聚氧烃基相关产物和荧光测定方法

专利名称：：聚氧烃基相关产物和荧光测定方法
技术领域：
：本发明涉及分析领域，特别是荧光免疫测定，受体测定和杂交测定。
背景技术：
：物质的存在或其量的测定通常采用免疫测定法进行。免疫测定技术基于受测抗原物质(“靶分析物”)与靶分析物的受体结合。术语“分析物”或“靶分析物”是指测定中的待测定化合物，它们可以是天然存在的受体或可制备的任何化合物，它们为单一或多表位，抗原或半抗原，单个或多个化合物共有至少一个共同表位部位或受体。免疫测定法适用于多种不同的生物活性物质的测定。这些物质包括半抗原，激素，γ-球蛋白，变应原，病毒，病毒亚基，细菌，毒素如与破伤风和动物毒液有关的毒素，以及众多药物。类似技术可用于带有例如特异性结合蛋白的非免疫系统。已知本领域有多种不同类型的免疫测定方法，包括竞争性抑制测定法，顺序加入测定法，直接“三明治”测定法，放射变应原吸附测定法，放射免疫吸附测定法和酶联免疫吸附测定法。大多数免疫测定所进行的基本反应是通过特性蛋白(受体)结合某些称作“配体”或“分析物”的物质以形成大分子复合物。这些结合过程是可逆反应，而且对于特定浓度的分析物和受体，复合物形成的程度受质量作用定律的平衡常数控制。因此，在平衡情况下，一些分析物常常处于未结合(游离)状态。生物液体(如血清，血浆和全血)中的靶分析物的测量需要特异性的而且灵敏的免疫测定法。免疫测定的特异性和灵敏度取决于所涉及的靶分析物和受体之间的相互结合的特性。例如，反应对于待测量的分析物必须是特异性的，而且所用受体不应当与任何其它结构相关的化合物结合。此外，通过选择对靶分析物具有高亲和性的受体，可以增加灵敏度。用于监测测定反应的标记物也影响免疫测定的灵敏度。无论是靶分析物还是受体都可被标记以进行检测。通常用于免疫测定生物液体中靶分析物的标记物包括放射性同位素(放射免疫测定，RIA)，酶(酶免疫测定，EIA)，荧光标记物(荧光免疫测定，FIA)，和化学发光标记物(化学发光免疫测定，CIA)。从理论上来讲，荧光测定法可能是所有分析方法中最灵敏的方法之一，这是由于该方法能检测单光子事件。FIA使用荧光分子作为标记物，而且可以是异质或均一的。荧光分子(荧光团)是能在某一波长下吸收光并在另一波长处发射光的分子。参见P.Moyer等人的“应用治疗药物检测”(AppliedTherapeuticDrugMonitoring)中的“荧光测定——治疗药物测量应用”(Burd，J.F.，“Fluoroimmunoassay--ApplicationtoTherapeuticDrugMeasurement”)一文，美国临床化学协会(AmericanAssociationofClincalChemistry)(1984)。一般地，将激发脉冲导向样品其上或其内，接着产生样品荧光，并检测荧光辐射。荧光是某些物质所显示的一种现象，当用其它光源照射时，这些物质会发射通常位于可见光范围内的光线。这种现象不属于反射，而是产生新光线。目前商品化的测定方法均使用荧光素，当用含蓝光的光源辐射时，这类物质能发射绿光。除荧光外，荧光素(以及其它荧光团)还发射偏振光。也就是说，如果荧光素分子保持其跃迁距与激发电场平行，则发射光具有和入射偏振光相同的偏振方向。在竞争性结合免疫测定中使用荧光偏振探针，可以提供一种称为荧光偏振免疫测定(FPIA)的FIA。在这种测定中，分子越小，其旋转弛豫时间就越短，旋转得越快。一般地，抗体分子要远远大于药物或药物一探针分子。偏振技术的优点之一是消除了分离未结合探针的步骤。尽管在FPIA中未结合痕量物实际上不能物理地从样品中除去，但其作用很容易通过偏振化确定。FPIA技术的另一优点是无强度依赖性。