子量为24917Da ；2)等电点为3.211。
3.一种制备权利要求1或2所述方格星虫纤溶酶的方法，包括如下步骤: 1)将离体的方格星虫内脏依次进行匀浆、盐析，收集盐析产物； 2)将所述盐析产物依次经离子交换柱层析和凝胶柱层析，得到方格星虫纤溶酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述离子交换柱层析为阴离子交换柱层析； 所述阴离子交换柱层析为将所述盐析产物流经阴离子交换柱，用含0.1-1M NaCl的浓度为0.02M、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，检测阴离子交换柱洗脱产物活性，收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物；所述线性洗脱的时间为20h，所述线性洗脱的流速为0.5mL/min ； 所述凝胶柱层析为将所述阴离子交换柱洗脱产物流经葡聚糖凝胶柱，用浓度为0.02M、PH值为7.5的PBS缓冲液洗脱，检测葡聚糖凝胶柱洗脱产物活性，收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物；所述洗脱的时间为6h，所述洗脱的流速为lmL/min ； 所述检测洗脱产物活性采用的方法具体为纤维素蛋白平板检测。
5.根据权利要求4所述的方法，包括如下步骤: 所述阴离子交换柱为DEAE-Sepharose FF ； 所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex G_50。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于: 步骤2)中，在所述离子交换柱层析步骤前，还包括将所述盐析产物透析除盐的步骤；在所述阴离子交换柱层析中，在所述检测阴离子交换柱洗脱产物活性的步骤前还包括:将线性梯度洗脱的产物透析除盐的步骤； 在所述凝胶柱层析中，在收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物的步骤后还包括:将所述具有活性的凝胶柱层析洗脱产物透析除盐、干燥，得到方格星虫纤溶酶的步骤； 所述透析具体采用截留分子量为IOkDa的透析袋。
7.根据权利要求3— 6中任一所述的方法,其特征在于: 步骤I )，所述匀浆为将所述方格星虫的内脏与PH为7.5、浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A ； 所述盐析包括如下步骤: A、向所述上清液A加入硫酸铵至质量百分含量为30%，混匀、静置、离心收集上清液B; B、向所述上清液B中加入硫酸铵至质量百分含量为70%，混匀、静置、离心，收集沉淀，得到盐析产物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于: 所述方格星虫的内脏与所述磷酸缓冲液的配比为250g:1L ； 所述匀浆在0-4°C条件下进行；所述匀浆具体在0°C条件下进行； 所述静置均为4-10°C静置2-8h,所述静置均具体为4°C静置2h ； 所述离心均为在4-10°C、离心力为4000-8000g下离心10_30min ;所述离心均具体为在4°C、离心力为5000g下离心l0min。
9.由权利要求3-8任一所述的方法制备得到的方格星虫纤溶酶:所述方格星虫纤溶酶分子量具体为24917Da、等电点具体为3.211。
10.权利要求1或2或9所述的方格星虫纤溶酶在降解纤维蛋白原中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用。本发明提供了一种方格星虫纤溶酶的制备方法，包括如下步骤1)将方格星虫的内脏与磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A；2)向所述上清液A加入硫酸铵进行盐析，收集沉淀，即得到小分子方格星虫纤溶酶。本发明的实验证明，本发明提供的方法为从方格星虫中提取纤溶酶，且该纤溶酶的分子量为24917Da、等电点为3.211；与目前现有的纤溶酶相比，分子量小，更易于合成相关药物。
文档编号A61K38/48GK103205411SQ201310142498
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者林祥志, 马伏宁, 林汝榕, 陈水波, 杨善军, 王昭凯, 马勇, 柯秀蓉, 李惠丽 申请人:国家海洋局第三海洋研究所