专利名称：改善t细胞受体的方法
技术领域：
本发明涉及提高对给定靶肽-MHC复合物(“pMHC”)特异性给定T细胞受体(“TCR”)的亲和力和/或降低其解离速率(off-rate)的方法，包括制备具有不同于给定TCR的相应CDR2序列的α链CDR2(互补决定区2)序列和/或β链CDR2序列的多种TCR，测定所述多种TCR成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个TCR成员。
背景技术：
TCR介导T细胞特异性地识别pMHC，因此是免疫系统细胞免疫(cellular arm)功能所必须。天然TCR是免疫球蛋白超家族的一种异质二聚体细胞表面蛋白，参与介导信号转导的CD3复合物的恒定蛋白质相关。TCR存在结构相似但解剖学定位与可能的功能极为不同的αβ和γδ形式。I和II类MHC配体也是专门呈递抗原的免疫球蛋白超家族蛋白质，它们具有高度多态性的肽结合位点从而使它们在抗原呈递细胞(“APC”)表面能呈递各种排列的短肽片段。
已知另有两种蛋白质能起TCR配体的作用。(1)CD1抗原是I类MHC相关分子，其基因位于(编码)I和II类经典MHC抗原的的不同染色体上、CD1分子能以类似于常规I和II类MHC-肽复合物的方式将肽和非肽(例如，脂质、糖脂)部分呈递给T细胞。参见，例如(Barclay等，(1997)，《白血球抗原手册》(The LeucocyteAntigen Factsbook)，第二版，科学出版社)和(Bauer，(1997)，Eur J Immunol，27(6)1366-1373))。细菌超抗原是能结合II类MHC分子和TCR一亚组的可溶性毒素。(Fraser，(1989)，Nature，339 221-223)。许多超抗原对一种或两种Vbeta区段显示有特异性，而其它显示更混杂的结合。无论如何，超抗原因其能激活多克隆T细胞亚组而能诱导提高的免疫应答。
天然的异质二聚体αβ和γδ TCR的胞外部分由两条多肽组成，每条具有近膜恒定结构域和远膜可变结构域。每个恒定和可变结构域都含有链内二硫键。可变结构域含有类似于抗体互补决定区(CDR)的高度多态性环。αβTCR的CDR3主要与MHC呈递肽相互作用，αβTCR的CDR1和2主要与肽和MHC相互作用。相连的可变(V)区、多样性(D)区、连接(J)区和恒定区基因的体细胞重排(somaticrearrangement)产生了TCR可变结构域序列的多样性。
重排的V-J-C区组成功能性α和γ链TCR多肽，而β和δ链由V-D-J-C区组成。胞外恒定结构域具有近膜区和免疫球蛋白区。单独的α和δ链恒定结构域分别称为TRAC和TRDC，β链结构域由称为TRBC1和TRBC2(INGT术语)的两种不同β恒定结构域之一构成。这些β恒定结构域中有4个氨基酸改变，其中3个在用于产生展示在噬菌体颗粒上的本发明单链TCR的结构域内。这些改变均在TRBC1和TRBC2的外显子1内N4K5-＞K4N5和F37-＞Y(IMGT编号，差异TRBC1-＞TRBC2)，两种TCRβ链恒定区之间的最后一个氨基酸改变在TRBC1和TRBC2的外显子3内V1-＞E。恒定γ结构域由TRGC1、TRGC2(2x)或TRGC2(3x)中任一构成。两种TRGC2恒定结构域的区别只在于该基因外显子2所编码氨基酸的拷贝数不同。
，每种TCR胞外结构域的范围存在一定程度的不同。然而，本领域技术人员不难利用参考文献，例如《T细胞受体手册》(The T Cell Receptor Facts Book)，Lefranc和Lefranc，Publ.Academic Press，2001来确定结构域边界的位置。
可通过重组方式制备TCR。迄今为止，设计了许多构建物来制备重组TCR。这些构建物分为广范的两类，单链TCR(“scTCR”)和二聚体TCR(“dTCR”)。
展示方法颗粒展示方法主要用于鉴定具有所需性能，例如表达量、结合和/或稳定性特征提高的蛋白质。这些方法包括制备表达在核蛋白颗粒表面的蛋白质或多肽的多样性混合物或“文库”。这些颗粒具有两种关键特征，第一每种颗粒呈递一种变体蛋白质或多肽，第二编码所表达的蛋白质或多肽的遗传物质与该颗粒的遗传物质相结合。然后对该文库进行一轮或多轮选择。例如，包括使配体与突变受体的颗粒展示文库接触，鉴定哪一种突变受体与配体结合的亲和力最高。一旦选择过程完成后，分离具有所需性能的受体，为测序这些受体可扩增它们的遗传物质。
特别优选噬菌体颗粒展示技术，该技术依据细菌噬菌体颗粒能表达与它们的表面蛋白质融合的异源肽或多肽的能力。(Smith，(1985)，Science，217，1315-1317)。该方法相当常见且为本领域熟知用于展示多肽单体。然而，就天然形式的多肽结合为二聚体而言，只有抗体的噬菌体展示技术得到充分研究。
单体多肽展示有两种主要方法第一种方法(方法A)通过将编码异源肽或多肽的DNA插入载体(噬菌粒)使之与编码细菌噬菌体外被蛋白的DNA融合。然后用该噬菌粒转染细菌细胞，再用“辅助噬菌体”感染所转化的细胞使噬菌体颗粒表达展示该异源肽或多肽。辅助噬菌体的作用是由产生功能性噬菌体颗粒所需的但噬菌粒不编码的噬菌体蛋白质来源。
第二种方法(方法B)通过将编码异源肽或多肽的DNA插入完全的噬菌体基因组使之与编码细菌噬菌体外被蛋白的DNA融合。然后用该噬菌体基因组感染细菌细胞使噬菌体颗粒表达展示该异源肽或多肽。该方法具有第一种“一步”法的优点。然而，能成功包装入所得噬菌体颗粒的异源DNA序列的大小有限。适用于该方法的合适噬菌体的例子是M13、T7和λ。
(方法B)的一种改进形式包括将编码核苷酸结合结构域的DNA序列加入噬菌体基因组编码待展示异源肽的DNA中，然后再在该噬菌体基因组中加入相应的核苷酸结合位点。这导致异源肽(编码基因)与噬菌体基因组直接相连。然后将该肽/基因组复合物包装入展示异源肽的噬菌体颗粒。该方法描述于WO 99/11785。
然后回收这些噬菌体颗粒用于研究异源肽或多肽的结合性能。分离后，可回收展示该肽或多肽的噬菌体颗粒的噬菌粒或噬菌体DNA，并用PCR复制该DNA。PCR产物可用于测序给定噬菌体颗粒所展示的异源肽或多肽。
单链抗体及其片段的噬菌体展示已成为研究这些多肽的结合特性的常规方法。许多书籍论述了噬菌体展示技术和细菌噬菌体的生物学(性质)。(参见，例如，《噬菌体展示-实验室手册》(Phage Display-A Laboratory Manual)，Barbas等，(2001)，冷泉港实验室出版社)。
第二种噬菌体展示方法(方法C)依据以下事实在所需位置具有半胱氨酸残基的异源多肽可通过噬菌粒或噬菌体基因组表达为可溶形式，而导致与表面暴露位置也具有半胱氨酸残基的修饰的噬菌体表面蛋白通过此两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键而结合。WO 01/05950详细描述了利用这种替代连接方法来表达单链抗体衍生肽。
高亲和力TCRT细胞在胸腺中成熟时至少经历了两种选择机制(一般称为阳性和阴性选择)。据信，大多数或所有TCR共有某些通用性结构特征(Chothia等，Embo J，(1988)，73745-55)，这种结构特征为MHC/肽通过可变互补决定区(CDR)结合提供适合的框架。因此，大多数TCR对MHC/肽复合物可具有固有的亲和力(Chothia等，EmboJ，(1988)，73745-55)。在胸腺中，阳性选择的只是对所呈递的MHC分子之一(“自身”MHC分子)的亲和力水平最低的TCR。阴性选择的是对自身MHC分子之一的亲和力高的T细胞(Amsen和Kruisbeek，(1998)，Immunol Rev，165209-29；Sebzda等，(1999)，Annu Rev Immunol，17829-74)。
认为细胞免疫中的TCR与体液免疫中的抗体类似。抗体自身已成功用作治疗性药物(例如，赫赛汀(Herceptin))或作为靶向药物(例如，mylotarg)，并且对该领域的兴趣仍持续增长。可利用T细胞受体设计类似的方案。因此，可溶性TCR不仅可用于检测特异性TCR-pMHC相互作用，也可用作诊断方法来检测感染、或检测自身免疫疾病标记、或检测T细胞疫苗效力。可溶性TCR也可用于染色，例如染色其MHC中存在特定病毒抗原的细胞。类似地，可溶性TCR可用于将治疗药物，例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物递送给特定的抗原呈递细胞。
然而，两种因素妨碍了以此方式利用TCR。首先，迄今为止还没有建立可溶性(即，不与膜结合的)T细胞受体的常规可应用方法。第二，T细胞受体对其特异性pMHC配体的亲和力(KD为μM范围)远低于抗体(KD为nM范围)。认为TCR的这种较低亲和力是发育过程中阴性选择的结果，因此，可能无法找到对自身MHC-肽复合物具有高亲和力的TCR(Salzmann和Bachmann，Molecular Immunology，1998，3565-71)。
