专利名称：与红细胞生成素受体结合的化合物和肽的制作方法
技术领域：
本发明特别提供了结合并激活红细胞生成素受体(EPO-R)，或者，否则则作为EPO激动剂的肽和化合物。本发明涉及生物化学和药物化学领域，具体地说，提供了一种用于治疗人疾病的EPO激动剂。
背景技术：
红细胞生成素(EPO)是一种165个氨基酸的糖蛋白类激素，在第24、38、83和126位氨基酸处有4个糖基化位点，其分子量约为34,000。它在产生时最初为前体蛋白，带有23个氨基酸的信号肽。EPO可以3种形式存在α、β和脱唾液酸形式。α和β形式在糖成份上略有区别，但是具有相同的效力、生物活性和分子量。脱唾液酸形式是末端的糖(唾液酸)被去除的α或β形式。编码EPO的DNA序列已被报道过。参见本文引用参考的Lin(1987)美国专利4,703,008。
EPO促进红细胞前体细胞的有丝分裂和分化，由此确保红细胞的产生。它在以缺氧情况为主时产生于肾脏。在EPO诱导的红细胞前体细胞分化过程中，发生珠蛋白合成的诱导，并提高血红素复合物的合成以及铁蛋白受体的数量。这能使细胞吸收更多的铁并合成功能性的血红蛋白。成熟红细胞中的血红蛋白与氧结合。因此，红细胞和其中的血红蛋白在给机体供氧方面起着重要的作用。已知的这一复杂过程是由EPO与红细胞前体细胞表面相应受体之间的相互作用引发的。参见例如Graber和Krantz(1978)《药物学评论年刊》(Ann.Rev.Med)2951-66。
当人体处于健康状态，组织能够从已有的红细胞中得到足够的供氧时，EPO在血浆中的浓度很低。这一正常的低浓度足以促进对因老化而流失的红细胞的替换。
当循环系统中依靠血细胞的氧传送降低而出现缺氧情况时，循环系统中EPO量增加。缺氧可能有以下原因因出血造成的大量失血，过量辐射对红细胞的破坏，因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入减少，或者各种类型的贫血。作为对组织处于缺氧压力状态的应答，EPO将通过促进红细胞前祖细胞的增殖来增加红细胞的产生。当循环系统中红细胞的数量超过正常组织需氧量所需时，循环系统中EPO减少。
由于EPO在红细胞生成过程中至关重要，所以这一激素在诊断和治疗以红细胞生成低下或缺陷为特征的血液病中都具有潜在的用途。最近的研究为推测EPO疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病等包括β-地中海贫血(参见Vedovato等，(1984)《血液学学报》(ActaHaematol)71211-213)；囊性纤维变性(参见Vichinsky等(1984)《儿科杂志》(J.Pediatric)10515-21)；妊娠及月经疾病(参见Cotes等(1993)《英国骨病和妇科学杂志》(Brit.J.Ostet.Gyneacol)90304-311；早期早熟性贫血(参见Haga等(1983)《儿科病学报》(Acta.Pediatr.Scand.)72827-831)；脊髓损伤(参见Claus-Walker等(1984)《生理学医学康复文献》(Arch.Phys.Med.Rehabil.)65370-374)；航空病(参见Dunn等(1984)《欧洲应用生理学杂志》(Eur.J.Appl.Physiol.)52178-182)；急性失血(参见Miller等(1982)《英国血液学杂志》(Brit.J.Haematol.)52545-590)；衰老(参见Udupa等(1984)《实验室临床医学杂志》(J.Lab.Clin.Med.)103574-580和581-588，Lipschitz等(1983)《血液》(Blood)63502-509)；各种伴随异常红细胞生成的肿瘤疾病(参见Dainiak等(1983)《癌症》(Cancer)51101-1106和Schwartz等(1983)《耳鼻喉科》(Otolaryngol.)109269-272)和肾功能不全(参见Eschbach等(1987)《新英格兰医学杂志》(N.Eng.J.Med.)31673-78)。
纯化的、同源EPO已被描述过。参见Hewick美国专利4,677,195。编码EPO的DNA序列被纯化、克隆并表达，以产生具有相同生物化学和免疫学性能的合成多肽。已经生产出了所具有的寡糖与天然的相同的重组EPO。参见Sasaki等(1987)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)26212059-12076)。
尽管可以得到纯化的重组EPO，但是对EPO诱导的成红细胞增殖和分化机制知之甚少。还没有人描述过EPO与未成熟红细胞、血小板和巨核细胞的前祖细胞特殊的相互作用。这至少但不完全是由于正常成红细胞和红白血病细胞系上表面EPO受体分子较少。参见Krantz和Coldwasser《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)817574-7578；Branch等(1987)《血液》691782-1785；Mayeux等(1987)(FEBS letters)211229-233；Mufson和Gesner(1987)《(血液》691485-1490；Sakaguchi等，(1987)《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1467-12；Sawyer等(1987)《美国科学院院报》843690-3694；Sawyer等(1987)《生物化学杂志》2625554-5562和Todokoro等(1988)《美国科学院院报》844126-4130)。
放射性碘标记的EPO和细胞表面蛋白形成的交联复合物显示，细胞表面蛋白包含分子量分别约85,000和100,000道尔顿的两条多肽。最近，两种交联复合物经V8蛋白酶消化后被发现具有相同的肽片段，这表明两条结合EPO的多肽可能是相同或非常相似的基因的产物。参见Sawyer等(1988)同上。但是，大多数对细胞表面结合的研究揭示单一的一类结合位点，平均每个细胞表面300至600个，Kd约800pM(皮摩尔)。参见Sawyer等(1987)《美国科学院院报》843690-3694。但是，由输注了Friend白血病病毒贫血株(FVA)的小鼠制备的EPO-应答脾脏成红细胞显示，有一高一低解离常数分别为100pM和800pM的亲和性结合位点。参见Sawyer等(1987)《生物化学杂志》2625554-5562和Landschulz(1989)《血液》731476-1478。鼠和人EPO受体蛋白的DNA序列和编码肽序列已被描述过。参见D’Andrea等，PCT专利公开WO90/08822(公开于1990)。
EPO-R的克隆基因的可得性促进了对这种重要受体的激动剂和拮抗剂的研究。重组受体蛋白的可得性允许在多种随机和半随机的肽多样性产生系统中研究受体-配体的相互作用。这些系统包括1991年10月16日申请的美国专利申请778,233所述的“质粒上的肽”系统，1991年6月20日申请的美国专利申请718,577和Cwirla等1990年8月在《美国科学院院报》876378-6382中所述的“噬菌体上的肽”系统，1992年9月16日申请的美国专利申请946,239中所述的“编码的合成文库”系统，这是1991年9月18人的申请762,522的一个部分续展申请，和1990年3月7日的美国专利申请492,462所述的“极大规模的固定化的聚合物合成”系统；公开于1990年12月13日的PCT专利公开90/15070；1990年12月6日的美国专利申请624,120；Fodor等，1991年2月15日，《科学》(Science)251767-773；Dower和Fodor，1991《医学化学报道年刊》(Ann.Rep.Med.Chem.)26271-180；和1991年12月6日的美国专利申请805,727；以上专利公布和出版物均被本文引用参考。
但是，为了研究EPO受体介导的重要生物活性和治疗疾病，人们仍然需要一种与EPO-R结合或否则则与之反应的化合物。本发明就提供了这样一种化合物。
发明概述在实施方式之一中，本发明提供了结合并激活EPO-R受体或者否则则起EPO激动剂作用的肽。这类肽的长度为10至40或40以上个氨基酸残基，以长度为14至20个氨基酸为佳，它包含核心序列X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQID NO)，每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X6独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸或立体异构的D-氨基酸中任意一个；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，条件是X3或X8其中之一为C或Hoc。较好的是，肽具有核心序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQ IDNO)，每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X2和X6独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5可以是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，条件是X3或X8其中之一为C或Hoc。
更好的是，肽具有核心序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11(SEQID NO)，每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X1、X2、X6、X9、X10和X11独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5可以是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，条件是X3或X8其中之一为C或Hoc。
在较好的实施方式之一中，X3或X8都是C，肽因此具有核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，更好地，肽具有核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，X4可以是R或H；X5可以是F或M；X6可以是I、L、T、M或V；X7可以是D或V；X9可以是G、K、L、Q、R、S或T；X10可以是A、G、P、R或Y。在最佳实施方式中，肽具有核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，X1可以是D、E、L、N、S、T或V；X2可以是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9可以是K、R、S或T；X10是P。具体的、较好的肽包括但不限于以下肽GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；
YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKP QGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
在另一较好的实施方式中，本发明的肽被环化或二聚化。这类可被环化成C末端酰胺的肽的实例包括但不限于以下肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；
GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；YSCHFGALTWVCK；SCHFGPLTWVCK；GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；和GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG.
本发明一种二聚体的实例如下GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG||GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
根据本发明的某些实施方式，独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸或立体异构的D-氨基酸中任意一个的两个或两个以上、以2至6个为佳的氨基酸残基与上述核心序列的一个或两个末端偶合。例如，为了方便肽的合成，常常在核心序列的一个或两末端增加序列GG。本发明还提供了保留了EPO-R结合性能的以上肽及其衍生物与肽的肽模拟物的结合体。
本发明还提供了用本发明的新化合物治疗与EPO缺乏相关的疾病的方法。本发明还提供了包含一种或多种本发明化合物和药学上认可的载体的药物组合物。
图1提供了本发明方法中使用的诱变寡聚物的序列。
图2提供代表本发明肽的序列。
图3显示利用pVIII展示系统构建的一新的噬菌粒诱变文库。在此文库中，与两个半胱氨酸处一样，酪氨酸、甘氨酸-脯氨酸和苏氨酸-色氨酸残基(下划线)是固定的。半胱氨酸残基之间的其它位置(在原AF11154击中肽中以空心字体标示)利用寡聚构建法突变，使得每个氨基酸都可能以50％的频率改变为任何其它氨基酸。“X”表示随机氨基酸位置。
图4A-C显示目前构建和筛选的pIII至pVIII噬菌粒诱变文库。粗体表示的氨基酸残基是固定的，其余(以NNK表示)是随机的。4A(ON3007)和4C(ON3017)分别被设计用来研究核心序列(酪氨酸至第二半胱氨酸)N末端和C末端外部侧翼区的作用。4B(ON3016)以肽Y-CHFGPLTWVC为基础，其中酪氨酸残基与第一半胱氨酸直接相邻。该文库在核心序列相邻的两端都增加了附加的随机残基。
图5显示以GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG为基础，用新的Lac-I展示载体(“头片二聚体”(“Headpiece Dimer”))构建和筛选的诱变文库。X表示的氨基酸残基是随机的(NNK)，加下划线的是轻度突变的(91∶3∶3∶3/91∶3∶3∶3/K)，空心的是重度突变的(70∶10∶10/70∶10∶10/K)。
图6显示以TIAQYICYMGPETWECRPSPKA为基础，用新的Lac-I展示载体(“头片二聚体”)构建和筛选的诱变文库。X表示的氨基酸残基是随机的(NNK)，空心字体的是固定的，两个谷氨酸残基是轻度突变的(91∶3∶3∶3/91∶3∶3∶3/K)。
图7是选定的本发明肽的FDCP-1/hEPO-R生物测定结果图示●表示GGCRIGPITWVCGG的结果；○表示GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG的结果；■表示GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的结果；▲表示GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG的结果；表示VGNYMCHFGPITWVCRPGGG的结果；|表示GGVYACRMGPITWVCSPLGG的结果；+表示VGNYMAHMGPITWVCRPGG的结果；*表示EPO的结果。