发明简述本发明依据以下发现，即在与给定肽-MHC结合的TCR的TCRα链CDR2序列和/或TCRβ链CDR2序列中引入突变可导致与所述pMHC相互作用的亲和力至少提高10倍和/或解离速率至少减慢10倍。由于每条α和β链含有3个CDR序列(CDR1、CDR2和CDR3)，只有CDR2序列的突变可导致TCR亲和力和/或解离速率上有如此改善出乎意料。特别出乎意料的是，由于认为CDR3区在与pMHC中肽的相互作用中起主要作用，因此曾预计CDR3序列的突变才可能是提高亲和力和/或降低解离速率最有希望的方案。
发明详述就广义而言，本发明提供一种提高对给定靶pMHC的特异性给定TCR的亲和力和/或降低其解离速率的方法，包括制备具有不同于该给定TCR的相应CDR2序列的α链CDR2序列和/或β链CDR2序列的多种TCR，测定所述多种TCR成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出对该靶pMHC的亲和力比该给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比该给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员。
本发明方法的一个实施方案包括(a)制备相对于给定TCR而言，在α链CDR2序列而非β链CDR2序列中具有突变的第一批多种TCR，(b)分别制备相对于给定TCR而言，在β链CDR2序列而非α链CDR2序列中具有突变的第二批多种TCR，(c)测定所述第一和第二批多种TCR的成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出每批中对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员，(d)测定每批中所选出成员的CDR2序列，和(e)制备各具有第一批的α链CDR2序列和第二批的β链CDR2序列的一种或多种TCR，和(f)测定步骤(e)所制备的TCR对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员。
本发明方法的另一实施方案包括(a)提供编码给定TCR的α和β链的核酸，(b)诱变所述核酸的α链CDR2序列的一个或多个密码子和β链CDR2序列的一个或多个密码子，(c)从步骤(b)的突变核酸制备相对于给定TCR而言，在α链CDR2序列的一个或多个氨基酸和β链CDR2序列的一个或多个氨基酸中具有突变的多种TCR，和(d)测定所述多种TCR的成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员。
在上述实施方案的步骤(b)中，诱变所述核酸的α链CDR2序列中多达3个连续密码子和β链CDR2序列中多达3个连续密码子，和在步骤(c)中制备相对于给定TCR而言，在α链CDR2序列中具有多达3个连续密码子和β链CDR2序列中具有多达3个连续密码子突变的多种TCR。
在本发明的优选实施方案中，选出多种TCR中对靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高50倍和/或解离速率至少慢50倍的一个或多个成员。
在本发明的另一优选实施方案中，选出多种TCR中对靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高100倍和/或解离速率至少慢100倍的一个或多个成员。
在本发明的另一优选实施方案中，选出多种TCR中对靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高500倍和/或解离速率至少慢500倍的一个或多个成员。
本发明方法的一个实施方案包括测定所选出TCR的CDR2序列和制备掺入经此测定的CDR2序列的一群TCR的额外步骤。
在本
发明内容
中，术语“与给定TCR相比，对靶pMHC的亲和力至少高x倍和/或解离速率至少慢x倍的TCR”应理解为指当用已知方法测定时，相互作用动力学已得到一种或两种所述提高。
例如，当x＝10时，如果给定TCR对靶pMHC的KD是10μM，则含突变的TCRα链CDR2序列和/或TCRβ链CDR2序列的所有选出的TCR，对靶pMHC的KD小于或等于1μM方符合此标准；当x＝10时，如果给定TCR对靶pMHC的Koff是1×10-3S-1，则含突变的TCRα链CDR2序列和/或TCRβ链CDR2序列的所有选出的TCR，对靶pMHC的Koff小于或等于1×10-4S-1才符合此标准。
测定对靶pMHC的亲和力和/或解离速率的合适方法是通过表面等离振子共振。本文的实施例6详细描述了如何进行这种测定。
含有CDR2突变的多种TCR的制备以下是一些制备多种突变TCR的方法。
这些方法分为两类(i)制备能与核蛋白结合的多种突变的TCR来形成TCR文库，其中各TCR突变体与编码它们的遗传物质之间有关，同时，这种核蛋白结合TCR文库特别适用于淘选方法来提供文库成员与某具体TCR配体，例如某pMHC结合能力的信息。然后对TCR文库中用此淘选步骤选出的几个成员进行一系列亲和力和/或解离速率评估。
(ii)制备缺乏任何结合的核蛋白的可溶性突变型TCR。这种可溶性TCR不适合于制备TCR文库，多种这些可溶性TCR中的各成员一般需要单独进行亲和力和/或解离速率评估。
本文所用的术语“可溶性TCR”应理解为指具有以下特点的任何TCR(i)缺乏其天然跨膜结构域和(ii)未与核蛋白结合和(iii)保留了与其同源pMHC结合的能力。
如同本领域技术人员所知的，可以利用IMGT编号系统通过给可变结构域残基编号来定位具体人TCRα链或人TCRβ链氨基酸序列中CDR2序列的位置。(《T细胞手册》(The T Cell Factsbook)，第二版，Lefranc和LeFranc，科学出版社，2001)。利用该系统，TCRα链和β链的CDR2序列由包括可变结构域残基56-65之间存在的所有氨基酸构成。
本领域技术人员明白，引入TCRα链CDR2序列和/或TCRβ链CDR2序列中的突变可以是一个或多个取代、缺失或插入。可采用任何合适的方法产生这些CDR2突变，包括但不限于基于聚合酶链式反应(PCR)的方法、限制性酶切克隆或不依赖于连接反应的克隆(LIC)方法。这些方法详述于许多标准分子生物学教材中。关于PCR诱变和限制性酶切克隆的其它细节见(Sambrook和Russell，(2001)，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，(第三版)，CSHL Press)。关于LIC方法的其它信息见(Rashtchian，(1995)，Curr Opin Biotechnol，6(1)30-6)。
提供了用于本发明的TCR的其它实施方案，其中TCRα链CDR2和/或TCRβCDR2链序列中的2个或多个氨基酸发生突变。
本领域技术人员已知，可通过定点诱变在各可溶性TCR的一条或两条CDR2序列中引入单点或多(点)突变来制备用于亲和力和/或解离速率评估的多种突变型TCR。
然而，这种耗时的方法不适用于制备和测试大量TCR突变体。因此，优选基于文库的方法来制备含有突变的α链CDR2序列和/或β链CDR2序列的多种TCR。本文提供的实施例详细描述了制备这种文库所需的方法。
分离含有CDR2突变的高亲和力TCR的方法在本发明的一个实施方案中，制备可溶形式的所述多种TCR，将其连续与靶pMHC接触来测定与其结合靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出具有所需亲和力和/或解离速率的TCR。
在本发明优选的实施方案中，制备多种TCR建立噬菌体展示的αβ二聚体TCR的多样性文库，其中多样性体现在所述CDR2序列中。
在本发明的其它实施方案中，制备所述多种TCR建立核糖体展示的αβ单链TCR的多样性文库，其中多样性至少体现在所述CDR2序列中。WO 2004/044004描述了在核糖体上展示单链TCR(scTCR)所需的方法。
所展示的TCR以下是通过与核蛋白结合来展示含有CDR2突变的TCR的优选TCR设计。应注意这些TCR设计同样适合用作缺乏结合的核蛋白的可溶性TCR。
所展示的dTCR在本发明的优选实施方案中，所展示的αβ二聚体TCR含有的第一多肽的序列对应于TCRα链可变结构域序列(此序列与对应于TCRα链恒定结构域胞外序列的N末端相融合)和含有的第二多肽的序列对应于TCRβ链可变结构域序列(此序列与对应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的N末端相融合)，该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中无等价物的二硫键相连，其中所述第一或第二多肽之一在其C-末端通过肽键与核蛋白(通常是噬菌体颗粒)的表面暴露的氨基酸残基相连。
在本发明的具体实施方案中，该第一和第二TCR多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间的二硫键相连，所述第一或第二多肽之一在其C-末端通过肽键与噬菌体颗粒的表面暴露氨基酸残基相连。