图8是EPO(▲和◆分别表示用EPO和10,000或20,000个细胞/孔进行的测定结果)；和肽VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)(■和●分别表示用肽和10,000或20,000个细胞/孔进行的测定结果)的TF-1生物测定结果图示。
图9A(对照)，9B(用500pM EPO处理)和9C(用25毫摩尔(mm)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG处理)是放大200倍的照片，显示对经苯肼处理小鼠的代表性脾脏细胞样群进行的MTT增殖测定结果。
图10是通过与链霉亲和素的寡聚反应显示生物素酰化的肽(即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素))活性提高的FDCP-1/hEPOR生物测定结果图示。肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG和GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)表现出几乎相同的活性，但是当后者预先与链霉亲和素复合时(即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)-链霉亲和素复合物)，它的活性强得多。在该测定中，在最低浓度时可看到极小的活性下降(5nM，按复合物中的肽计)。单独的链霉亲和素在高浓度时有边缘活性。
图11是显示多克隆山羊抗生物素介导的肽AF11505活性提高的FDCP-1/hEPOR生物测定结果图示。将GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)与山羊抗生物素抗体(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK+G抗B)预复合将肽的活性与游离肽相比提高了一个数量级。单独的纯化抗体(G抗B)没有制激效果。
图12显示制备GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚体肽类似物的合成方法。
图13显示GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚体肽类似物的IC50曲线。亲和性利用与固定在mAB179上、PIG加尾的EPOR的放射性配体竞争结合测定法来测定。
图14显示利用FDCP-1/hEPOR细胞增殖测定法测得的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚体肽类似物的体外生物活性。二聚体肽的EC50约20纳摩尔浓度(nM)，其活性比亲本肽提高了20倍。
图15显示FDC-P1/ER的细胞周期进程。
图16显示对[125I]EPO与固定在琼脂糖微珠上的EBP之间特异性偶联的平衡结合分析，并显示根据结合等温线的线性转化(Scatchard)得出的5nM±2的Kd。
图17A、17B和17C显示分别用肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG，GGTYSCHFGPLTWVCKPQ和LGRKYSCHFGPLTWCQPAKKD进行的去缺氧性红细胞增多症(polycythemic exhypoxic)鼠生物测定的结果。
图18A和18B显示分别用肽TIAQYICYMGPETWECRPSPKA和包含两个二硫键的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG一个二聚体肽类似物进行的去缺氧性红细胞增多症鼠生物测定的结果。
图19A和19B显示分别用EPO和GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG进行的网织红细胞测定结果。对两个剂量组而言，n＝10个动物。EPO0.4、4.0、40.0单位/鼠，全剂量媒质对照；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG2.0、20.0、200.0微克/鼠，全剂量媒质对照+DMSO(1-2％)200微克/鼠＝10毫克/千克。推论体外增殖测定数据显示2微克GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG＝0.4单位EPO。
图20A和20B显示分别用EPO和GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG进行的网织红细胞测定结果。对两个剂量组而言，n＝10个动物。EPO0.4、4.0、40.0单位/鼠，全剂量；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG将剂量提高至1毫克/鼠，全剂量＝50毫克/千克，即2毫克/鼠，全剂量＝毫克/千克。
本发明和较佳实施方式的详细说明以下术语的一般意义如下肽中氨基酸残基的缩写如下苯丙氨酸为Phe或F；酪氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P;苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷胺酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；甘氨酸为Gly或G。
20个常规氨基酸的立体异构体(即D-氨基酸)，非天然氨基酸例如a，a-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以作为本发明化合物的合适组分。这些非常规氨基酸的实例包括4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸以及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。
“激动剂”指一类生物活性配体，它们与各自具有互补生物活性的受体结合并激活后者，由此在受体内引起生物应答，或者加强受体已有的生物活性。
“宿主细胞”指可以或已经被重组DNA载体转化的真核细胞或原核细胞或一类细胞。出于本发明的目的，优选的是原核细胞。
“肽”或“多肽”指单体为通过酰胺键连接的α氨基酸的聚合物。肽长为2个或者，通常为更多个氨基酸单体。
“药学上认可的盐”指制药行业常用的无毒碱金属、碱土金属和铵盐，其中包括钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、钡盐、铵盐和鱼精蛋白锌盐，它们的制备是本领域所熟知的。该术语还包括无毒的酸加成盐，它们通常通过本发明化合物与合适的有机或无机酸反应来制备。代表性的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、十二烷酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、napsylate等。
“药物或治疗有效剂量或有效量”指足够诱导产生所要求的生物结果的剂量水平。该结果可以是对疾病表现、症状或病因的缓解，或者任何其它要求的生物系统的改变。较好的是，该剂量足够刺激EPO-R，并由此缓解与体内EPO缺乏或红细胞缺陷或缺少相关的症状。
“重组DNA克隆或表达载体”指编码某种功能并可用于转化宿主细胞的DNA分子或RNA分子。处于本发明的目的，克隆载体通常主要在表达载体的构建中起中间体的作用；表达载体被用于转化或转染宿主细胞，使得被转化的宿主细胞产生由载体编码的蛋白质或其它产物。这类载体通常为“质粒”，出于本发明的目的，这些质粒通常是能够在宿主细胞内于染色体外维持的载体，但是也可以是整合到宿主细胞的基因组内的载体。本领域技术人员可以根据本发明的定义，将“克隆载体”称为“载体”，将“表达载体”称为“质粒”。
本发明提供了一种结合并激活或者否则则起EPO激动剂作用的化合物。这类化合物包括利用随机肽多样性生成系统发现的“主导”肽化合物，和被构建成分子结构或形状与主导化合物相同或相似但在易水解性或易蛋白酶解性方面和/或其它生物性能方面，例如受体亲和性的提高、体外或体内活性的提高方面与主导化合物不同的“衍生”化合物。
最初使用的随机肽多样性生成系统包括前文所述的“噬菌体上的肽”系统。随机肽被设计成8个氨基酸的长度，在两端有Cys残基(这样，总长为10个氨基酸)。在这些早期系统中，随机肽的形式为融合蛋白的一部分，该蛋白包含噬菌体fd衍生物的pVIII外被蛋白(噬菌体上的肽)。融合蛋白、以及编码融合蛋白的DNA在固定化的EPO-R上接受“筛选”。筛选过程包括融合蛋白与固定化受体的多轮孵育，挑选出与受体结合的融合蛋白(以及相伴DNA)，和生成更多的挑选出的融合蛋白。
通常，在三轮筛选后，分离出融合蛋白和相伴DNA，并进行培养以产生用于ELISA的融合蛋白制剂，ELISA用来确定融合蛋白是否与受体特异性地结合。该测定的进行与筛选相似，所不同的是在去除不结合的融合蛋白后，测试孔用兔抗噬菌体抗体(或者，对于质粒上的肽系统，使用抗lac抗体)处理，再用碱性磷酸酶偶合的山羊抗兔抗体处理，然后用常规方法测定每孔中碱性磷酸酶的量。通过将测试孔与对照孔(无受体)比较，可以确定融合蛋白是否与受体特异性地结合。
用于筛选和ELISA方法的固定化受体包含EPO-受体的胞外区，而且是在重组宿主细胞中生成的。该受体分子可以在多种不同形式的宿主细胞中产生。一种有用的形式是被构建成具有利于蛋白质分泌和糖基磷酸脂膜锚定附着的信号肽(这种锚定附着形式被称为“PIG-加尾”；参见Caras和Weddell，1989年3月3日，《科学》2431196-1198；和Lin等，1990年8月10日，《科学》249677-679，两种均在本文中引用参考)。该系统允许从表达受体的细胞表面切割受体，并十分方便地收集割离的受体。较好的是，在PIG加尾受体的HPAP表位和受体本身之间插入一个蛋白酶切割位点，例如凝血酶切割位点。
重组受体蛋白用以下方法来固定。用抗受体抗体包被微量滴定板，用来容纳固定化受体的测试孔用牛血清白蛋白(BSA)处理以抑制非特异性结合。在微量滴定板包被过的测试孔中加入具有凝血酶切割位点的PIG加尾受体，然后洗涤这些测试孔以去除非结合的受体。
在使用允许多价配体-受体相互作用的随机肽生成系统时，必需认识到，固定化受体的密度是决定将与固定化受体结合的配体的亲和性的重要因素。在高受体密度下(即每个抗受体抗体包被的测试孔用0.25至0.5毫克受体处理)，与低受体密度情况(即每个抗受体抗体包被的测试孔用0.5至1纳克受体处理)相比更易于发生多价结合。如果发生多价结合，则更可能分离到亲和性较低的配体。通常，可以用高密度固定化受体鉴定主导化合物，然后在低受体密度下测试主导化合物的衍生物，以便分离出比主导化合物具有更高亲和性的的化合物。
经常，只在微量滴定板的间隔列中加入受体；“空白”列中BSA抑制的测试孔用作阴性对照以确定受体特异性反应是否产生观察得到的结果。然后在测试孔中加入融合蛋白制剂并孵育，以便发生与受体的结合；然后，洗涤测试孔以去除不结合的融合蛋白。
利用以上系统，发现了一种与EPO-R结合的肽。对编码结合受体的融合蛋白的DNA进行了测序。该肽具有以下序列GGCRIGPITWVCGG(SEQID NO)(N末端的GG残基允许肽从噬菌体上割离)。通过ELISA测定，该肽始终表现出对BSA和对抗受体抗体的低亲和性，以及对EPO-R的高亲和性。而且，噬菌粒克隆受到游离EPO和同源游离肽的竞争。而且，游离肽被发现与EPO-噬菌体、LacI-EPO融合蛋白和放射性配体之间有竞争。
然后对这种优选肽进行了诱变研究。为了产生编码随机肽的寡核苷酸集合，制备了图1所示的诱变寡聚物，在其中的密码子基元(NNK)中，N是A、C、G或T(等摩尔；根据所用的方法，可以使用其它核苷酸)，K是G或T(等摩尔)。本领域技术人员将认识到，NNK基元编码全部氨基酸，只编码一个终止密码子，并减少密码子的偏性。有NNK基元可产生32个可能的密码子1种情况为12种氨基酸，2种情况各自5种氨基酸，3种情况各自3种氨基酸，和三种终止密码子中的1个。
再次在固定化的EPO-R上筛选诱变融合蛋白，以及编码这些蛋白的DNA。然后分离出融合蛋白和相伴NDA，进行培养以生成用于ELISA的融合蛋白制剂，通过ELISA确定融合蛋白是否特异性地与受体结合。图2显示了由该研究获得的较好的肽。这类肽的特征在于具有以下基元“X3X4X5GPX6TWX7X8”(SEQ ID NO)，其中每个氨基酸由一个标准单字母缩写表示；X6独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸或立体异构的D-氨基酸中任意一个；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，条件是X3或X8其中之一为C或Hoc。
为了粗略确定肽的亲和性，用亲和性选择法对噬菌体文库也进行筛选，在其中，肽与EPO(100nM)竞争。一般重复该过程进行2轮筛选。在以后轮次的筛选中，可以进一步改变竞争的温度(4℃至环境温度)和时间(15至30分钟)以及洗涤溶液的温度(4℃至环境温度)，以便挑选出具有高亲和性的肽。使用该亲和性选择法，分离得到了具有以下共有基元的肽“X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11”(SEQ ID NO)，其中每个氨基酸由一个标准单字母缩写表示；X1、X2、X6、X9、X10和X11独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸或其立体异构的D-氨基酸中任意一个；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V。在一种较好的实施方式中，肽包含以下氨基酸序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，其中X4可以是R或H；X5可以是F或M；X6可以是I、L、T、M或V；X7是D或V；X9可以是G、K、L、Q、R、S或T；X10可以是A、G、P、R或Y。在最佳实施方式中，核心肽包含以下氨基酸序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，其中X1可以是D、E、L、N、S、T或V；X2可以是A、H、K、L、M、S或T；X4可以是R或H；X9可以是K、R、S或T；X10是P。
以下表格列出了在亲和性选择过程中分离得到的该基元范围内的代表性肽实例。
表1通过亲和性选择得到的肽与100nM EPO竞争，15分钟，4℃GGWVTCRMGPITWVCGVHGG(SEQ ID NO)GGQLLCGIGPITWVCRWVGG(SEQ ID NO)GGLYLCRMGPVTWECQPRGG(SEQ ID NO)GGKYSCFMGPTTWVCSPVGRGV (SEQ ID NO)GGWVYCRIGPITWVCDTNGG(SEQ ID NO)GGIYKCLMGPLTWVCTPDGG(SEQ ID NO)GGMYYCRMGPMTWVCKGAGG(SEQ ID NO)无竞争