为形成非天然的链间二硫键，采用ImMunoGeneTics(IMGT)命名法来鉴定可突变为半胱氨酸的残基。(《T细胞受体手册》(The T cell Receptor Factsbook)，第二版，(2001)，LeFranc和Lefranc，科学出版社)。WO 03/020763详细描述了引入所述非天然的链间二硫键所需的方法和其间可存在二硫键的其它残基。
所展示的scTCR在本发明的另一实施方案中，所展示的αβscTCR多肽可以(例如)含有由对应于TCRα可变结构域序列的氨基酸序列构成的第一区段，所述氨基酸序列与对应于TCRα链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列N末端融合，由对应于TCRβ可变结构域序列的氨基酸序列构成的第二区段，所述氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列N末端融合，
连接该第一区段C末端与该第二区段N末端(或反之亦然)的接头序列，和该第一和第二链之间的二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物，该接头序列的长度和该二硫键的位置应使该第一和第二区段的可变结构域序列的相互定向基本上如同天然αβT细胞受体的。
或者，所展示的scTCR可含有由对应于TCRα可变结构域的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRβ可变结构域序列的氨基酸序列构成的第二区段，所述氨基酸序列与对应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列N末端相融合，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列，或可含有由对应于TCRβ可变结构域的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRα可变结构域序列的氨基酸序列构成的第二区段，所述氨基酸序列与对应于TCRα链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列N末端相融合，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。
dTCR多肽对和scTCR多肽如同可变结构域，所展示scTCR或dTCR中存在的恒定结构域胞外序列优选对应于人TCR的那些。然而，这种序列之间的氨基酸水平相符一致性无需是1∶1。相对于相应的人TCR序列的N-或C-截短，和/或氨基酸缺失和/或取代是可接受的。具体地说，因为该第一和第二区段中存在的恒定结构域胞外序列不直接参与和scTCR或dTCR结合的配体接触，它们可比天然TCR的胞外恒定结构域序列更短，或者含有取代或缺失。
存在于所展示dTCR多肽对，或所展示scTCR多肽第一区段中的恒定结构域胞外序列可含有对应于TCRα链的胞外恒定Ig结构域的序列，和/或存在于该多肽对另一成员中或第二区段中的恒定结构域胞外序列可含有对应于TCRβ链胞外恒定Ig结构域的序列。
在本发明的一个实施方案中，所展示dTCR多肽对的成员之一或者所展示scTCR多肽的第一区段对应于TCRα链的基本上所有可变结构域，所述可变结构域与TCRα链恒定结构域基本上所有胞外结构域N末端相融合；和/或该多肽对的另一成员或者第二区段对应于TCRβ链的基本上所有可变结构域，所述可变结构域与TCRβ链恒定结构域的基本上所有胞外结构域N末端相融合。
在另一实施方案中，所展示dTCR多肽对，或所展示scTCR多肽的第一和第二区段中存在的恒定结构域胞外序列对应于天然TCR的α链和β链的恒定结构域，该结构域在C末端截短从而除去了形成TCR的天然链间二硫键的半胱氨酸残基。或者用另一氨基酸残基，例如丝氨酸或丙氨酸取代那些半胱氨酸残基，从而删除了天然二硫键。此外，天然TCRβ链含有未配对的半胱氨酸残基，可以从本发明scTCR的β序列中删除该残基，或用非半胱氨酸残基取代。
在本发明的一具体实施方案中，所展示dTCR多肽对中，或者所展示scTCR多肽的第一和第二区段中存在的TCRα和β链可变结构域序列可一起对应于第一种TCR的功能性可变结构域，而dTCR多肽对中，或者scTCR多肽的第一和第二区段中存在的TCRα和β链恒定结构域胞外序列可对应于第二种TCR的那些，所述第一和第二种TCR来自同一物种。因此，dTCR多肽对中，或者scTCR多肽的第一和第二区段中存在的α和β链可变结构域序列可对应于第一种人TCR的那些序列，α和β链恒定结构域胞外序列可对应于第二种人TCR的那些序列。例如，A6 Tax sTCR恒定结构域胞外序列可用作框架，在其上融合异源α和β可变结构域。
在本发明的一具体实施方案中，所展示dTCR多肽对中，或者所展示scTCR多肽的第一和第二区段中存在的TCRα和β链可变结构域序列可一起对应于第一种人TCR的功能性可变结构域，而dTCR多肽对中，或者scTCR多肽的第一和第二区段中存在的TCRα和β链恒定结构域胞外序列可对应于第二种非人TCR的那些序列。因此，dTCR多肽对中，或者scTCR多肽的第一和第二区段中存在的α和β链可变结构域序列可对应于第一种人TCR的那些序列，α和β链恒定结构域胞外序列可对应于第二种非人TCR的那些序列。例如，小鼠TCR恒定结构域胞外序列可用作框架，在其上融合异源人α和β可变结构域。
scTCR多肽中的接头为展示scTCR，接头序列将第一和第二TCR区段连接成一条多肽链。接头序列可以如式-P-AA-P-所示，其中P是脯氨酸和AA表示其中的氨基酸是甘氨酸和丝氨酸的氨基酸序列。
为使scTCR与配体(在αβTCR的情况中是MHC-肽复合物)结合，所述第一和第二区段配对从而使其可变结构域序列的取向有利于这种结合。因此，接头应足够长可跨越第一区段C末端和第二区段N末端，或反之亦然。另一方面，应避免接头过长，以防接头N末端可变结构域序列的一端阻断或降低scTCR与靶配体的键合。
例如，当第一和第二区段中存在的恒定结构域胞外序列对应于在C末端截短的天然TCR的α和β链恒定结构域，除去了形成TCR的天然链间二硫键的半胱氨酸残基时，该接头序列连接了第一区段的C末端和第二区段的N末端。
接头序列可由，例如26-41个氨基酸，优选29、30、31或32个氨基酸，或33、34、35或36个氨基酸组成。具体的接头如式-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQ ID NO1)和-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQ ID NO2)所示，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。
链间二硫键本发明的dTCR和scTCR可以在dTCR多肽对或scTCR多肽的第一和第二区段恒定结构域胞外序列之间具有荧光二硫键。该键位于专门掺入dTCR多肽对或scTCR多肽第一和第二区段恒定结构域胞外序列中的半胱氨酸之间，可对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键，或者可以在天然TCR中没有相应部分。在一些情况中，可能需要天然和非天然二硫键。
如上所述，WO 03/020763详细描述了引入所述非天然链间二硫键和其间可存在二硫键的其它残基所需的方法。
以下核酸是制备突变TCR(dTCR对或scTCR)文库所需(a)编码dTCR多肽对一条链的核酸和(b)编码dTCR多肽对另一条链的核酸，其与编码能形成核蛋白颗粒一部分表面的蛋白质的核酸序列融合；或编码scTCR多肽的核酸，其与编码能形成核蛋白颗粒一部分表面的蛋白质的核酸序列融合。
为表达TCR(dTCR对或scTCR)，可用含有以下核酸的表达载体转化宿主细胞，(a)编码dTCR多肽对一条链的核酸和(b)编码dTCR多肽对另一条链的核酸，其与编码能形成核蛋白颗粒一部分表面的蛋白质的核酸序列融合；或编码scTCR多肽的核酸，其与编码能形成核蛋白颗粒一部分表面的蛋白质的核酸序列融合。
表达系统优选包括能表达核酸(a)和(b)的噬菌粒或噬菌体基因组载体。这些噬菌粒或噬菌体基因组载体优选是编码细菌噬菌体gIII或gVIII外被蛋白的那些载体。
培养转化的细胞表达展示TCR的核蛋白颗粒。然后可将这些颗粒用于试验来鉴定具有所需亲和力和/或解离速率特征的TCR变体。然后分离检测中具有所需特征的任何颗粒。再通过PCR扩增编码这些TCR的DNA并测序。
已知外源性多肽的高水平表达可能对宿主细胞有毒。在这些情况中，必须找到对该外源性多肽更耐受的宿主菌株，或者必须将宿主细胞的表达限制于可耐受的水平。例如(Beekwilder等，(1999)，Gene，228(1-2)23-31)报道了从噬菌体展示文库中成功地选出含有缺失或琥珀终止密码子的马铃薯蛋白酶抑制剂(PI2)的唯一突变形式。