GGTTQCWIGPITWVCRARGG(SEQ ID NO)GGPYHCRMGPITWVCGPVGG(SEQ ID NO)GGEYLCRMGPITWVCERYGG(SEQ ID NO)GGEYRCRMGPISWVCSPQGG(SEQ ID NO)GGNYTCRFGPLTWECTPQGGGA (SEQ ID NO)GGNYVCRMGPITWICTPAGG(SEQ ID NO)表2通过亲和性选择得到的肽第二次与100nM EPO竞争，15分钟，4℃GGSWDCRIGPITWVCKWSGG(SEQ ID NO)GGDYTCRMGPMTWICTATRG(SEQ ID NO)GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG(SEQ ID NO)GGSYLCRMGPTTWLCTAQRG(SEQ ID NO)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO)VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)GGLYLCRMGPQTWMCQPGGG(SEQ ID NO)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO)GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR(SEQ ID NO)GGLYECRMGPMTWVCRPGGG(SEQ ID NO)GGWYSCLMGPMTWVCKAHRG(SEQ ID NO)GGKYYCWMGPMTWVCSPAGG(SEQ ID NO)无竞争GGYVMCRIGPITWVCDIPGG(SEQ ID NO)GSCLQCCIGPITWVCRHAGG(SEQ ID NO)GGNYFCRMGPITWVCQRSVG(SEQ ID NO)GGEYICRMGPLTWECKRTGG(SEQ ID NO)GGLYACRMGPITWVCKYMAG(SEQ ID NO)GGQYLCTFGPITWLCRGAGGGS (SEQ ID NO)GGVYACRMGPITWVCSPLGG(SEQ ID NO)GGYTTCRMGPITWVCSAHGG(SEQ ID NO)表3通过亲和性选择得到的肽与100nM EPO竞争，15分钟，室温VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)
GGTYKCWMGPMTWVCRPVGG(SEQ ID NO)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO)GGNYYCRFGPITFECHPTGG(SEQ ID NO)GGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGS (SEQ ID NO)GGEYKCYMGPITWVCKPEGG(SEQ ID NO)GGDYVCRMGPMTWVCAPYGRGGS (SEQ ID NO)无竞争GGNYVCRMGPITWICTPAGG(SEQ ID NO)GGDYTCRMGPMTWICTATRG(SEQ ID NO)GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG(SEQ ID NO)GGSYLCRMGPTTWLCTAQRGGGN (SEQ ID NO)GGLYTCRMGPITWVCLPAGG(SEQ ID NO)GGLYKCRMGPMTWVCSPFGG(SEQ ID NO)表4通过亲和性选择得到的肽与100nM EPO竞争，30分钟，室温GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO)VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)无竞争GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR(SEQ ID NO)GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG(SEQ ID NO)还用固定化EPO-R筛选了另一个诱变文库，该文库具有与一个随机8元体连接的6个随机氨基酸残基，8元体两侧有2个半胱氨酸残基。仍然用固定化EPO-R筛选诱变融合蛋白以及编码这些蛋白的DNA。然后分离出融合蛋白和相伴NDA，进行培养以生成用于ELISA的融合蛋白制剂，通过ELISA确定融合蛋白是否特异性地与受体结合。由该研究获得的较好的肽的特征在于具有以下序列GGPHHVYACRMGPLTWIC(SEQ ID NO)，因此被包涵在核心序列“YX2X3X4X5GPX6TWX7X8”(SEQ ID NO)中，其中每个氨基酸由一个标准单字母缩写表示；X2和X6独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸或立体异构的D-氨基酸中任意一个；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，条件是X3或X8其中之一为C或Hoc，该核心序列的氨基末端与一个六氨基酸单元偶合，六氨基酸单元中每个氨基酸独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸或立体异构的D-氨基酸中任意一个。
计算了以上通用基元表示的几种肽的IC50。用游离肽来测定该值，并列于以下表5。(以下每种肽均独立合成，并在C末端酰胺化，但可以方便地将其制备成游离羧酸或酯或其它羧酰胺。)表5肽 IC50GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG(SEQ ID NO) 1.67μMGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO) 237nmGGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO) 179nmVGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO) 420nmGGVYACRMGPITWVCSPLGG(SEQ ID NO) 352nmVGNYMAHMGPITWVCRPGG(SEQ ID NO) 67μM除了以上所述之外，还在被设计用于富集更高亲和性肽的条件下对高亲和性EPO激动剂家族的肽进行了其它诱变研究。如前所述，为了富集更高亲和性的肽，用肽与EPO(100nM)竞争的亲和性选择法筛选文库。该过程通常重复进行2轮筛选。在以后轮次的筛选中，可以进一步改变竞争的温度(4℃至环境温度)和时间(15至30分钟)以及洗涤溶液的温度(4℃至环境温度)，以便挑选出具有高亲和性的肽。使用该技术，仍然用固定化EPO-R筛选得到了一个诱变文库，其中在侧翼序列YXCRIGPITWVC两侧分别具有3个随机氨基酸残基(参见图3)。仍然用固定化EPO-R筛选诱变融合蛋白以及编码这些蛋白的DNA，然后分离和培养融合蛋白和相伴DNA以产生用于ELISA的融合蛋白制剂，通过ELISA来确定融合蛋白是否与受体特异性地结合。以下表6列出了由该研究得到的较好的肽。
表6GGEYICVMGPNTWVCSPTRGHGSGGEYLCRMGPMTWVSPFTRKGGGGQYICRFGPITWQSQPAGGGSGREYSCRMGPITWVCMPRASLGSGDYLCSMGPITWICVPERGGGSELWYSCRMGPVTWMCGRYQGGGS在另一诱变研究中，用固定化EPO-R还筛选到了一个诱变文库，其中具有高度保守的固定残基(即Y、C、G、P、T和W)，其它残基是随机的，在N末端的酪氨酸之前有10个附加残基(参见图4A)。仍然用固定化EPO-R筛选诱变融合蛋白以及编码这些蛋白的DNA，然后分离和培养融合蛋白和相伴DNA以产生用于ELISA的融合蛋白制剂，通过ELISA来确定融合蛋白是否与受体特异性地结合。以下表7列出了由该研究得到的较好的肽。
表7QICRADRKGIYQCWYGPETWICggQQGYSLWLPWYNCVLGPYTWVCggYGGSAAVPWKYGCSLGPVTWVCggQIVSWGLYSGYLCMVGPVTWLCggGSGALSAAGWYGCRVGPLTWVCggSVVSHDAAGVYDCVIGPVTWICggIYSWTGILGSYVCWYGPDTWVCggSCIYVRFFYCYQCSEGPATWLCggTVAKGQSGVRYSCLRGPETWVCggVQPQYKWATMYQCWKGPSTWFCggKSGVWEMGSSYQCARGPRTWCCggCSVRRMDREYYRCCRGPFTWQCggKYQEEMFMGYQCLQGPKTQLCggVCPGSEFRVGYICAMGPYTWDCggSLCSSRCNSPYFCSIGPSTWRCggQASLGLPLKQYLCVLGPHTWLCggACKPAALFVQYGCVLGPMTWICggSCERAGGRWEYVCQWGPDTWLCggRVARQVQQVSYWCAHGPATCYCggHKYDTLMLTNYVCQRGPLTQLCgg在另一诱变研究中，用固定化EPO-R还筛选到了一个诱变文库，其中具有高度保守的固定残基(即Y、C、G、P、T和W)，其它残基是随机的，在第二半胱氨酸和(Gly)4-Ser接头之间有10个附加残基(参见图4B)。在该文库中，在保守的酪氨酸之前有两个甘氨酸残基，这有利于有效地割离信号肽。仍然用固定化EPO-R筛选诱变融合蛋白以及编码这些蛋白的DNA，然后分离和培养融合蛋白和相伴DNA以产生用于ELISA的融合蛋白制剂，通过ELISA来确定融合蛋白是否与受体特异性地结合。以下表8列出了由该研究得到的较好的肽。
表8ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMggggYICDYGPLTWACKPAGATLLQPggggYTCRFGPVTWDCLPAINHNGVLggggYQ*FMGPETWVCAPEPRVERVSggggYLCRFGPETWTCAPERSVVTQSggggYVCDFGPTTWICRGQVMEHINTggggYMCNMGPLTWDCSPVRSTSMAWggggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMggggYNCTMGPNTWVCTPAAESPAVFggggYGCRIGPITWICDDVSRSPRAggYTCRMGPQTWECLPMSEGVggYNCKFGPQTWDCSSANLKEVgYLCEMGPETWMCRPEDAKLGVggYGCKFGPVTWICEDLLLDPMYggYNCKFGPQTWDCSSANLKEVLVgYLCEMGPETWMCRPEDCEAWggYGCGLAPVTWECPQVSIPYGLSggggYGCRIGPTTWICD STVPQLREVggggYRCSWAPETWVCDNHSAgYLCNFGPITWDCVSSAQSEMQIgg在另一诱变研究中，用固定化EPO-R还筛选到了一个诱变文库，其中具有高度保守的固定残基(即Y、C、G、P、T和W)，而且第二酪氨酸与第一半胱氨酸直接相邻，其它氨基酸是随机的，包括酪氨酸N末端的4个残基和第二半胱氨酸与接头之间有5个残基(参见图4C)。N末端的随机氨基酸之前仍然有两个甘氨酸残基，这有利于有效的加工。仍然用固定化EPO-R筛选诱变融合蛋白以及编码这些蛋白的DNA，然后分离和培养融合蛋白和相伴DNA以产生用于ELISA的融合蛋白制剂，通过ELISA来确定融合蛋白是否与受体特异性地结合。以下表9列出了由该研究得到的较好的肽。
表9ggAELQYCKIGPETWVCDWPHIggggPYEGYCSGGPVTWECCVSVCggggQPLPYCSPGPTTWFCINWLFggggCSYGYCPMGPFTWMCRQRRLgg
ggVRGSYCQSGPPTWQCDLRFFggggRCARYCACGPGTWNCLGRCQggggLGRCYCVYGPLTWWCSQTSLggggLCVWYCSAGPWTWYCIYRSAggggKPGPYCSFGPETWVCTALGMggggRLGEYCEIGPITWICRLFLPggggPGLGYCDFGPLTWVCDGSVDggggLSSAYCRYGPETWICWAGTGggggVLHLYCYYGPETWDCLPIKAggggGGGVYCLVGPVTWLCGPAAMggggLTRNYCRIGPETWICQEVAIggggWSERYCVLGPLTWECVHLFAggggMPLKYCGMGPVTWVCCEAVSggggSVMRYCHFGPETWICPYDMPggggALYPYCLIGPMTWVCQVGWIggggTYGNYCRGGPGTWHCEDTRGggggASYCYCSKGPATWKCVGSILggggSLAAYCLQGPKTWPCVRRRLggggTDSLYCKLGPLTWHCQLYQKgggISQQYCWRGPATWVCLEWELgg除了以上诱变研究之外，还利用经修改的C-末端Lac-I展示系统进行了肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的诱变，该系统中，借助于鉴定用高亲和性击中(“头片二聚体”)降低了展示价(display valency)。本文引用参考的美国专利5,338,665详细描述了Lac-I头片二聚体(HPD)展示系统。主要的是，在前述诱变研究中高度保守的残基(即Y、C、G、P、T和W)被轻度突变，保守性较低的残基(即H、F、L和V)受到较高程度的突变。酪氨酸残基之前有4个随机氨基酸，其后有一个随机氨基酸。诱变产物的C末端以6个随机氨基酸结束，它们在半胱氨酸之后。图5详细显示了该文库构建物。
用固定在mAb179上的PIG加尾EPO-R对文库进行了4轮筛选，期间利用来自第二轮的EPO洗液进行以后的洗脱以富集亲和性更高的克隆。将得到的DNA插入片段混合克隆到麦芽糖结合蛋白(MBP)载体中，允许它们以C末端融合蛋白的形式表达。随机挑选不同的MBP融合克隆制成粗细胞裂解物，然后在ELISA中测定与EPO-R的结合。该研究得到的较好的肽列于以下表10。
表10RTKEYSCQMGPLTWICVPKSSKARYMCHMGPLTWVCRPEVGGKAYMCRLGPVTWVCSPRIKLLLRGYECYMGPLTWVCRSSKPRTIAQYICYMGPETWECRPSPKANGRTYSCQLGPVTWVCSRGVRRLGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKDMKTKYKCYMGPLTWVCEGSSKTKYRCEMGPLTWVCERWLTRLYSCHMGPSTWVCSTALRKRGQLYACHFGPVTWVCKRRKRVSGILYECHMGPLTWVCTPSRRRGSKTYSCQLGPVTWVCGRKRARGKYQCQFGPLTWECLPIRPRVTRMYRCRMGPLTWVCERKPSLYECHLGPLTWECRPRRRERGHMYSCQLGPVTWVCKPLSGRITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTKGNRMYQCHMGPLTWVCQPTRIHMKTKYKCYMGPLTWVCEGSRLKHLGKYDCSFGPQTWVCKPRRSLERRVYECQMGPLTWECKPGVKGITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTKLGRKYSCHFGPVTWVCQPAKKDRGRGYSCQMGPVTWVCKRERYFRLREYRCHMGPQTWVCNGHHSKSGALYDCQMGPITWVCRANRQKTNQVYGCKFGPKTWVCKPAPRITRGMYACHMGPQTWVCRPTQPRVLSNYECTMGPKTWVCKPLRLK用Lac-I头片二聚体展示系统得到的肽，其最突出的特征之一是保守性半胱氨酸两侧区域多个正电荷的累积。在RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV中尤其如此，该序列在其C末端有5个这样的延伸残基。轻度诱变的氨基酸(即Y、C、G、P、T和W)绝对保守，但是在突变较严重的位置产生了新的基元。尤其有意义的是在许多肽中出现了多一个附加酪氨酸残基(参见例如LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR)，以及在TIAQYICYMGPETWECRPSPKA的半胱氨酸之间有两个谷氨酸残基。
除了以上诱变研究之外，还利用经修改的类似于前述系统的C-末端Lac-I展示系统进行了肽TIAQYICYMGPETWECRPSPKA的诱变。主要的是，在前述诱变研究中高度保守的残基(即Y、C、G、P、T和W)是固定的，保守性较低的残基(即H、F、L和V)是随机的。此外，两个谷氨酸残基被轻度突变。酪氨酸残基之前有4个随机氨基酸，其后有一个随机氨基酸。诱变产物的C末端以6个随机氨基酸结束，它们在半胱氨酸之后。图6详细显示了该文库构建物。
用固定在mAb179上的PIG加尾EPO-R对文库进行了3轮筛选，期间利用来自第二轮的EPO洗液进行以后的洗脱以富集亲和性更高的克隆。先用人Fcγ-EBP试剂，然后用Sigma Chemical Co.St.Louis，Missouri的与碱性磷酸酶结合的山羊抗人Fcγ进行探测，如此挑选菌落。然后，对鉴定出的HPD质粒进行鉴定和测序。该研究得到的较好的肽列于以下表11。
表11ALKKYDCYFGPETWECLARRPHERRFYKCRFGPETWECTLFGQEYRCHLGPETWQCSPVRVGFRPEYMCRMGPETWECGGARPGSRKYwCRMGPETWECMKPVRLGLKAYGCRYGPETWDCRSVILIIRQPYICHMGPETWECGRYPAGKGASYHCIMGPETWECIPQRVWMKQLYSCIMGPETWECRPGVERQRHYYRCALGPETWECRPMSPETKRLYHCHMGPETWECHGPMRKTRPSYRCAFGPVTWECIPARRHKSYvCTFGPETWECTGAIRRRGRMYNCRMGPETWECKGQSKDRRRYYRCWMGPETWECSPVSNKVADNYDCPIGPVTWECIHVRASVQKKYLCHFGPETWECGPDRDWQTWYICERGPETWECRWLVLYRMPYRCKMGPETWECVGGRGRYSREYSCRMGPETWECXRGFLR
然后将以上肽序列混合物克隆到麦芽糖结合蛋白(MBP)载体中，使它们表达为C末端融合蛋白。随机挑选不同的MBP融合克隆制成粗细胞裂解物，然后在ELISA中测定与EPO-R的结合。该研究得到的较好的肽列于以下表12。
表12RSMWYRCQMGPQTWVCGPRSASSRREYICHLGPQTWVCGPGGRKGSPSYHCHLGPLTWVCKPHRMRMVGRYQCHMGPRTWVCKPWHGGTARYQCHFGPLTWVCKPSLKGELRGYICHFGPVTWVCKPNGSRLKQGYQCQLGPQTWVCRPLRMPKERKYECQFGPRTWVCQPTRANVRKVYACHMGPVTWVCVPGYKGSGQRYVCRMGPETWVCRSYRGLERRSYSCQMGPVTWVCGRQMGQVKNNYRCQFGPVTWVCKAFRSGASYDCQMGPITWVCRANRQK被发现与EPO-受体特异性结合的代表性肽还在以细胞为基础的功能性测定中接受了测试。测定之一使用FDCP-1，即以生长因子依赖型鼠多能前红细胞生成性前祖细胞系(参见Dexter等(1980)《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)1521036-1047)作为亲代细胞系。在补充以WEHI3条件培养基(含有IL-3的培养基，ATCC编号T1B68)时，该细胞系能够增殖但是不能分化。按照下文用人或鼠的EPO-R转染亲代细胞系，以分别生产FDCP-1-hEPO-R或产FDCP-1-mEPO-R细胞系。在人或鼠EPO存在下，这些转染细胞系能够增殖但不能分化。
简而言之，在必需生长因子存在下，将这些细胞培养至半稳态密度。然后在PBS中洗涤细胞，并在没有生长因子的完全培养基中饥饿16至24小时。在测定了细胞的存活率后，制备成每50微升约105个细胞的储备液(制备在无生长因子的完全培养基中)。在96孔的组织培养板上测试待测化合物的连续稀释液(与噬菌体结合或其它形式结合或固定化肽相反，一般是游离的、溶液相的肽)，每孔的最终体积为50微升。在每孔中加入细胞(50微升)，孵育24至48小时，此时，阴性对照将死亡或静息。然后利用本领域已知技术测定细胞的增殖，例如与3H-胸苷相关联，用它的掺入显示细胞增殖的MTT测定(参见Mosmann(1983)《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)6555)。图7显示了对EPO和表5所列的肽的这一测定的结果。在基于FDCP-1/hEPO-R细胞的生物测定中与EPO受体结合，并表现出活性的肽是本发明的优选化合物。
第二种以细胞为基础的测定使用TF-1细胞系。参见本文引用参考的Kitamura等(1989)《血液》73375-380。图8显示了代表性的结果。图8显示了EPO和游离肽VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)对细胞系TF-1增殖的影响。
进一步表明本发明化合物作为EPO激动剂能力的另一种以细胞为基础的测定以3H-胸苷掺入经苯肼处理的小鼠的脾脏细胞为基础。图9A至9C显示了该测定的结果。
可用于证明本发明化合物活性的其它生物测定法可参见本文引用参考的以下文献Greenberger等(1983)《美国科学院院报》802931-2935(EPO依赖性红细胞生成性前祖细胞系)；Quelle和Wojchowski等(1991)《生物化学杂志》266609-614(B6SUt.EP细胞中蛋白质酪氨酸磷酸化)；Dusanter-Fourt等(1992)《生物化学杂志》28710670-10678(人EPO应答细胞内EPO-受体的酪氨酸磷酸化)；Quelle等(1992)《生物化学杂志》26717055-17060(FDC-ER细胞内胞质溶胶蛋白(pp100)的酪氨酸磷酸化)；Worthington等(1987)《实验血液学》(Exp.Hematol.)1585-92(血红蛋白的比色测定)；Kaiho和Miuno(1985)《生物化学年刊》(Anal.Biochem.)149117-120(用2，7-二氨基芴检测血红蛋白)；Patel等(1992)《生物化学杂志》26721300-21302(c-myb的表达)；Witthuhn等(1993)《细胞》(Cell)74227-236(JAK2的缔合与酪氨酸磷酸化)；Leonard等(1993)《血液》821071-1079(GATA转录因子的表达)；Ando等(1993)《美国科学院院报》909571-9575(通过环化D2和D3来调节G1/3的转移)；以及钙流量。
一种由Molecular Devices Corp.设计，称为微生理测试仪(microphysiometer)的仪器据报道已被成功地用于测定激动剂和拮抗剂对各种受体的作用。这种设备的基础是测定胞外介质应答受体的激活而发生的酸化程度改变。
根据一种较好的实施方式，本发明的肽被二聚化或寡聚化，由此提高本文所公开的主导化合物的亲和性和/或活性。为了在细胞增殖测定中检测肽的二聚化或寡聚化对EPO模拟活性的作用，合成了一种GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的C末端被生物素酰化的类似物(即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素))。
以上肽与链霉亲和素以4∶1的摩尔比在室温下孵育1小时。然后，在PIG加尾的EPO-R结合测定中加入复合物以测定IC50。对不与链霉亲和素复合的肽也进行相同的实验。与不曾与链霉亲和素孵育的肽350nM的IC50的相比，预复合的肽被发现具有20nM的IC50。这一高出10倍的表观亲和性升高被推定是因为肽-链霉亲和素复合物的多价状态。由于以上比较使用的是游离肽的浓度而不是有效复合物的浓度(在理论上低于前者4倍)，所以实际作用还要大。
此外，如上所述在无血清的HEPES缓冲的RPMI中按4∶1的摩尔比预孵育肽与链霉亲和素。在FDCP-1/hEPO-R生物测定中，与游离的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)和非生物素酰化的亲代肽，即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG一起，测试复合物对细胞增殖的刺激作用。图10显示了该测定的结果，游离肽的EPO-ED50相近(约1微摩尔浓度(μM))，而预先形成的链霉亲和素复合物的EPO-ED50低于10纳摩尔浓度，小两个数量级。单独的链霉亲和素在高浓度时有一定的刺激作用，这可能是因为被细菌内毒素所污染。
此外，在与山羊抗生物素IgG二聚化时，发现其生物活性提高。图11显示，通过按2∶1的摩尔比预先孵育GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)和纯化的山羊抗生物素IgG，可使EPO-ED50降低一个数量级。这种生物活性的提高可能是由于抗体对肽的二聚化作用。单独的抗生物素抗体对细胞没有作用。而且，使用GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)-链霉亲和素复合物可以观察到EPO-ED50降低100倍。因此，通过二聚化或寡聚化本发明的主导肽，可以提高这些肽的亲和性和/或活性。
在另一实施方式中，利用图12所示的方法制备包含两个二硫键的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚体肽类似物。简而言之，在Tentagel树脂上装配第一肽链。将Fmoc-Lys(Alloc)与Knorr接头偶合，Alloc基团被用作正交保护基。在第一肽链中，使用的是Cys(Acm)。在完成第一肽链后，Alloc基团被去除，在赖氨酸残基的侧链胺上合成第二肽链。在该肽链中，使用的是Cys(trt)。合成完毕后，从树脂上割离肽并纯化。然后将肽环化成含有一个二硫键的化合物。然后，通过碘氧化反应形成第二个二硫键，形成二环二聚体。
图13和14显示二聚体在体外与EPOR的结合和生物活性。在一排测试孔中用固定在mAb179上、PIG加尾的EPOR测定二聚体的亲和性。平衡竞争结合测定的结果显示亲和性约为2纳摩尔浓度(nM)，与亲代肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG相比提高了200倍，与GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)-链霉亲和素复合物相比高出5倍。如通过FDCP-1/hEPO-R细胞增殖所测得的，体外生物活性由400nM(亲代肽)的EC50提高了约20倍，至20nM。因此，通过二聚化或寡聚化本发明的主导肽，可以显著提高这些肽的亲和性和/或活性。
本发明的肽和其衍生物可以与结合EPO-R的化合物结合，构建成对受体的亲和性比构成结合物的两种化合物都高的化合物。这类肽的发现还有助于鉴定结合EPO-R上相同位点的肽，因为鉴定者可以使文库或筛选方法具有偏性，以消除具有互补性“非抑制性”基元的肽。
优选的基元序列还提供了测定本发明EPO激动剂最小形式的方法。使用1992年9月16日申请的美国专利申请946,239所述的“被编码的合成文库”(ESL)，(该申请是1991年9月18日申请的762,522的部分续展申请)或1990年3月7日申请的492,462，1990年12月6日申请的624,120，1991年12月6日申请的805,722中所述的“极大规模的固定化聚合物合成法”，不仅能够确定具有所述活性的肽的最小形式，而且能够合成构成这类的肽的全部肽，这类肽在一个、两个或更多个残基上与优选基元(或最小基元)不同。然后可以筛选该肽集合结合EPO受体的能力。以上固定化聚合物合成系统或其它肽合成方法还可以被用于合成本发明每一肽化合物的截短类似物、缺失类似物、以及既截短又有缺失的类似物。
也可以利用本领域熟知的经典方法，例如标准固相技术来制备本发明的肽。这些标准方法包括绝对(exlusive)固相合成法、部分固相合成法、片段缩聚法、经典溶液合成法、以及甚至利用重组DNA技术。参见本文引用参考的Merrifield(1963)《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)852149。在固相上，合成通常使用一个α氨基保护树脂，从肽的C末端开始。合适的起始材料可以通过例如将要求的α氨基酸固定到氯甲基化的树脂、羟基甲基化的树脂或二苯甲基胺树脂上来制备。以上氯甲基化的树脂之一是Bio RadLaboratories，Richmond，CA的商品名为BIO-BEADS SX-1的树脂，Bodonszky等在1996年的《化学索引》(Chem.Ind.)(London)381597中描述了羟甲基树脂的制备方法。Pietta和Marshall在1970年的《化学通讯》(Chem.Commn)650中描述了二苯甲基胺树脂(BHA)，而且可以向BeckmanInstruments，Inc.，Palo Alto，CA购得盐酸形式的该树脂。
所以，按照Gisin在1973年的(Helv.Chim.Acta)561467中所述，通过借助于例如碳酸氢铯催化剂，将α氨基被保护的氨基酸与氯甲基化的树脂偶合来制备本发明的化合物。在最初的偶合之后，在有机溶剂中，在室温下，选择三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl)去除α氨基保护基。