限制宿主给定表达系统对外源性多肽的表达水平有几种方法，这些方法可能适用于限制scTCR或dTCR的一条或两条TCR链的表达水平。WO 2004/044004描述了这些方法。
宜通过在scTCR的胞外恒定结构域中引入二硫键来帮助scTCR多肽可变结构域序列在表达后的正确配对。不想受理论的束缚，据信，此新的二硫键在折叠过程中为scTCR提供了额外的稳定性，从而有助于第一和第二区段的正确配对。
也如上所述，就dTCR噬菌体展示而言，如同最终作为单体多肽展示在噬菌体上那样，dTCR多肽对的一条得到表达，而该dTCR多肽对的另一条同时表达在同一宿主细胞中表达。因为噬菌体颗粒可自我装配，该两条多肽自我结合在噬菌体上展示为二聚体。此外，在本发明该方面的优选实施方案中，恒定序列之间的二硫键有助于多肽对在结合时的正确折叠。具有链间二硫键dTCR的噬菌体展示方法的其它细节见WO 2004/044004中的实施例。
作为另一方法，可首先表达展示dTCR第一链的噬菌体，第二链多肽可在随后步骤中与所表达的噬菌体接触从而在噬菌体表面结合成为功能性dTCR。
生物淘选来鉴定含有对靶肽-MHC复合物具有高亲和力和/或慢解离速率突变CDR2序列的TCR的优选体外TCR展示方法是核糖体展示法。首先，利用上述技术构建编码突变scTCR或dTCR多肽的多样性阵列的DNA文库。然后使该DNA文库与RNA聚合酶接触以产生互补的mRNA文库。就mRNA展示技术而言，然后可任选将mRNA序列与含有嘌呤霉素结合位点的DNA序列相连。在可以翻译scTCR多肽或dTCR对第一多肽的条件下使这些遗传构建物在体外与核糖体接触。就dTCR而言，为结合两条多肽(优选在恒定结构域之间形成的二硫键的帮助下)，分别表达该多肽对的第二多肽并使之与核糖体展示的第一多肽接触。或者，可使编码TCR两条链的mRNA在翻译TCR链的条件下体外与核糖体接触从而形成展示dTCR的核糖体。然后可利用这些展示scTCR或dTCR的核糖体来筛选或在试验中鉴定具有特定改进特征的TCR变体。再分离检测中具有改进特征的任何颗粒。然后用逆转录酶将编码这些TCR的mRNA转变为互补的DNA序列。再用PCR扩增编码该DNA并测序。
本发明的scTCR或dTCR可通过，例如以下两种方法展示在核蛋白颗粒上，例如噬菌体颗粒，优选丝状噬菌体颗粒上(i)可将dTCR多肽对的一条的C-末端、或scTCR多肽的C-末端或连接两条肽之一C-末端的短肽接头的C-末端通过肽键直接连接于核蛋白颗粒的表面暴露残基。例如，所述表面暴露残基优选位于细菌噬菌体基因III或基因VIII的基因产物的N-末端；和(ii)可经引入的半胱氨酸残基将dTCR多肽对一条的C-末端、或scTCR多肽的C-末端或连接两条肽之一C-末端的短肽接头的C-末端通过二硫键连接于核蛋白颗粒的表面暴露半胱氨酸残基。例如，所述表面暴露残基仍优选位于细菌噬菌体基因III或基因VIII的基因产物的N-末端。
M13和f1是表达基因III和基因VPPP基因产物的细菌噬菌体的例子。
优选以上方法(i)。就scTCR而言，可将编码TCR的核酸与编码形成颗粒的蛋白质或可复制颗粒，例如噬菌体或细胞的表面蛋白质的核酸融合。或者，可通过核糖体翻译代表mRNA但不含终止密码子的核酸，或与嘌呤霉素RNA融合的核酸，从而使TCR保持与核糖体颗粒融合。就dTCR而言，可将编码TCR一条链的核酸与编码形成颗粒的蛋白质或可复制颗粒，例如噬菌体或细胞的细胞表面蛋白的核酸融合，和使TCR多肽对第二条链与得到的展示第一链的表达颗粒结合。两条链的恒定结构域中存在能形成链间二硫键的半胱氨酸可能有助于此二链的正确功能性结合，下文将更全面地讨论。
分离对其同源配体亲和力提高的TCR变体为测定文库成员与靶pMHC结合的亲和力和/或解离速率并选择具有所需亲和力和/或解离速率的成员，以下方法提供了本发明的具体实施方案(i)使该文库的几种成员同时与靶pMHC接触，和鉴定能与该pMHC结合的成员，(ii)使步骤(i)所鉴定的成员连续与靶pMHC接触，评估它们对该pMHC的亲和力，(iii)选择步骤(ii)中测定的具有所需亲和力的一种或多种成员，测定所展示TCR的CDR2序列，(iv)制备掺有如此测定的CDR2序列的可溶形式TCR，(vi)如情况可能再次测定和/或测定这些TCR对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，和(vii)选择步骤(vi)所测定的具有所需亲和力和/或解离速率的一种或多种TCR。
其它方面本发明方法所分离的scTCR或dTCR(优选由对应于人序列的恒定和可变序列组成)可以基本纯的形式，或作为纯化的或分离的制剂提供。例如，可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。
本发明也提供获得通过本发明方法选择的TCR的链的方法，该方法包括在能表达该链的条件下培养含编码该链核酸的宿主细胞，再纯化所述多肽链。然后如实施例5所述通过重折叠纯化的α和β来形成dTCR。
本发明各方面的优选特征与已作必要改动的其它各方面的一样。按照法律允许本文提及的现有技术文件全文纳入。
实施例以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
下文参考了以下附图，其中
图1a和2b分别显示了1G4 TCR的α和β链的DNA序列。每条链具有编码半胱氨酸残基的突变密码子。阴影部分表示这些突变密码子的位置。
图2a和2b分别显示了图1a和1b的DNA序列所编码的氨基酸序列。阴影部分表示这些引入的半胱氨酸残基的位置。
图3详细描述了噬菌粒质粒pEX746NY-ESO的全部DNA序列。
图4详细描述了pEX922-1G4质粒的DNA序列。
图5详细描述了pEX821质粒的DNA序列。
图6详细描述了pEX954质粒的DNA序列。
图7a和7b分别显示了经突变而含有其它半胱氨酸残基可以形成非天然二硫键的ILA TCRα和β链可溶形式的DNA序列。阴影部分表示突变的密码子。
图8a和8b分别显示了从图7a和7b的DNA序列产生的ILA TCRα和β链胞外氨基酸序列。阴影部分表示引入的半胱氨酸。
图9a和9b分别显示了经突变而含有其它半胱氨酸残基可形成非天然二硫键的HIV Gag TCRα和β链可溶形式的DNA序列。阴影部分表示突变的密码子。
图10a和10b分别显示了从图4a和4b的DNA序列产生的HIV Gag TCRα和β链胞外氨基酸序列。阴影部分表示引入的半胱氨酸。
实施例1-1G4 CDR2文库构建为得到含有对SLLMWITQC(SEQ ID NO3)-HLA-A*0201复合物结合亲和力提高和/或对该pMHC解离速率降低的变体的两种TCR文库，在1G4 TCR链的CDR2α和CDR2β序列中分别引入多点突变。
采用PCR扩增利用诱变的寡核苷酸(Jon342和Jon344)作为正向引物和下游完全互补的寡核苷酸作为反向引物，得到每种CDR2序列高度多样性突变体群来产生突变片段群。就CDR2α而言，随机突变了核心残基的3个(Jon342)，而对CDR2β而言，随机突变了4个残基(Jon344)。
为在随后的文库构建中引入方便的限制性内切酶位点，将得到的两种诱变的PCR片段各自连接到-附加片段上，该附加片段含有与该诱变寡核苷酸5’区域具有重叠互补性的TCR开放读框的毗邻部分。这种称为通过重叠延伸剪接(SOE)的剪接反应采用合适的侧翼正向和反向引物对在第二次PCR反应中进行。
PCR1-产生诱变的CDR2α片段38.5μl水，5μl 10×PCR缓冲液，1.5μl Jon342引物(10μM储备液)，1.5μlCDR1bRev引物(10μM储备液)，2.5ng含有1G4 TCRα和β链(pEX746NY-ESO)的模板载体，2ul dNTP(20mM混合储备液)，1μl pfu turbo聚合酶。PCR反应经2分钟95度初始变性，然后95度30秒、53度30秒和72度60秒，共进行30轮。包括72度10分钟的最后延伸步骤。将总共50μl的PCR反应液在1.4％TBE琼脂糖凝胶上进行电泳分辨，切下代表诱变产物的条带，按照生产商的使用说明用Qiagen MinElute试剂盒纯化。
图1和1b分别显示了1G4 TCR的α和β链的DNA序列。每条链具有编码半胱氨酸残基的突变密码子。阴影部分表示这些突变密码子的位置。
图2a和2b分别显示了图1a和1b的DNA序列所编码的氨基酸序列。阴影部分表示这些引入的半胱氨酸残基的位置。
图3详细描述了pEX746NY-ESO质粒的DNA序列。
PCR2-产生诱变的CDR2β片段如上所述，除了引物替换为Jon344和Yol22。
PCR3-产生CDR2α突变的重叠片段如上所述，除了引物替换为Yol13和CDR2aRev。
PCR4-产生CDR2β突变的重叠片段如上所述，除了引物替换为CDR2aFw和CDR2bRev。