α氨基保护基是本领域肽分步合成法中常用的那些。前者包括酰基类保护基(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)，芳香族聚氨酯类保护基(例如苄氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz)，脂肪族聚氨酯类保护基(例如正丁氧基羰基(Boc)、异丙氧基羰、环己氧基羰基)和烷基类保护基(例如苄基、三苯基甲基)。较好的保护基是Fmoc。侧链保护基(一般为醚、酯、三苯甲游基、PMC等)在偶合过程中保持不变，而且在氨基末端保护基去保护或偶合过程中不裂解。侧链保护基必须能够在最终肽合成完毕后，在不改变靶肽的条件下被去除。
Tyr的侧链保护基包括四羟基吡喃基、叔丁基、三苯甲游基、苄基、Cbz、Z-Br-Cbz和2，5-二氯苄基。Asp的侧链保护基包括苄基、2，6-二氯苄基、甲基、乙基和环己基。Thr和Ser的侧链保护基包括乙酰基、苄氧基、三苯甲游基、四羟基吡喃基、苄基、2，6-二氯苄基和Cbz。Thr和Ser的侧链保护基是苄基。Arg的侧链保护基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金刚烷氧基羰基基磺酰基(Mts)或Boc。Lys的侧链保护基包括Cbz、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴苄氧基羰基(2-BrCbz)、Tos或Boc。
在去除了α氨基保护基之后，留存的被保护的氨基按照要求的顺序逐步偶合。通常在溶液，例如二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)混合物中，使用合适的羰基活化剂例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)或二环己基碳二亚胺(DCC)，各被保护氨基以过量约3倍进行反应。
在完成了所要求的氨基酸序列后，通过用三氟乙酸(TFA)或氟化氢(HF)等试剂将需要的肽从树脂上分离，所述的试剂不仅从树脂上去偶合肽，而且去偶合全部留存的侧链保护基。在使用氯甲基化树脂时，氟化氢处理产生游离的肽酸。使用二苯甲基胺树脂时，氟化氢处理直接产生游离的肽酰胺。或者，使用氯甲基化树脂时，可以通过用氨处理肽树脂来去偶合侧链被保护的肽，以生成所需的侧链被保护的酰胺，或用烷基胺处理来生成侧链被保护的烷酰胺或二烷基酰胺。然后再通过氟化氢处理以常规方法去除侧链保护基，以生成游离的酰胺、烷酰胺或二烷基酰胺。
在制备本发明酯的过程中，使用的是用于制备肽酸的树脂，而侧链被保护的肽是利用碱和合适的醇，即甲醇来分离的。然后以常规方法用氟化氢处理去除侧链保护基，生成所需的酯。这些固相肽合成法是本领域熟知的，在Stewart的“固相肽合成法”(Freeman and Co.，San Francisco，1969)中有进一步的描述。
以上方法还可以用于合成其中20个天然的、遗传性编码的氨基酸之外的氨基酸在任一本发明化合物中一处、两处或更多处被用于取代的肽。例如，可以用萘基丙氨酸取代色氨酸来促进合成。其它可以取代到本发明肽中的合成氨基酸包括L-羟基丙基、L-3，4-二羟基苯基丙氨酰、δ氨基酸例如L-δ-羟基赖氨酰和D-δ-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰、β氨基酸和异喹啉基。D-氨基酸和非天然合成氨基酸也可以掺入本发明的肽中。
可以用其它侧链替换由20个遗传性编码的氨基酸(或D氨基酸)构成的天然侧链，例如用烷基、低级烷基、4-、5-、6-、至7元环烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基及其低级酯衍生物等基团，和4-、5-、6-、至7元杂环来替换。尤其是，可以使用脯氨酸类似物，即其中的脯氨酸残基被从5元改变为4、6或7元。环基可以是饱和或不饱和的，如果是不饱和的，可以是芳香族的或是非芳香族的。
环基可以是饱和和非饱和的，如果是非饱和的，可以是芳香族的或是非芳香族的。杂环基团宜包含一个或一个以上氮、氧和/或硫杂原子。这些基团的实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑磷基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如1-硫代吗啉代)、和三唑基。这些杂环基团可以是取代或非取代的。当基团是经取代的时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧、或者是取代或非取代的苯基。
可以通过磷酸化来修饰本发明的肽，Hruby等42描述了用于制造本发明化合物的肽衍生物的其它方法。所以，本发明的肽还可以作为合成生物活性类似的肽模拟物的基础。
本发明的肽化合物，包括肽模拟物，可以被共价修饰成非蛋白质类聚合物中一种或多种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法参见本文引用参考的美国专利4,640,835；美国专利4,496,689；美国专利4,301,144；美国专利4,670,417；美国专利4,791,192；或美国专利4,179,337。
本领域技术人员将认识到，许多技术可用来构建生物活性与相应的肽化合物相同或类似，但是在溶解性、稳定性和易水解性和易蛋白酶解性方面的活性优于这些肽的肽模拟物。参见例如Morgan和Gainor(Ann.Rep.Med.Chem.)24243-252(1989)。以下将描述用于制备肽模拟物的方法，这些模拟物在N末端氨基、C末端羧基被修饰和/或肽中的一个或一个以上酰胺键被改变为非酰胺键。可以理解的是，在同一肽模拟物中可以同时结合两种或两种以上的此类修饰作用(例如在同一肽中，C末端的羧基被修饰，而且在两个氨基酸之间包含一个-CH2-氨基甲酸酯键)。
肽通常被合成为游离酸的形式，但是如前所述可以方便地制备成酰胺或酯的形式。还可以对本发明肽的氨基末端和/或羧基末端进行修饰，以产生本发明的其它化合物。氨基末端修饰包括甲基化(例如-NHCH3或-NH(CH3)2)、乙酰化、增加一个羧苯甲酰基，或用包含羧化官能度的保护基保护氨基末端，所述保护基为RCOO-，其中的R选自萘基、羟苄基、类固醇剂以及类似的基团。羧基末端修饰包括用羰酰胺基团代替游离酸，或在羧基末端形成一个环内酰胺以引入结构张力。
氨基末端修饰如上所述，而且包括烷基化、乙酰化、增加羧苯甲酰基，或形成琥珀酰亚胺基团等。具体地说，N-末端然后可以如下反应
(a)通过与酸性卤化物(例如RC(O)Cl)或酸酐反应来形成酰胺基团，其通式为RC(O)NH-，其中R同上。通常，可以通过在惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中令等摩尔或过量(例如约5当量)的酸性卤化物与肽接触来进行反应，惰性稀释剂中宜包含过量(例如约10当量)的叔胺，例如二异丙基乙基胺，用于清除反应过程中产生的酸。反应条件则是常规的(例如室温下反应30分钟)。在对末端氨基烷基化以形成低级烷基N取代之后再用酸性卤化物进行以上反应可生成通式为RC(O)NR-的N烷基酰胺基；(b)通过与琥珀酸酐反应来形成琥珀酰亚胺基团。和过去一样，可以使用大致等摩尔量或过量的(例如约5当量)琥珀酸酐，氨基被利用本领域的已知方法转化为琥珀酰亚胺，这些方法包括在合适的惰性溶剂(例如二氯甲烷)中利用过量(例如10当量)叔胺。参见本文引用参考的Wollenberg等的美国专利4,612,132。可以理解的是，琥珀酸基团可以被例如C2-C6烷基或-SR取代基取代，这些取代基是以常规方法制备的，用于在肽的N末端生成取代琥珀酰亚胺。这类烷基取代基是按照以上Wollenberg等所述的方法，通过低级链烯基(C2-C6)与马来酸酐反应制得的，而-SR取代基是通过RSH与马来酸酐反应制得的，其中的R同上；(c)通过在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中与大致等摩尔量或过量CBZ-Cl(即苄氧基羰基氯)或取代CBZ-Cl反应来形成苄氧基羰基-NH-或取代苄氧基羰基-NH-基团，惰性溶剂中最好包含用于清除反应过程中产生的酸的叔胺；(d)通过在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中与大致等摩尔量或过量R-S(O)2Cl反应，将末端氨基转化为磺酰胺基，其中的R同上，由此形成磺酰胺基。较好的是，惰性稀释剂中含有过量(例如10当量)的叔胺，例如二异丙基乙基胺，用于清除反应过程中产生的酸。反应条件则是常规的(例如室温下反应30分钟)；(e)通过在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中与大致等摩尔量或过量(例如5当量)R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC6H4-对-NO2反应，将末端氨基转化为氨基甲酸酯，其中的R同上，由此形成氨基甲酸酯基团。较好的是，惰性稀释剂中含有过量(例如10当量)的叔胺，例如二异丙基乙基胺，用于清除反应过程中产生的酸。反应条件则是常规的(例如室温下反应30分钟)；以及(f)通过在合适的惰性稀释剂(例如二氯甲烷)中与大致等摩尔量或过量(例如5当量)R-N＝C＝O反应，将末端氨基转化为脲基(即RNHC(O)NH-)，其中的R同上，由此形成脲基团。较好的是，惰性稀释剂中含有过量(例如约10当量)的叔胺，例如二异丙基乙基胺，用于清除反应过程中产生的酸。反应条件则是常规的(例如室温下反应30分钟)。
此外，或者，可以修饰C末端。在制备C末端羧基被酯代替(即-C(O)OR，其中的R同上)的肽模拟物的过程中，使用的是用于制备肽酸的树脂，用碱和合适的醇例如甲醇来分离侧链被保护的肽。然后以常规方式，利用氟化氢处理来去除侧链保护基，由此获得所需的酯。
在制备C末端羧基被酰胺，即-C(O)NR3R4替代的肽模拟物过程中，使用二苯甲基胺树脂作为肽合成的固相载体。在合成完毕后，将肽从载体上释放的氟化氢处理直接产生游离的肽酰胺(即C末端为-C(O)NH2)。或者，将在肽合成过程中使用氯甲基化树脂与利用氨反应从载体上分离侧链被保护的肽相结合，产生游离的肽酰胺，与烷基胺或二烷基胺反应则产生侧链被保护的烷酰胺或二烷基酰胺(即，C末端是-C(O)NRR1，其中的R和R1同上。然后以常规方式，利用氟化氢处理来去除侧链保护，由此获得游离的酰胺、烷酰胺或二烷基酰胺。
在另一种形式的实施方式中，可以通过以N末端的氨基分别内部置换C末端羧基的-OH或酯基的-OR来诱导C末端羧基或酯基的环化，形成环肽。例如，在合成并分离肽酸后，可以在例如二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)之类溶液中利用合适的羧基活化剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)，将游离酸转化成活化的酯。然后通过以N末端的胺内部置换活化的酯来形成环肽。与聚合反应相比，用很稀的溶液就能加强分子内环化反应。这些方法是本领域熟知的。
还可以通过环化本发明的肽，或者在肽的两个末端引入脱氨基或脱羧基基团，由此消除氨基或羧基基团，从而降低肽的易蛋白酶解性或限定肽的构象。本发明的C末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基，以及它们的低级酯衍生物，和药学上认可的盐。
本文引用参考的Hruby等，《生物化学杂志》(Biochem.J.)268(2)249-262(1990)描述了可用于制造本发明化合物的肽衍生物的其它方法。所以，本发明的肽化合物还可以作为具有类似生物活性的非肽类化合物的结构模型。本领域技术人员将认识到，有许多技术可以用于构建生物活性与主导肽相同或相近，但是在溶解性、稳定性和易水解性和易蛋白酶解性方面的活性优于主导肽的化合物。参见本文引用参考的Morgan和Gainor，(Ann.Rep.Med.Chem.)24243-252(1989)。这类技术包括用磷酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸构成的骨架置换肽骨架。
只需在合成过程中用适当保护的氨基酸类似物取代氨基酸反应物，利用常规的肽合成法就可以制备肽键(-C(O)NH-)被例如-CH2-氨基甲酸酯键、磷酸酯键、-CH2-磺酰胺键、脲键、仲胺键(-CH2NH-)和烷基化的肽键置换[-C(O)NR6-，其中的R6是低级烷基]的肽模拟物。
合适的反应物包括例如氨基酸羧基被适合形成上述连接键之一的部分取代的氨基酸同类物。例如，如果要以-CH2-氨基甲酸酯键(-CH2OC(O)NR-)取代肽中的-C(O)NH-键，那么先将适当保护的氨基酸的羧基(-COOH)还原成-CH2OH基团，然后再利用常规方法转化成-OC(O)Cl官能度或对硝基碳酸酯，即-OC(O)O-C6H4-对-NO2-官能度。以上两种官能团与固体载体上部分合成的肽的N末端游离胺或烷基化胺反应都将形成-CH2OC(O)NR-连接键。有关形成这类-CH2-氨基甲酸酯键更为详细的说明可参见Cho等，科学》2611303-1305(1993)。
同样，以本文引用参考的美国专利申请07/943,805、08/081,577和08/119,700中所述的方式，可以以磷酸酯键置换肽内的酰胺键。
将适当保护的氨基酸的羧基(-COOH)还原成-CH2OH基团，然后再利用常规方法将羟基转化成合适的离去基团例如甲苯磺酰基，可将肽内的酰胺键置换成-CH2-磺酰胺键。甲苯磺酰基化衍生物与例如硫代乙酸反应，然后水解和氧化性氯化，将形成-CH2-S(O)2Cl官能团，该官能团置换不在羧基位置被适当保护的氨基酸的羧基。在肽合成过程中使用该适当保护的氨基酸类似物可引入置换肽内酰胺键的-CH2S(O)2NR-键，由此形成肽模拟物。有关氨基酸的羧基转化成-CH2-S(O)2Cl基团更为详细的说明，可参见例如本文引用参考的Weinstein，Boris，《氨基酸的化学和生物化学》(Chemistry &Biochemistry of Amino Acids)Vol.7，pp.267-357，Marcel Dekker，Inc.NewYork(1983)。
按照本文引用参考的美国专利申请08/147,805中所述的方式，可将肽内的酰胺键置换成脲键。
以-CH2NH-键置换肽内酰胺键的仲胺键可使用例如其酰胺键中的羰基键已被利用常规方法还原成CH2基团的、适当保护的二肽类似物来制备。例如，以二甘氨酸为例，在去保护后可将酰胺还原成胺，即H2NCH2CH2NHCOOH，后者然后以N-被保护的形式用于下一步偶合反应。这种通过还原二肽内酰胺键中羰基来制备此类类似物的方法是本领域所熟知的。
被适当保护的氨基酸类似物与相应的氨基酸一样，以相同的方式用于常规肽合成法中。例如，通常在该反应中使用3当量的被保护氨基酸类似物。使用的是惰性有机稀释剂，例如二氯甲烷或DMF时，且当有作为反应副产物的酸形成时，反应溶剂通常含有过量的叔胺以清除反应过程中产生的酸。特别好的叔胺是二异丙基乙基胺，通常按过量约10倍使用。反应的结果是在肽模拟物中引入具有非肽键的氨基酸类似物。可以根据要求重复这种取代，使得肽内从零到全部酰胺键均被非酰胺键置换。