PCR5-产生剪接的PCR1/PCR3 CDR2α诱变片段PCR1和PCR3的纯化的模板片段用水作1∶10稀释，将每份1μl混合入也含有以下成分的50μl PCR反应液中37μl水、5μl 10×PCR缓冲液、1.5μl Yol13引物(10μM储备液)、1.5μl cdr1bRev引物(10μM储备液)、2ul dNTP(20mM混合储备液)、1μl pfu turbo聚合酶。剪接PCR反应经2分钟95℃初始变性，然后95℃30秒、54℃40秒和72℃90秒，共进行27轮。包括72℃10分钟的最后延伸步骤。进行12次相同的PCR反应。合并12份PCR反应液，按照生产商的使用说明用Qiagen Qiaquick试剂盒纯化剪接的诱变产物。
PCR6-产生剪接的PCR2/PCR4 CDR2β诱变片段
如上所述，除了替换为PCR2和PCR4。
用NcoI和BssHII消化PCR5的诱变产物并连接入也用NcoI和BssHII消化、含有母体1G4 TCR开放读框的pEX922-1G4噬菌体展示载体中(图4详细描述了该质粒的DNA序列)，从而导致亲代CDR2α序列基序取代了大量的多样性突变体序列群。对PCR6(的产物)进行同样操作，从而用亲代序列取代了大量的多样性CDR2β突变体序列群。然而，此时所用的克隆酶是BssHII和NotI。
按照标准方法，用T4 DNA连接酶以插入物与载体之比为3∶1进行连接。
浓缩和在Qiagen MinElute柱上脱盐后，将连接的CDR2α和CDR2β突变体混合物分别用电穿孔导入TG1细胞中。
按照细胞的商业供应商(Stratagene)所提供的方案，采用每50μl电感受态细胞约300ng DNA的比例进行电穿孔。对两种文库各进行两次电穿孔。电穿孔后，将细胞重悬在含950μl预热(37℃)的SOC培养基的比色皿中使之再生，在50ml无菌试管中轻柔搅拌40分钟使之恢复。随后，将1ml恢复的细胞加入装有含100μg/ml氨苄西林和1.6％葡萄糖的50ml 2TY培养基中(每升16g Bacto-胰蛋白胨、10gBacto-酵母提取物、5g NaCl)(2TYAG)的无菌摇瓶中，即每种文库两个摇瓶。摇瓶在37℃以280rpm振荡5小时后培养液的OD600达到1-1.5。离心收集细胞，重悬于4ml/文库的2TY+20％甘油中。等份试样(250μl)在干冰上冷冻保存于-80℃。
引物Jon3425’-GTCTCACATCTCTGTTGCTTATTNNKNNKNNKCAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAG-3’(SEQ ID NO4)Jon344 5’-GCTGAGGCTGATTCATTACTCANNKNNKNNKNNKATCACTGACCAAGGAGAAGTCC-3’(SEQ ID NO5)CDR2aRev 5’-AATAAGCAACAGAGATGTGAGAC-3’(SEQ ID NO6)CDR2aFw 5’-CAGAGAGAGCAAACAAGTGGAAG-3’(SEQ ID NO7)CDR2bRev 5’-TGAGTAATGAATCAGCCTCAGC-3’(SEQ ID NO8)CDR1bRev 5’-CATATCCTGGGCACACTGCAG-3’(SEQ ID NO9)Yol13 5’-TCACACAGGAAACAGCTATG-3’(SEQ ID NO10)Yol22 5’-CATTTTCAGGGATAGCAAGC-3’(SEQ ID NO11)其中
N＝A、T、G或CK＝G或T实施例2-分离含有突变CDR2序列的高亲和力1G4 TCR从含有如实施例1所述构建的两种文库混合物的噬菌体颗粒群中分离含有突变CDR2序列的高亲和力1G4 TCR。如下，利用选择展示能结合溶液中SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的突变型1G4 TCR的噬菌体颗粒来进行初步淘选按照生产商的方案，预先洗涤链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠(Dynal M280)。为进行所有三轮选择，将浓度为1012到1013cfu的展示突变1G4 TCR的噬菌体颗粒与浓度为1×10-7M的生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物预先混合。将展示1G4 TCR的噬菌体颗粒和SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的混合物在温轻柔搅动温育1小时，用100μl链霉抗生物素蛋白包被的M280磁珠捕获与生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物结合的展示1G4 TCR的噬菌体颗粒，共进行3轮(选择)。噬菌体颗粒捕获后，用Dynal磁性颗粒浓缩器共洗涤珠6次(3次用PBS吐温20，3次用PBS)。根据已建立的方法，在最后一次洗涤后，将珠重悬在100μl新鲜制备的PBS中，使用50μl重悬珠感染新鲜制备的OD(600nm)＝0.5的10ml大肠杆菌TG1来扩增选出的噬菌体颗粒。
第三轮选择后，从板上挑出300个菌落接种于96-孔微滴定板中的100μl2TYAG中。30℃振荡过夜温育培养液。然后将2到5μl过夜培养液亚接种于100μl的2TYAG中，30℃振荡温育2到3小时或直至培养液变混浊。为用辅助噬菌体感染该细胞，用含有5×109pfu辅助噬菌体的100μl 2TYAG感染培养物，37℃温育60分钟。将5μl受感染的培养物加入200μl的2TYAG(TYAG+100μg/ml氨苄西林和50μg/ml卡那霉素)中。25℃以300rpm振荡温育这些板20-36小时。4℃，3000g离心10分钟沉淀细胞。如下通过噬菌体ELISA利用上清液来筛选高亲和力1G4 TCR突变体。
实施例3-用基础和竞争性ELISA分析展示在噬菌体颗粒上的天然和突变二硫键连接的CDR2突变型TCR的结合性能利用展示在噬菌体颗粒上的二硫键连接的天然1G4 TCR和含有突变CDR2序列的1G4 TCR进行以下基础ELISA测定来评估这些分子对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的亲和力用PBS淋洗用中性亲和素(Neutravidin)包被的Nunc-Immuno Maxisorp孔(板)。向每孔中加入25μl 5μg/ml生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物，室温培育30-60分钟，然后用PBS淋洗两次。加入PBS配制的300μl 3％脱脂奶，然后室温培育2小时以封闭孔中非特异性蛋白质结合位点。为制备展示按实施例2所述产生的突变型1G4 TCR的噬菌体颗粒，将这些噬菌体颗粒与PBS配制的3％脱脂奶混合，然后室温培育1小时。将噬菌体加入用SLLMWITQC-HLA-A*0201包被的孔，室温培育1小时，然后用含0.1％吐温20的PBS洗涤3次，再用PBS洗涤3次。在用第一抗-fd多克隆抗血清然后用和碱性磷酸酶偶联的抗-兔单克隆抗体(Sigma)的两步反应中检测所结合的展示TCR的噬菌体颗粒。
然后测定噬菌体所展示的在该基础ELISA测定中与SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物结合的TCR来特征鉴定CDR2突变的性质。对感兴趣的噬菌粒克隆进行竞争性ELISA测定来提供这些TCR对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物亲和力的进一步信息。
竞争性ELISA测定精确按照上述基础ELISA测定进行，除了为制备展示突变型1G4 TCR的噬菌体颗粒，将噬菌体颗粒与PBS配制的3％脱脂奶与100μl或200μl可溶性SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物混合，然后室温培育1小时。
对给定加入的可溶性SLLMWITQC-HLA-A*0201的结合抑制程度与TCR对SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物的亲和力成比例。
结果下表详细描述了从本实施例所述3轮淘选中得到的20个基础ELISA-阳性选中物(hit)的CDR2序列。
*-该CDR2α序列中的突变谷氨酰胺由表达谷氨酰胺的琥珀密码子编码。
下表详细描述了用基础ELISA鉴定噬菌体所展示的WT和优势突变型1G4TCR所获得的竞争性ELISA数据。除了在CDR2序列之一具有突变外，该突变型1G4 TCR还含有天然的可变结构域序列。
实施例4-利用分离的感兴趣CDR2选中物的第二代文库使实施例3竞争性ELISA测定特征鉴定的，编码在CDR2α或CDR2α序列中含有突变的高亲和力1G4 TCR的3个噬菌粒克隆进一步突变。利用这些克隆作为构建第二代文库的起始模板来进行该突变。用实施例1所述PCR方法使每个克隆中的WT CDR2序列突变来构建这些文库。
从含有如上所述构建的3种文库的混合物的噬菌体颗粒群中分离出含有双重突变的CDR2序列的高亲和力1G4 TCR。进行3轮如实施例2所述的淘选，除了所用的生物素化SLLMWITQC-HLA-A*0201的浓度是1×10-8M外。
如实施例3所述鉴定并特征分析选中物。
结果下表详细描述了从本实施例所述第二代3轮淘选中得到的20个基础ELISA-阳性选中物(hit)的序列。
发现该ELISA测定所鉴定的所有CDR2α突变体含有SVSVGM CDR2β序列。
*-这些CDR2α序列的5种中突变谷氨酰胺由表达谷氨酰胺残基的琥珀密码子编码。
**-两种这些CDR2α序列中的突变谷氨酰胺由表达谷氨酰胺残基的琥珀密码子编码。
A-表示与从实施例1-3所述第一代实验中回收的那些序列之一完全匹配的1G4 TCR序列。
下表详细描述了获得噬菌体所展示的WT和双重突变型1G4 TCR的竞争性ELISA数据。除了在两条CDR2序列中具有突变外，该突变型1G4 TCR还含有天然的可变结构域序列。
实施例5-产生含有噬菌粒的突变CDR2序列的高亲和力二硫键连接的可溶性1G4 TCR用Mini-Prep试剂盒(Qiagen，UK)从相关的大肠杆菌细胞中分离得到按实施例3所述鉴定到的编码高亲和力1G4 TCR突变体的噬菌粒DNA。
利用噬菌粒DNA作为模板和以下引物进行PCR扩增来扩增可溶性TCRα和β链DNA序列。
1G4 TCRα正向引物TRAV215-GCCGGCCATGGCCAAACAGGAGGTGACGCAGATTCCT-3(下划线处是ClaI限制性内切位点)(SEQ ID NO22)通用TCRα反向引物5-TTG TCAGTC GACTTA GAG TCT CTC AGC TGG TAC ACG-3(下划线处是SalI限制性内切位点)(SEQ ID NO23)1G4 TCRβ链正向引物TRBV6-1/2/3/5/6/7/8/95-TCACAGCGCGCAGGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAA-3(下划线处是AseI限制性内切位点)(SEQ ID NO24)通用β链反向引物5-tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc-3(下划线处是AgeI限制性内切位点)(SEQ ID NO25)
采用以下条件进行PCR50ng质粒模板，1μl的10mM dNTP，5μl的10×pfu-缓冲液，25pmol的正向引物，25pmol的反向引物，1μl pfu，总体积50μl。2分钟95℃初始变性步骤后，对反应物进行25轮变性(95℃、10秒)、退火(55℃、10秒)和延伸(72℃、2分钟)。
然后，为产生高亲和力1G4 TCR的二硫键接头物，用Agel/Asel消化β链PCR产物并克隆入用Nde/Agel切割的pEX821中(图5详细描述了该质粒的DNA序列)。用ClaI/SalI消化α链PCR产物并克隆入用ClaI/XhoI切割的pEX954中(图6详细描述了该质粒的DNA序列)。自动测序证实了该突变的可溶性1G4 TCRα和β链的DNA序列。
实施例6-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化将含有分别如实施例5制备的TCRα链和β链的表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL 12pLysS，取氨苄西林抗性单个菌落37℃在TYP(氨苄西林100μg/ml)培养基中生长至OD600为0.4，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导3小时后用Beckman J-6B(转头)4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于含有50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT，pH 8.0的缓冲液中。冻融过夜后，在Milsonix XL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头对重悬细胞进行1分钟超声裂解，共约10分钟。在Beckman J2-21离心机中以13000rpm离心30分钟回收包涵体沉淀。然后用洗涤剂洗涤3次以除去细胞碎片和膜组分。在Beckman J2-21中以13000rpm离心15分钟，每次在Triton缓冲液(50mM Tris-HCI、0.5％Triton-X100、200mM NaCI、10mMNaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0)中匀浆后沉淀包涵体。然后用以下缓冲液进行类似的洗涤除去洗涤剂和盐50mM Tris-HCl、1mMNaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0。最后，将包涵体分为30mg等份试样，于-70℃冷冻。用6M盐酸胍溶解并用Bradford染料结合试验(PerBio)测定来定量包涵体蛋白的产量。
将含约30mg TCRβ链和60mg TCRα链的溶解包涵体冷冻储备物融解，然后混合样品，将混合物稀释入15ml胍溶液(6M盐酸胍、10mM乙酸钠、10mMEDTA)中以保证链完全变性。然后将含有完全还原及变性的TCR链的胍溶液注入1升以下重折叠缓冲液中100mM Tris pH 8.5，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，5M脲，0.2mM PMSF。加入氧化还原对(2-巯基乙胺和胱胺(至终浓度分别为6.6mM和3.7mM))，约5分钟后加入变性的TCR链。溶液放置5小时±15分钟。将重折叠的TCR经Spectrapor 1膜(Spectrum；产品号.132670)10L 10mM Tris、pH 8.1于5℃±3℃透析18-20小时。然后将透析缓冲液换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)，继续在5℃±3℃透析20-22小时。
将透析的重折叠物加载到POROS 50HQ阴离子交换柱上，用Akta纯化仪(Pharmacia)以50倍以上柱体积的0-500mM NaCl梯度液洗脱所结合的蛋白质从而将sTCR与降解产物和杂质分开。将诸峰组分保存于4℃，考马斯染色SDS-PAGE分析，然后合并与浓缩。最后，用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3.5mM EDTA，0.05％乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40))预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化sTCR并特征鉴定。合并相对分子量约50kDa的洗脱峰(组分)，浓缩然后用Biacore表面等离振子共振分析进行特征鉴定。
实施例7-Biacore表面等离振子共振特征鉴定sTCR与特异性pMHC的结合利用表面等离振子共振生物传感器(Biacore 3000TM)分析了sTCR与其肽-MHC配体的结合情况。制备以半定向方式固定在链霉抗生物素蛋白包被的结合表面上的单种pMHC复合物(描述于下文)有助于该项分析，可同时有效地检测可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定在不同的流动池上)的结合情况。手动注入HLA复合物以方便地操控固定的I类分子的精确水平。
这种固定的复合物能结合T-细胞受体和辅助受体CD8αα，可将二者注射入溶液相。即使在低浓度(至少40μg/ml)也能获得TCR的特异性结合，暗示TCR较稳定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，观察到sTCR的pMHC结合性能在质量和数量上相似。这对控制可溶性sTCR的部分活性很重要，也提示生物素化pMHC复合物与非生物素化复合物活性相同。
在Biacore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析含有新链间键的1G4 sTCR与其配体/MHC复合物或无关HLA-肽混合物(制备方法如上所述)的相互作用。SPR检测在小流动池中接近传感器表面的折射指数变化，以应答单位(RU)表示，一种可用于检测受体配体相互作用并分析它们的亲和力和动力学参数的原理。通过交联于β2m上的生物素和链霉抗生物素蛋白(化学交联于流动小室的活化表面)之间的结合将各HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中来制备探针流动小室。然后使sTCR以恒定流速流过不同流动小室的表面，再测定这样做时的SPR反应来进行该试验。