本发明的肽还可以被环化，或在肽的两个末端引入脱氨基或脱羧基残基，由此消除末端的氨基或羧基，以便降低肽的易蛋白酶解性或限定其构象。本发明的C末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基，以及它们的低级酯衍生物，和药学上认可的盐。
根据另一较佳的实施方式，残基X3和X4独立地选自C和Hoc。所以，本发明的化合物可以以包含分子内二硫键的环化形式存在。或者，可以通过制备分子间二硫键产生二聚化合物。这些分子间或分子内二硫键衍生物可以如下表示
其中的m和n独立地为1或2。
本发明的其它实施方式提供了这些二硫化物衍生物的类似物，其中的硫被CH2基团或其它硫的电子等排物所置换。这些类似物可以从X3或X8之一为C或Hoc而另一个为α-氨基-γ-丁酸的本发明化合物，利用以下本领域已知的方法，通过分子间或分子内置换来制备
其中的p是1或2。本领域技术人员很容易理解的是，使用其它α-氨基-γ-丁酸和高半胱氨酸的类似物也可以发生以上置换。
除了上述环化方法之外，还可以使用其它非二硫化物肽环化法。这类其它环化方法包括例如酰胺环化法以及涉及到硫代醚键形成的环化法。所以，本发明化合物可以以包含一个分子内酰胺键或一个分子内硫代醚键的环化形式存在。为了证明酰胺环化法的可行性，合成了一段以ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg为基础的肽，其中的第一半胱氨酸被赖氨酸置换，第二半胱氨酸置换成谷氨酸，通过这两个残基侧链间的酰胺键形成一个环化单体。此外，为了证明硫代醚环化法的可行性，合成了一段以ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg为基础的肽，其中的第一半胱氨酸被赖氨酸置换，通过赖氨酸残基侧链与C末端半胱氨酸间的硫代醚键形成一个环化单体。由此，除了二硫化物环化法之外，酰胺环化法和硫代醚环化法均可方便地用于环化本发明的化合物。
或者，可以用一个α取代的乙酸，例如以α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸之类的α-卤乙酸在肽的氨基末端加冒，其中的α取代基是离去基团。X3是C或Hoc的本发明化合物可以通过用X3残基的硫置换离去基团来环化。参见本文引用参考的Barker等(1992)(J.Med.Chem.)352040-2048和Or等(1991)《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)563146-3149。
本发明化合物可在体外用作理解EPO生物作用的优良工具，包括评价许多被认为影响EPO的产生和EPO与EPO-R结合，或者受其影响的因子(例如EPO信号传导/受体激活的机制)。本发明化合物还可以用在开发其它结合EPO-R的化合物，因为本发明化合物提供了促进这种开发的重要的结构-活性关系(SAR)。
而且，根据与EPO受体结合的能力，本发明的肽可以用作在活细胞、固定细胞、生物液、组织匀浆、纯化的天然生物材料等中检测EPO受体的试剂。例如，通过标记这些肽，可以鉴定在表面具有EPO-R的细胞。此外，根据与EPO受体结合的能力，本发明的肽可以用于原位染色、FACS(荧光激活细胞分选)、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)等。此外，根据与EPO受体结合的能力，本发明的肽可以用于受体的纯化或纯化在细胞表面表达EPO受体的细胞(或可向内穿透的细胞)。
本发明的化合物还可以用作商品化研究用试剂，用于各种医学研究和诊断。这类用途包括但不限于(1)在各种功能测定中用作定量候选EPO激动剂活性的标定标准；(2)在随机肽筛选中用作抑制剂，即用于查找新的EPO受体的肽配体家族，所述的肽可以抑制目前所谓EPO肽的恢复；(3)用于与EPO受体共结晶，即本发明的肽可形成与EPO受体结合的晶体，从而能够测定受体/肽结构X射线结晶学；(4)测定红细胞前体细胞分化并继而激发珠蛋白合成的诱导以及血红素复合物合成增加和铁蛋白受体数量增加的能力；(5)用于维持EPO依赖性细胞系的增殖与生长，例如FDCP-1-mEPO-R细胞系和TF-1细胞系；(6)其它研究和诊断用途，其中宜激活EPO受体，或者最好用已知量的某种EPO激动剂标定这种激活作用，等等。
本发明化合物还可以对包括人在内的温血动物给药，用于在体内刺激EPO与EPO-R结合。所以，本发明包含治疗与EPO缺乏相关的疾病的方法，该方法包括给予足量的某种本发明化合物，该量足以在体内刺激EPO-R，并由此缓解与EPO缺乏相关的症状。例如，本发明化合物可用于治疗末期肾功能衰竭/透析；与AIDS相关的贫血，与慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎和慢性关节炎)相关的贫血，自身免疫疾病和恶性肿瘤；以及用于在手术前增加病人的红细胞数量。
本发明的其它实施方式提供了本发明化合物在治疗并不以红细胞缺失或缺陷为特征的疾病的应用，例如作为输血前的预处理。此外，使用本发明化合物可以缩短出血时间，所以可以用在病人的手术前给药或可能出现出血的适应征中。此外，本发明化合物可用在巨噬细胞的激活中。
由于EPO没有对血管内皮细胞的促有丝分裂和趋向化作用以及对中枢拟副交感神经元的作用(参见例如Amagnostou等(1990)《美国科学院院报》875978-5982和Konishi等(1993)《脑研究》(Brain Res.)60929-35)，本发明的化合物还可以用作治疗各种血管疾病中，例如促进伤口愈合、旁侧冠状血管的生长(例如可能发生于心肌梗塞之后的那类)、外伤、和血管移植后的处理，以及治疗各种神经疾病，后者通常以乙酰胆碱的绝对水平低或与其它神经活性物质例如神经递质相比的相对水平低为特征。
所以，本发明包括药物组合物，其中至少以本发明的肽或其它化合物之一为有效成份，并结合以药学上认可的载体或稀释剂。本发明化合物可以通过口服、肠胃外(肌内、腹膜内、静脉(IV)或皮下注射)、透皮(被动或者使用离子电渗透法或电穿孔法)、透粘膜(鼻、阴道、直肠或舌下)途径或使用可生物腐蚀的植入体给药，或者配制成适合各种给药途径的剂量形式。
适于口服的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物至少与一种惰性的、药学上认可的载体，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。正如常规过程，这种剂型中还可以包含除惰性稀释剂之外的其它物质，例如硬脂酸镁之类的润滑剂。在胶囊、片剂和丸剂中，这些剂型还可以包含缓冲剂。片剂和丸剂还可以制成另外带有肠溶包衣的。
适于口服的液体剂型包括药学上认可的乳剂、液剂、悬浮剂和糖浆，酏剂中需含有本领域常用的稀释剂，例如水。除了这些稀释剂之外，组合物还可以包含佐剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂，以及甜味剂、赋味剂和香味剂。
适于肠胃外给药的本发明制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液或乳液。非水性溶剂或媒质的实例为聚丙二醇、聚乙二醇，植物油例如橄榄油和玉米油，以及注射用的有机酯，例如草酸乙酯。这些剂型中还可以包含佐剂，例如保藏剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可以通过例如经滞留细菌的滤膜过滤，通过在组合物中加入杀菌剂，通过照射组合物，或者通过加热组合物来灭菌。它们还可以用无菌水或其它无菌的注射用介质在临使用前制备。
适于直肠或阴道给药的组合物最好是栓剂，其中除了活性物质之外还可以包含可可脂或栓剂用蜡之类的赋形剂。还可以利用本领域熟知的常规赋形剂制备适于经鼻或舌下给药的组合物。
本发明组合物中活性成份的剂量是不定的；但是，活性成份的含量必须使得能够获得合适的剂型。选用的剂量取决于要求的疗效，给药途径和疗程。对于哺乳动物，通常的给药的剂量水平在每日0.001至10毫克/千克体重之间。
由以上公开内容可以看出，本发明具有广泛的用途。所以，以下实施例以说明的方式而不是限定方式给出。
实施例1固相肽合成法本发明的各种肽在Milligen/Biosearch 9600自动仪上，利用Merrifield固相肽合成技术(参见Stewart，J.M.和Young，J.D.，《固相肽合成》(SolidPhase Peptide Sythesis)，第二版，(Pierce Chemical，Rockford，IL，1984))来合成。使用的树脂是PAL(Milligen/Biosaarch)，即以5-(4’-Fmoc-氨基乙基-3，5’-二甲氧基苯氧基)戊酸为连接剂的交联聚苯乙烯。使用PAL树脂，在将肽从树脂上分离后得到羧基末端的酰胺。用F-moc进行氨基酸上的伯胺保护，侧链保护为用于丝氨酸和酪氨酸羟基的叔丁基，用于谷胺酰胺的三苯甲游基，和用于精氨酸胍基的Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢呋喃磺酸酯)。每一步偶合用BOP(六氟磷酸苯并三唑基N-氧三二甲基氨基膦)或HOBt(1-羟基苯并三唑)进行一小时或两小时。
在用酰胺化的羧基末端合成肽时，用90％三氟乙酸、5％乙二硫醇和5％水构成的混合物，最初在4℃，然后在1.5小时内逐步升温至室温，由此分离装配完全的肽。通过过滤将去保护的产物与树脂分离，并用二乙醚沉淀。在彻底干燥之后，通过C18反相高效液相色谱，使用乙腈/水在0.1％三氟乙酸中形成的浓度梯度纯化产物。
实施例2生物测定A.FDCP-1/mEPO-R在生长因子(2.5nm EPO)存在下将FDCP-1/mEPO-R细胞(105)培养至半稳态密度。细胞在PBS中洗涤2次，然后在去除生长因子的完全培养基中饥饿24小时。
用台盼蓝染色测定细胞的活性。在无生长因子的完全培养基中制备每50微升含有所要求的细胞数量的储备液。在96孔的组织培养板上将待测化合物稀释2倍(最终，每孔50微升)。
在各孔中加入细胞(每孔50微升)并孵育24至48小时(此时，阴性对照将死亡)。利用MTT测定法来测定细胞的增殖。
B.TF-1又进行了Kitamura等所述的方法《血液》，73375-380(1989)，本文引用参考)以证明本发明化合物作为EPO激动剂的活性，该方法涉及具有EPO生长依赖性的TF-1细胞系。图8显示了代表性的结果。图8显示了EPO和肽VGNYMCHFGPITWVCRPGGG对TF-1细胞系的细胞增殖的作用。
C.脾细胞的增殖又使用了Krystal所述的方法(《实验血液学》(Exp.Hematol.)11649-660(1983)，本文引用参考)以确定本发明化合物作为EPO激动剂的能力，该方法是以3H-胸苷掺入脾细胞为基础的微测定法。简而言之，B6C3F1小鼠被连续两天每日输注苯肼(60毫克/千克)。第三天，取出脾细胞，并用MTT测定确定细胞在24小时内的增殖能力。图9A(对照)，9B(用500皮摩尔浓度(pM)处理)和9C(用25微升GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG处理)给出了放大200倍的照片，显示的是代表性脾细胞种群的增殖情况。
D.细胞增殖EPO-应答性细胞系，FDC-P1/ER的肽依赖性生长1.材料和方法a.样品的制备将肽悬浮在DMSO中成为1×10-2M的储备液，按10倍递增连续稀释，形成以下100倍的溶液1×10-31×10-41×10-51×10-61×10-71×10-8在各细胞测试孔中加入2微升的各储备稀释液，如下所述形成200微升的最终体积，形成以下最终浓度1×10-51×10-61×10-71×10-81×10-91×10-10b.细胞增殖测定i.细胞源FDC-P1/ER(Dexter等，《实验医学杂志》(1980)1521036-1047，本文引用参考)，是一种已被充分描述清楚的非转化鼠骨髓衍生细胞系，其中已经稳定转染了红细胞生成素受体。细胞表现出EPO依赖性增殖。
c.实验方案将维持在RPMI 1640/10％胎牛血清/抗体和10单位/毫升(U/ml)红细胞生成素中的细胞培养至稳定期。收获细胞并重悬在无生长因子(红细胞生成素)的新鲜培养基中，培养24小时。计数细胞，并重悬成800,000细胞/毫升的浓度。在96孔微量滴定板的各孔中加入约4万(50微升)细胞。在每三个平行测试孔中加入肽。对各系列的肽进行标准量效测定。在培养42小时后(约等于2倍倍增时间)，各孔用1微居里(μCi)/孔的胸苷脉冲。将细胞再培养6小时，此时收获细胞并计数，以评价作为细胞增殖指示剂的胸苷的掺入。
d.结果根据红细胞生成素受体细胞系和无受体亲代细胞系对肽进行了评价。在大多数情况下，肽已事先在一截短的人红细胞生成素受体细胞系上进行了评价。结果被表示为获得使用重组红细胞生成素所得最大活性一半所需的肽量。以表格显示来报道代表性结果以及相对结合数据。(参见后文的表17-22。)E.酪氨酸的磷酸化肽诱导的红细胞生成素和胞内蛋白酪氨酸的磷酸化1.材料和方法a.样品的制备肽在DMSO中悬浮成1×10-2M的浓度。
b.实验方案将维持在RPMI 1640/10％胎牛血清/抗体和10单位/毫升红细胞生成素中的FDC-P1/muER细胞培养至稳定期。收获细胞并重悬在无生长因子(红细胞生成素)的新鲜培养基中，培养24小时。计数细胞，并重悬成500,000细胞/毫升的浓度。在eppendorf试管中加入1毫升(ml)细胞(500,000)。在细胞中加入1微升1×10-3的肽溶液(最终浓度为1×10-5摩尔浓度(M))，并在37℃培养10分钟。对各次测定都进行一份红细胞生成素的对照(最终浓度为10单位/毫升)。在4℃，以14,000rpm离心收集细胞。将细胞重悬在100微升SDS裂解缓冲液中，并接受SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶转移到硝酸纤维素薄膜上，用1∶1000稀释的抗磷酸酪氨酸抗体(Upstate Biotechnology Incorporated)检测1小时。薄膜用Tris缓冲盐溶液洗涤，并用抗鼠辣根过氧化物酶标记的抗体再次检测。用ECL Wstern印迹试剂(Amersham)显示反应反应蛋白。
C.结果在红细胞生成素应答性细胞系中，红细胞生成素与其受体的结合诱导受体和多种胞内蛋白的酪氨酸的磷酸化，这些胞内蛋白包括Shc、vav和JAK2激酶。对包括GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG在内的多种肽进行了分析，以评价它们模拟使用红细胞生成素所观察到的应答的能力。根据结合作用和增殖作用标准进行判断，在红细胞生成素应答性细胞中，活性肽引起与红细胞生成素相同的磷酸化方式。以上结果表明，活性肽通过红细胞生成素诱导的信号传导路径引起它们的应答反应。以表格形式报道结果以及结合和增殖数据。(参见后文的表17-22。)F.细胞应答的动力学利用DNA测定肽诱导的细胞周期的起始1.实验方案将FDC-P1/muER细胞培养至稳定期，约等于3.0×106个细胞/毫升。收集细胞，将其重悬在无因子的新鲜培养基中，再培养18小时，然后将细胞分在3个烧瓶中，细胞密度相同-因子，+EPO和+肽。然后用10单位/毫升或10微摩尔浓度的肽刺激细胞。在以下时刻收集三百万细胞第0、6、8、10和12小时。(参见图15)。细胞用冷的PBS洗涤两次，并通过将细胞沉淀重悬在100微升冷PBS然后加入900微升70％冷乙醇来固定。用50微克/毫升碘丙锭染色细胞，并在FACS扫描流动细胞计数仪上进行测定。用Becton DicKinson CellFIT软件的SOBR型测定各时期细胞的百分比。