测定平衡结合常数制备WT IG4 sTCR的连续稀释液，以5μl每分钟的恒定流速注入两个不同的流动小室；一个用约1000RU的特异性SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物包被，第二个用约1000RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。利用对照小室的测量值标准化每种浓度的反应。为计算平衡结合常数KD，将标准化反应数据对TCR样品的浓度作图并拟合为双曲线。(Price和Dwek，《生物化学家的物理化学中的原理与问题》(Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists)，(第二版)，1979，Clarendon Press，Oxford)。
测定动力学参数就高亲和力TCR而言，通过实验测定解离速率常数kd和结合速率常数ka来确定KD。平衡常数KD计算为kd/ka。
将TCR注入两个不同的小室中，一个小室用约300RU的特异性SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物包被，第二个小室用约300RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。流速设置为50μl/分钟。一般注入约3μM浓度的250μl TCR。然后使缓冲液流过直至反应回归至基线。用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离阶段拟合为能计算半衰期的单指数衰减方程。
结果用以上方法分析二硫键连接的可溶性天然1G4 TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201复合物之间的相互作用，证明KD为15μM，koff为1.28×10-1S-1。
下表详细描述了用以上方法获得的含突变CDR2序列的高亲和力1G4 TCR的Biacore结果
实施例8-ILA TCR CDR2文库的构建可改进以上实施例所述的方法来制备和测试含突变CDR2序列的其它TCR的高亲和力变体。简言之，将编码待突变的TCR链的DNA用作模板来制备实施例1所述的CDR2文库。唯一需要改变的是文库构建中所用的引物必须与待突变TCR链的DNA序列等价部分相互补。
这些方法已应用于制备和测试能与ILAKFLHWL(SEQ ID NO34)-HLA-A*0201 pMHC特异性结合的ILA TCR的变体。
图7a和7b分别提供了ILA TCR的可溶性变体的α和β TCR链的DNA序列(SEQ ID NO35和36)，所述序列含有天然的可变结构域和引入的半胱氨酸密码子。
图8a和8b分别提供了ILA TCR可溶性变体的α和β TCR链的氨基酸序列(SEQ ID NO37和38)，所述序列含有天然的可变结构域和引入的半胱氨酸残基。
为获得含有能与ILAKFLHWL(SEQ ID NO34)-HLA-A*0201复合物的结合亲和力提高和/或对该pMHC的解离速率降低的变体的TCR文库，可将多种突变引入ILA TCR链的CDR2α和CDR2β序列中。因为ILA TCRβ链的基础是与1G4 TCRβ链相同的TRBV6.5基因，并且这两种TCR的CDR2β区和其周围的氨基酸与DNA序列相同，故可用非常相似的引物来突变ILA TCR CDR2β序列。
用PCR扩增方法，以诱变的寡核苷酸(Jon342和Jon344的ILA TCR等价物)作为正向引物和下游完全互补的寡核苷酸作为反向引物，得到各CDR2序列的高度多样性突变体群来产生突变片段群。就CDR2α而言，随机突变核心残基的3个(Jon342的ILA TCR等价物)，而对CDR2β而言，随机突变4个残基(Jon344的ILATCR等价物)。
为了随后的文库构建导入方便的限制性内切酶位点，将得到的两种诱变的PCR片段各自连接于一附加片段，该片段含有与诱变寡核苷酸的5’区域具有重叠互补性的TCR开放读框的毗邻部分。在利用合适的侧翼正向和反向引物对的第二PCR反应中进行这种称为重叠延伸剪接(SOE)的剪接反应。
PCR1-产生诱变的CDR2α片段38.5μl水，5μl 10×PCR缓冲液，1.5μl Jon342引物的ILA TCR等价物(10μM储备液)，1.5μl CDR1bRev引物的ILA TCR等价物(10μM储备液)，2.5ng含有的ILA TCRα和β链(pEX746ILA)的模板载体，2ul dNTP(20mM混合储备液)，1μlpfu turbo聚合酶。PCR反应如下进行2分钟95度初始变性，然后95度30秒、53度30秒和72度60秒，共进行30轮。包括72度10分钟的最后延伸步骤。取总共50μl的PCR反应液在1.4％TBE琼脂糖凝胶上进行电泳，切下代表诱变产物的条带，按照生产商的使用说明用Qiagen MinElute试剂盒纯化。
PCR2-产生诱变的CDR2β片段如上所述，除了引物替换为Jon344和Yol22的ILA TCR等价物。
PCR3-产生CDR2α突变的重叠片段如上所述，除了引物替换为Yol13和CDR2aRev的ILA TCR等价物。
PCR4-产生CDR2β突变的重叠片段如上所述，除了引物替换为CDR2aFw和CDR2bRev的ILA TCR等价物。
PCR5-产生剪接的PCR1/PCR3 CDR2α诱变片段将PCR1和PCR3的纯化的模板片段用水作1∶10稀释，将每份1μl混合入也含有以下成分的50μl PCR反应液中37μl水、5μl 10×PCR缓冲液、1.5μl Yol13引物的ILA TCR等价物(10μM储备液)、1.5μl cdrlbRev引物的ILA TCR等价物(10μM储备液)、2ul dNTP(20mM混合储备液)、1μl pfu turbo聚合酶。剪接PCR反应如下进行2分钟95℃初始变性，然后95℃30秒、54℃40秒和72℃90秒，共进行27轮。包括72℃10分钟的最后延伸步骤。进行12次相同的PCR反应。合并12份PCR反应液，按照生产商的使用说明用Qiagen Qiaquick试剂盒纯化该剪接诱变产物。
PCR6-产生剪接的PCR2/PCR4 CDR2β诱变片段如上所述，除了替换为PCR2和PCR4。
用NcoI和BssHII消化PCR5的诱变产物并连接入也用NcoI和BssHII消化、含有亲代ILA TCR开放读框的pEX922-ILA噬菌体展示载体中，从而导致亲代CDR2α序列基序取代了大量的多样性突变体序列群。对PCR6(的产物)进行同样操作，从而用亲代序列取代了大量的多样性CDR2β突变体序列群。然而，此时所用的克隆酶是BssHII和NotI。按照标准方法，用T4 DNA连接酶以插入物与载体之比为3∶1进行连接。
浓缩和在Qiagen MinElute柱上脱盐后，将连接的CDR2α和CDR2β突变体混合物分别用电穿孔法导入TGI细胞。按照细胞的商业供应商(Stratagene)提供的方案，采用每50μl电感受态细胞约300ng DNA的比例进行电穿孔。两种文库各进行两次电穿孔。电穿孔后，将细胞重悬在含950μl预热(37℃)SOC培养基的比色皿中使之再生，在50ml无菌试管中轻柔搅拌40分钟使之恢复。随后，将1ml恢复的细胞加入装有含100μg/ml氨苄西林和1.6％葡萄糖的50ml2TY培养基(每升16g Bacto-胰蛋白胨、10g Bacto-酵母提取物、5g NaCl)(2TYAG)的无菌摇瓶中，即每种文库两个摇瓶。将摇瓶37℃ 280rpm振荡5小时培养液的OD600达到1-1.5。离心收集细胞，重悬于4ml/文库的2TY+20％甘油中。等份试样(250μl)在干冰上冷冻并保存于-80℃。
然后用以上实施例2和3中IG4 TCR CDR2突变体所述的方法淘选和测试以上制备的ILA TCR文库，除了用ILA TCR(ILAKFLHWL(SEQ ID NO34)HLA-A*0201)的同源pMHC进行淘选和随后的ELISA测试外。
结果
然后用实施例5和6所述方法制备含有用实施例3所述ELISA方法鉴定的CDR2突变的可溶性ILA TCR，用实施例7所述方法对这些突变体进行Biacore特征鉴定。
实施例9-高亲和力HIV Gag TCR CDR2突变体如上所述，可改进以上实施例所述的方法来制备和测试含突变CDR2序列的其它TCR的高亲和力变体。简言之，将编码待突变的TCR链的DNA用作模板来制备实施例1所述的CDR2文库。唯一需要改变的是文库构建中所用的引物必须与待突变TCR链的DNA序列的等价部分相互补。
这些方法已应用于制备和测试能与SLYNTVATL (SEQ ID NO53)-HLA-A*0201 pMHC特异性结合的亲代HIV Gag TCR的变体。
图9a和9b分别提供了ILA TCR可溶性变体的α和β TCR链的DNA序列(SEQID NO54和55)，所述序列含有天然的可变结构域和引入的半胱氨酸密码子。
图10a和10b分别提供了ILA TCR可溶性变体的α和β TCR链的氨基酸序列(SEQ ID NO56和57)，所述序列含有天然的可变结构域和引入的半胱氨酸残基。