在细胞沿细胞周期的进程中，红细胞生成素(10单位/毫升)与GGTYSCHFPLTWVCKPQGG(1×10-5摩尔浓度)是等效的。在10小时后引入红细胞生成素或肽，相比介质对照的15％，约45％的细胞处于S期。该结果表明，肽能够引起动力学与重组红细胞生成素相同的应答。
G.集落分析鼠骨髓和人外周血集落分析1.材料与方法在标准无菌肝素真空试管(vacutainer tube)中收集获自健康个体的10毫升外周血样品。每个实验从约10头小鼠的大腿骨节获取鼠骨髓。所有试剂来自Stem Cell Technologies Inc.(Vancouver，Canada)。
a.实验方案简而言之，进行具核细胞计数，以确定原始样品中具核细胞的数量和浓度。以外周血为例，在室温下对样品进行通过Ficoll-Hypaque(1.007克/毫升)梯度的400g离心30分钟。小心地抽取位于Ficoll-Hypaque界面的单核细胞，并稀释至约10毫升的最终体积。离心收集获自鼠骨髓或人外周血的细胞并倾析去除上清液。将沉淀的细胞重悬在新鲜培养基中，并进行前述收集。将洗涤后的细胞稀释在Iscove培养基/2％胎牛血清中，形成以下浓度用于平板培养正常骨髓1×105低密度细胞正常血液4×105低密度细胞根据制造商的说明将细胞加到甲基纤维素薄膜上。在以下最终浓度下对肽进行测定“无EPO”甲基纤维素培养基中1×10-6和1×10-5摩尔浓度。将当量细胞数平板培养在“完全”甲基纤维素培养基中，以获得最大的集落形成。对每个无EPO测定进行一个对照平板培养，用于确定背景集落形成。在培养10天和18天后两次测评集落。
b.结果如表13至15所示，在鼠骨髓和人外周血中，GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG能够促进集落的形成，虽然其水平明显低于在“完全”甲基纤维素培养基(红细胞生成素3单位/毫升)上获得的。
表13 以人外周血样品进行的集落测定(供体男性)(起始时间2/10/94)时间 样品 CFU-EMBFU-EPBFU-ECFU-GM2/23/940 XX X XDMSOXX X XEPO(METHOCULT) 11 25X XEPO(3U/ml) 77 X XAFFY 244 10-5M 10 5 X XAFFY 244 10-6M 11 5 X X3/4/94 0 XX X XDMSO XX X XEPO(METHOCULT) 111139EPO(3U/ml)47 7 3AFFY 244 10-5M 79 2 4AFFY 244 10-6M 6111 2CFU-E集落形成单位-红细胞性(1-2簇)MBFU-E成熟爆发形成单位-红细胞性(3-8簇)PBRU-E原始爆发形成单位-红细胞性(大于或等于9簇)CFU-GM集落形成单位粒细胞性/单核细胞/巨噬细胞表14集落形成细胞的数量(鼠骨髓)1/28/942/10/94AFFY11157/AFFY224前祖细胞对照 EPO 10-5M 10-6MCFU-E 0 23 23BFU-E 0 500CFU-GM 0 3002/10/94AFFY11157/AFFY224前祖细胞对照 EPO 10-5M 10-6MCFU-E 0 000BFU-E 0 30 24CFU-GM 0 000AFFY11157＝ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg
表15 集落形成细胞的数量(鼠骨髓)2/21/943/1/94 AFFY11157/AFFY224前祖细胞 对照 EPO 10-5M10-6MCFU-E 0 39 0BFU-E 0 3120CFU-GM 0 ＞10 0 03/14/94AFFY11157/AFFY224前祖细胞 对照 EPO 10-5M10-6MCFU-E 0 01 0PBFU-E 0 10 8 0MBFU-E 0 04 0CFU-GM 0 26 0 0H.肽诱导的增殖对红细胞生成素不应答的细胞系的肽依赖性生长a.实验方案如上文D部分所述测定肽。使用各细胞系对应的有丝分裂原/生长因子，绘制生长曲线，用于评价生长能力。
b.结果如表16所示，GGTYSCHFGPLTXVCKPQGG不能够激发非红细胞生成素应答性细胞系的生长应答，其中既包括造血细胞系也包括非造血细胞系。
表16 用61233进行的细胞增殖测定细胞类型 物种EPO61233 生长因子应答造血细胞TF-1 人 + + GM-CSF，IL3(红细胞性)M-07E人 - - GM-CSF，IL3(成巨核细胞性)AML193 人 - - GM-CSF，G-CSF，IL3(单核细胞性)T细胞克隆人 ND - IL2成骨细胞TE85 人 - - 血清MC3T3鼠 - - 血清乳腺细胞T47D 人 ND - 孕酮
I.以固定化EBP为基础的[125I]EPO竞争性结合测定在大肠杆菌中表达并过量产生人红细胞生成素受体(EPO结合蛋白，EBP)的胞外区域。与用作大肠杆菌中的许多其它重组真核蛋白一样，该蛋白在实验室规模的发酵中表现为不可溶性产物，经重折叠和纯化后得到活性蛋白质。作为该方法产生的EBP含有一个游离的巯基，对该基团的修饰不影响配体的溶液相结合。为了固定化EBP用于平衡结合测定和作为竞争性结合测定的基础，为使EBP与琼脂糖微珠的共价结合而对该结果进行了进一步的研究。Sufolink微珠(Pierce Chemical Co.Rockford，IL)的碘乙酰基活化化学具有游离硫醇特异性，从而确保了该连接一般是不可逆的。EBP-Sulfolink微珠是如下制造的Sulfolink凝胶悬浮液(10ml)与偶合缓冲液(40ml50mM Tris，pH8.3，5mM EDTA)混合，然后任凝胶沉淀。去除上清液，在洗涤后的微珠中直接加入待结合的EBP(0.3-1mg/ml的偶合缓冲液溶液)。混合物在室温下轻微晃动30分钟，任微珠在室温下沉淀1小时。分离出上清液并保留，微珠用20毫升偶合缓冲液洗涤两次。同上收集洗液。然后在室温下用0.05M半胱氨酸20毫升处理微珠30分钟以封闭未结合位点。最后，微珠先用50毫升1M的NaCl洗涤，再用30毫升PBS洗涤，然后重悬在20毫升PBS中，于4℃保存待用。通过将原EBP溶液的OD280与反应上清液和两份20毫升洗液的总OD280比较，测定出与微珠共价结合的EBP的量。通常，使用的EBP中40％至60％与微珠结合。
通过将EBP微珠(50微升)加入各反应试管来开始结合测定。在含有0.3至30nM125I-EPO(NEN Research Products，Boston MA，100微居里/微克)的试管中测定总结合。为了测定非特异性结合，加入比相应的125I-EPO浓度过量1000倍的非标记EPO。各反应的体积都用结合缓冲液(PBS/0.2％BSA)定容至500微升。试管在室温下轻微晃动孵育5小时(经实验测定，该时间对建立平衡态已足够)。5小时后，将各反应混合物通过一塞有玻璃纤维的1ml移液管管尖。试管用1毫升洗涤缓冲液(PBS/5％BSA)洗涤，将该洗液以及另外2份1毫升的洗液通过移液管管尖并收集以用于测定游离EPO浓度。有关[125I]EPO与固定在琼脂糖微珠上的EBP之间特异性结合的平衡结合测定显示，根据结合等温线的线性转化(Scatchard)，Kd值为5nM±2。(参见图16)如下进行候选肽的竞争性结合测定。将各肽溶解在DMSO中制备成1mM的储备溶液。所有反应试管(双份)在各自总共500微升的结合缓冲液中含有50微升EBP微珠，0.5nM[125I]EPO和0至500μM肽。在各测定试管中将DMSO的最终浓度都调节至2.5％，该值没有可测性影响，因为就测定对DMSO灵敏度的检查证明高至25％的DMSO(VV)对结合没有不利的影响。在每次测试中通过结合含有大量过量的非标记的EPO(1000nM)的试管来测定非特异性结合。在每次测试中将不加肽的初始测定点包括在内，以确定总结合。结合混合物在室温下轻微晃动培养过夜。然后用Micro-clumns(Isolab，Inc.，Akron，Ohio)收集微珠并用3毫升的洗涤缓冲液洗涤。将含有洗涤后微珠的色谱柱放在12×75mm的玻璃试管中，用γ计数器测定被结合的放射性水平。将结合的[125I]EPO表示为相当于对照结合(总和＝100％)的百分比，并在就非特异性结合进行了校正后对肽浓度制图。IC50定义为将[125I]EPO与EBP微珠的结合减少50％的肽浓度。全部数据都是关于IC50为50μM的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ61233)的。(参见后文表17至22)
表17.GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG取代系列SEQ ID 序列
EPO-ED50磷酸化1NO. (μM)
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 +61231GGTASCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA -61520GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA -61598GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG 12 IA -61277GGTYSCHFGALTWVCKPQGG 2 0.1 +61278GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG 18 IA -61313GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG 16 IA -61314GGTYSCHFGPATWVCKPQGG 1 .2 +61395GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG ＞100 IA -62145GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG 6 0.2561530GGTYSC-FGPLTWVCKPQGG 40 IA -*获得EPO依赖性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM浓度测得2IA＝无活性的
相对于RWJ-61233的结合
注全部肽都是环化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受测定61233＝AFFY11157＝AFFY 244
表18.GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG截短系列RWJ No.序列
EPO-ED50磷酸化1(μM)
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 +61596GGTYSCHFGPLTWVCKPQ1.60.08+61597TYSCHFGPLTWVCKPQGG8 2 +61230TYSCHFGPLTWVCKPQ 6 2 +61232YSCHFGPLTWVCKP9 20 +/-61279YSCHFGPLTWVCK 14 3 +/-61477YSCHFGPLTWVC 50 IA2 -61895YSCHFGALTWVCK 32 IA61513Y-CHFGPLTWVC 12 2 +61177SCHFGPLTWVCK 18 IA -AF11154 GGCRIGPITWVCGG13 IA -61394HFGPLTWV ＞100 IA -*获得EPO依赖性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10uM浓度测得2IA＝无活性的
相对于RWJ-61233的结合
注全部肽都是环化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受测定61233＝AFFY11157＝AFFY244
表19.序列类似的肽RWJ 序列
EPO-ED50磷酸化1No.(μM)
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 +61721
＞100 IA261718GGLYACHMGPMTWVCQPLRG 0.60.161719GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG 8 961720GGLYTCRMGPITWVCLPAGG ND -61717GGNYYCRFGPITFECHPTGG ＞100(S1)IA*获得EPO依赖性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM浓度测得2IA＝无活性的
相对于RWJ-61233的结合
注全部肽都是环化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受测定61233＝AFFY11157＝AFFY244
Table 20.第4位取代的系列RWJ No.(X) 序列
EPO-ED50(μM)*鼠受体 截短的人受体
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 0.161231 GGTASCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA261520 GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA61598 GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG 12 IA61894 p-NO2-Phe GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 17 IA 0.862019 p-NO2-Phe GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 18 IA 3.062020 p-F-PheGGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 8 1.0 0.162021 3，5-二溴-tyr GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 30 IA IA*获得EPO依赖性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM浓度测得1ND＝未测定2IA＝无活性的
相对于RWJ-61233的结合
注全部肽都是环化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受测定61233＝AFFY11157＝AFFY244