为获得含有对SLYNTVATL(SEQ ID NO53)-HLA-A*0201复合物结合亲和力提高和/或对该pMHC解离速率降低的变体的TCR文库，可将多种突变引入亲代HIV Gag TCR链的CDR2α和CDR2β序列中。
采用PCR扩增与诱变的寡核苷酸得到各CDR2序列的高度多样性突变体群。
为了随后的文库构建导入方便的限制性内切酶位点，将得到的两种诱变的PCR片段各自连接于一附加片段，该片段含有与诱变寡核苷酸的5’区域具有重叠互补性的TCR开放读框的毗邻部分。在利用合适的侧翼正向和反向引物对的第二PCR反应中进行这种称为重叠延伸剪接(SOE)的剪接反应。
浓缩和在Qiagen MinElute柱上脱盐后，将连接的CDR2α和CDR2β突变体混合物分别用电穿孔法导入TG1细胞。按照细胞的商业供应商(Stratagene)提供的方案，采用每50μl电感受态细胞约300ng DNA的比例进行电穿孔。两种文库各进行两次电穿孔。电穿孔后，将细胞重悬在含950μl预热(37℃)SOC培养基的比色皿中使之再生，在50ml无菌试管中轻柔搅拌40分钟使之恢复。随后，将1ml恢复的细胞加入装有含100μg/ml氨苄西林和1.6％葡萄糖的50ml2TY培养基(每升16g Bacto-胰蛋白胨、10g Bacto-酵母提取物、5g NaGl)(2TYAG)的无菌摇瓶中，即每种文库两个摇瓶。将摇瓶37℃ 280rpm振荡5小时培养液的OD600达到1-1.5。离心收集细胞，重悬于4ml/文库的2TY+20％甘油中。等份试样(250μl)在干冰上冷冻并保存于-80℃。
然后用以上实施例2和3中IG4 TCR CDR2突变体所述的方法淘选和测试以上制备的HIV Gag TCR文库，除了用HIV Gag TCR(SLYNTVATL(SEQ IDNO53)HLA-A*0201)的同源pMHC进行淘选和随后的ELISA测试外。
然后制备含有所鉴定CDR2突变的二硫键连接的可溶性TCR，来对它们各自对SLYNTVATL-HLA-A*0201配体的亲和力进行Biacore测定。
结果注意所有从以上文库鉴定的高亲和力HIV Gag TCR只含有CDR2β突变。
权利要求
1.一种提高对给定靶pMHC特异的给定TCR的亲和力和/或降低其解离速率的方法，包括制备具有不同于给定TCR的相应CDR2序列的α链CDR2序列和/或β链CDR2序列，但具有与给定TCR相同的α和βCDR1和CDR3序列的多种TCR，测定所述多种TCR成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，和选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括(a)制备相对于给定TCR而言，在α链CDR2序列而非β链CDR2序列中具有突变的第一批TCR，(b)分别制备相对于给定TCR而言，在β链CDR2序列而非α链CDR2序列中具有突变的第二批TCR，(c)测定所述第一和第二批TCR的成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出每批中对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员，(d)测定每批中所选出成员的CDR2序列，和(e)制备各具有第一批的α链CDR2序列和第二批的β链CDR2序列的一种或多种TCR，和(f)测定步骤(e)所制备的TCR对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，并选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括(a)提供编码给定TCR的α和β链的核酸，(b)诱变所述核酸的α链CDR2序列的一个或多个密码子和β链CDR2序列的一个或多个密码子，(c)从步骤(b)的突变核酸制备相对于给定TCR而言，在α链CDR2序列的一个或多个氨基酸和β链CDR2序列的一个或多个氨基酸中具有突变的多种TCR，和(d)测定所述多种TCR的成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个成员。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，诱变所述核酸的α链CDR2序列中多达3个连续密码子和β链CDR2序列中多达3个连续密码子，并且在步骤(c)中制备相对于给定TCR而言，在α链CDR2序列中具有多达3个连续密码子和β链CDR2序列中具有多达3个连续密码子突变的多种TCR。
5.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，通过表面等离振子共振测定所述亲和力和/或解离速率。
6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，选出对靶pMHC的亲和力比对给定TCR至少高100倍和/或解离速率至少慢100倍的一个或多个成员。
7.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，选出对靶pMHC的亲和力比对给定TCR至少高500倍和/或解离速率至少慢500倍的一个或多个成员。
8.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，将测定了亲和力和/或解离速率(on/off rate)的TCR制备为可溶形式。
9.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其特征在于，将测定了亲和力和解离速率(on/off rate)的TCR制备为噬菌体展示的αβ二聚体TCR的多样性文库。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述噬菌体展示的αβ二聚体TCR含有第一多肽，其中，对应于TCRα链可变结构域序列的序列与对应于TCRα链恒定结构域胞外序列的N末端相融合，和第二多肽，其中，对应于TCRβ链可变结构域序列的序列与对应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中无等价物的二硫键相连，和所述第一或第二多肽之一在其C-末端通过肽键与噬菌体颗粒的表面暴露的氨基酸残基相连。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述噬菌体展示的αβ二聚体TCR含有第一多肽，其中，对应于TCRα链可变结构域序列的序列与对应于TCRα链恒定结构域胞外序列的N末端相融合，和第二多肽，其中，对应于TCRβ链可变结构域序列的序列与对应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的N末端相融合，该第一和第二TCR多肽通过取代TRAC*01的外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基或其非人等价物之间的二硫键相连，所述第一或第二多肽之一在其C-末端通过肽键与噬菌体颗粒的表面的暴露氨基酸残基相连。
12.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其特征在于，将所述多种TCR制备为核糖体展示的αβ单链TCR的多样性文库。
13.如权利要求9到12中任一项所述的方法，其特征在于，为了测定与靶pMHC结合的文库成员的亲和力和/或解离速率并选择具有所需亲和力和/或解离速率的成员(i)使该文库的几种成员同时与靶pMHC接触，鉴定与pMHC结合的成员，(ii)使步骤(i)鉴定的成员连续与靶pMHC接触，评估它们对pMHC的亲和力，(iii)选择经步骤(ii)评估的具有所需亲和力的一种或多种成员，测定所展示TCR的CDR2序列，(v)制备掺有经如此测定的CDR2序列的可溶形式的TCR，(vi)视情况再次测定和/或测定这些TCR对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，和(vii)选择步骤(vi)所测定的具有所需亲和力和/或解离速率的一种或多种TCR。
全文摘要
一种提高对给定靶pMHC特异性给定TCR的亲和力和/或降低其解离速率的方法，包括制备具有不同于给定TCR的相应CDR2序列的α链CDR2序列和/或β链CDR2序列，但具有与给定TCR相同的α和βCDR1和CDR3序列的多种TCR，测定所述多种TCR成员对靶pMHC的亲和力和/或解离速率，和选出对该靶pMHC的亲和力比给定TCR至少高10倍和/或对该靶pMHC的解离速率比给定TCR至少慢10倍的一个或多个TCR成员。
文档编号C12N15/10GK1954069SQ200580015878
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月10日 优先权日2004年5月19日
发明者S·M·邓恩, 李懿, J·M·伯尔特 申请人:阿维德克斯有限公司