Table 21.第17位取代的系列序列No. 序列 相对结合**EPO-ED50(μM)鼠受 截短的 人受体体人受体65876 GGTYSCHFGPLTWVCK＞20*100.310AQGG**相对于61233的结合＝AFFY11157＝AFFY244*溶解性受到限制
Table 22.GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG为基础的差异活性系列RWJ No. 序列
EPO-ED50(μM)*鼠受体 截短的人受体
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG10.1 0.161596GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 1.6 0.080.0261718GGLYACHMGPMTWVCQPLRG0.6 0.1 0.08AF11288 GGLYACHMGPMTWVCQPLRG0.2 0.15ND161757LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD 10.110.15(H22)AF11654 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 10.2 0.0262145GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG60.250.562146Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 40.030.0661894GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG17 IA2 0.8p-NO2-Phe62019GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG18 IA 3.0p-NH2-Phe62020GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG81.0 0.1p-F-Phe*获得EPO依赖性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM浓度测得1ND＝未测定2IA＝无活性的
相对于RWJ-61233的结合
注全部肽都是环化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受测定61233＝AFFY11157＝AFFY244J.去缺氧性红细胞增多症(Polycythemic Exhypoxic)鼠生物测定雌性BDF1小鼠(18至20克)接受18小时0.40±0.02大气压和6小时环境气压的适应循环(在低压舱中)，为期14天。
在给予r-HuEPO或测试样品前的72小时，将鼠维持在环境气压下。为了给适应后的小鼠注射，将测试样品和r-HuEPO标准物稀释。媒质包括含0.1％BSA(w/v)的PBS。对于每种稀释液，给10小鼠皮下注射0.5ml。在48小时后给予59Fe。给予59Fe 48小时后采取血样。测定每份样品的血细胞比容和放射活性。后文表23和图17A至17C中给出了剂量范围和结果(两次不同的测定)。
表23剂量n 对数(log)平均值EPO标准物 0.000U 10 0.260.025 10 1.650.050 10 2.740.100 10 3.28DMSO 1.40％ 7 0.580.35％ 5 0.60244-1 0.25μg 7 0.620.508 0.761.009 0.92244-2 2.009 1.384.0010 1.818.009 2.26244-3 14.010 2.4428.010 3.1556.09 3.160.1mg AFFY244≈1Ur-HuEPO(8.3ng)此外，利用以上去缺氧性红细胞增多症鼠生物测定，对TIAQYICYMGPETWECRPSPKA和含有两个二硫键的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚体肽类似物(AF12080)进行了测试。图18A至18B给出了去缺氧性红细胞增多症鼠生物测定的结果。此外，后文表24给出了EPO和各种模拟肽的大致当量。
表24肽 相当于0.025单位EPO的肽当量(纳摩尔浓度)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 3.8(RWJ61233/AFFY11157)GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 0.5(RWJ61596)LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD 3.1(RWJ61757)TIAQYICYMGPETWECRPSPK11-21(AAFY11654)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 二 0.035聚体(AFFY12080)K.网织红细胞测定正常的未处理过的雌性BDF1小鼠被连续3天皮下给予EPO或实验化合物(0.5ml，S.Q.)。媒质PBS，10％PEG8000，0.25％BSA，并加入DMSO。在第三天，小鼠还被给予(0.1ml，I.P.)葡聚糖铁(100mg/ml)。在第五天，用CO2麻醉小鼠，并利用心脏穿刺放血。利用三唑橙染色和流动细胞计数(网织红细胞计数程序(retic-count program))测定网织红细胞的百分比。人工测定血细胞比容。利用以下公式计算校正后的网织红细胞百分比％网织红细胞(RETIC.)(校正值)＝％RETIC.(实测值)×血细胞比容(Hct.)(个体值)/Hct.(一般值)图18A至18B和图19A至19B给出了利用以上网织红细胞测定测得的结果。
L.集落测定红细胞系集落的形成1.材料与方法将取自正常供体的人具核骨髓细胞平板培养在半固体甲基纤维素培养基(0.9％甲基纤维素，30％胎牛血清，1％牛血清白蛋白，10-42-巯基乙醇，2mM L-谷胺酰胺)中。简而言之，收集细胞，加入经缓冲的氯化铵裂解红细胞。将细胞重悬在含2％胎牛血清的培养基中，并以2×105个细胞每平板的密度进行一式两份的平板培养。对12天后形成的红细胞素和粒细胞-巨噬细胞(G-M)集落进行颜色和形态测评。在研究中包含一个对照平板，其中含有用于获得样品的GM集落形成的重组人生长因子IL-3、GM-CSF和SCF(3/GM/S)。
每2×105个具核细胞的集落数红细胞系 G-M生长因子(nM) 平板1 平板2 平板1平板2对照(无因子) 0 0 00EPO(0.24)113 106 12 9RWJ 61233(1000) 292312RWJ 61233(10,000)8075203/GM/S(0.7/0.7/2.7) 0 0 176 2122.结果根据以上数据，很明显，GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ61233/AFFY11157)能够在没有其它细胞因子存在下促进红细胞系集落的形成。此外，肽不能够促进GM系细胞集落的形成，由此表现出对红细胞系严格的特异性。
应该认为，以上说明是为了说明本发明而不是限定本发明。在阅读了以上说明书后，对本领域技术人员来说，许多实施方式将是显而易见的。所以，本发明的范围不应由以上说明书来确定，而应该由后文的权利要求来确定，而且包括与权利要求所及相当的全部范围。本文引用参考了所述及的全部文献和参考资料，包括专利公告。
权利要求
1.长度为10至40个氨基酸、结合红细胞生成素受体的肽，它包含氨基酸序列X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X6独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
2.根据权利要求1所述的肽，它包含氨基酸序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X2和X6各自独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。3.根据权利要求2所述的肽，它包含氨基酸序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X1、X2、X6、X9、X10和X11各自独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
4.根据权利要求3所述的肽，其中X4是R或H；X5是F或M；X6是I、L、T、M、E或V；X7是D或V；X9是G、K、L、Q、R、S或T；X10是A、G、P、R或Y。
5.根据权利要求4所述的肽，其中X1是D、E、L、N、S、T或V；X2是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9是K、R、S或T；X10是P。
6.根据权利要求1所述的肽，它选自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
7.根据权利要求1所述的肽，它选自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；和HFGPLTWV.
8.根据权利要求1所述的肽，所述的氨基酸序列是环化的。
9.根据权利要求8所述的肽，它选自GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；YSCHFGALTWVCK；SCHFGPLTWVCK；GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和
10.根据权利要求1所述的肽，所述的氨基酸序列是二聚化的。
11.根据权利要求11所述的肽，它包含以下氨基酸序列GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
12.包含权利要求1所述的化合物和药学上认可的载体的药物组合物。
13.治疗以缺乏红细胞生成素或红血细胞群缺少或缺陷为特征的疾病患者的方法，它包括给病人使用治疗有效量的权利要求1所述的肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中的疾病是末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫疾病，或恶性肿瘤；β-地中海贫血；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴随有异常红细胞产生的肿瘤疾病。
15.根据权利要求13所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X2和X6各自独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
16.根据权利要求15所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X1、X2、X6、X9、X10和X11各自独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
17.根据权利要求16所述的方法，其中X4是R或H；X5是F或M；X6是I、L、T、M或V；X7是D或V；X9是G、K、L、Q、R、S或T；X10是A、G、P、R或Y。
18.根据权利要求17所述的方法，其中X1是D、E、L、N、S、T或V；X2是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9是K、R、S或T；X10是P。
19.根据权利要求13所述的方法，其中的肽选自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
20.根据权利要求13所述的方法，其中的肽是环化的。
21.根据权利要求13所述的方法，其中的肽是是二聚化的。
22.治疗以缺乏红细胞生成素或红血细胞群缺少或缺陷为特征的疾病患者的方法，它包括给病人使用治疗有效量的某种肽，所述的肽长度为10至40个氨基酸，它结合红细胞生成素受体，并包含氨基酸序列X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQ IDNO)，每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X6独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
23.根据权利要求22所述的方法，其中的疾病是末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫疾病，或恶性肿瘤；β-地中海贫血；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴随有异常红细胞生产的肿瘤疾病。
24.根据权利要求22所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X2和X6各自独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
25.根据权利要求24所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11，其中每个氨基酸均由一个标准单字母缩写标示；X1、X2、X6、X9、X10和X11各自独立地选自20个遗传性编码的L-氨基酸中任意一个；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
26.根据权利要求25所述的方法，其中X4是R或H；X5是F或M；X6是I、L、T、M或V；X7是D或V；X9是G、K、L、Q、R、S或T；X10是A、G、P、R或Y。
27.根据权利要求26所述的方法，其中X1是D、E、L、N、S、T或V；X2是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9是K、R、S或T；X10是P。
28.根据权利要求22所述的方法，其中的肽选自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
29.根据权利要求22所述的方法，其中的肽是环化的。
30.根据权利要求22所述的方法，其中的肽是是二聚化的。
全文摘要
本发明涉及长度为10至40个或40个以上的氨基酸残基、具有序列X
文档编号A61P7/06GK1192748SQ96196094
公开日1998年9月9日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者N·C·赖顿, W·J·道尔, R·S·张, A·K·摩腾, L·K·乔利夫, D·约翰逊, L·马尔卡希 申请人:奥尔托药品有限公司, 阿弗麦克斯技术股份有限公司