大多数利用光测量的测定中，光的强度与药物浓度相关(因此，光源强度的任何变化都将直接影响测定的灵敏度)，但FPIA法则与上述这些方法不同，该方法的灵敏度与强度变化无关。常规的FPIA法需要分别测量空白对照和样品。困扰荧光免疫测定的难题是从背景辐射中辨别出有用的荧光信号。背景辐射的信号强度可以比有用的荧光信号的强度大10,000倍。背景检测的困难在生物样品测定中特别明显。目前多种荧光测定方法中均使用荧光素这种荧光分子。荧光素具有最大493nm的激发波长，而生物液体中有许多物质具有与荧光素类似的重叠激发和发射波长。例如，在测定血浆时，天然荧光物质胆绿素的存在能造成显著的背景辐射。这类化合物是高荧光性的并产生明显的能干扰标记物信号的背景信号，从而限制了采用荧光素标记物的测定灵敏度。通常认为与难以处理的背景辐射有关并起作用的两种因素包括(1)溶剂敏感性和(2)非特异性结合。溶剂敏感性是指溶剂影响染料的荧光信号的倾向性。例如，在有机溶剂中发荧光的几种染料往往在水溶液中会发生聚集，因而显示出猝灭荧光。非特异性结合是指样品组分干扰染料荧光信号的倾向。例如，血清组分如HSA往往与常规荧光染料结合，并猝灭或增强对荧光信号的干扰。现已认识到，对于生物液体的分析，最好使用能在大于背景辐射的波长辐射下激发的染料或标记物。然而，即使在大约600nm波长时血清的背景荧光下降，在直至650nm或更长的波长下仍存在有明显干扰。因此，先前试图寻求这种波长的染料的尝试都是不成功的。例如，参见，Rotenberg，H.和Margarfit，R.，生化杂志(Biochem.Journal)，229197(1985)；和D.J.R..Laurence，生化杂志(Biochem.Journal)，51168(1952)。具有能减少背景荧光干扰的发射波长的荧光染料包括花青染料，卟啉染料和氮杂卟啉染料。然而，现已分析，这些标记物在荧光测定中的使用受下列因素限制溶剂敏感性(与二甲基甲酰胺相比，荧光强度在水基测定溶液中明显降低)和对生物物质的非特异性结合(与含血清组分如HSA的样品相比，荧光强度在纯化或分离样品中明显降低)。使用具有较长衰变期的荧光团在例如瞬态测定的应用中尤为重要，这些测定需要能在长至大约20纳秒的时间内测量其发射的荧光团。已经发现，荧光团的天然寿命和消光系数呈相反比例变化(即当一种参数增大时，另一参数降低；不过它们不必要以彼此相反的速率变化)。同样，具有较长荧光寿命的荧光团更易于被减活。因此，具有增大的衰变时间(即具有接近其天然寿命的衰变时间)的荧光团能提供较大的量子产率，因而灵敏度也更高。早期所进行的克服背景辐射难题的尝试包括(1)使用滤光片滤除所限定的窄波长带之外的所有检测辐射；(2)将荧光探针与大分子载体结合，从而使血清蛋白的作用减至最低，以能够检测与靶分析物的结合，(参见，U.S.P.4,615,986,1986年10月7日授权)；和(3)使用用于改进染料的官能特性的化学基团(参见Mujumdar等人，生物共轭化学(BioconjugateChemistry)4105-110，1993)。Arnost等人在USP4,886,744(1989年12月12日授权)(“Arnost”)中描述了具有下述不对称花青染料结构的荧光标记物R基团中的一些可以是“亲水基”。亲水基定义为用于降低聚集和非特异性结合的各种可能基团，包括聚醚。据认为，Arnost所提供的数据表明，一些“亲水基”能在一定程度上减少非特异性结合，并将结合常数从7E5降到1.5E4，倍数小于50。Arnost等人的组分一般具有小于500nm的最大激发波长。发明概述本发明涉及标志组分、荧光探针、低聚核苷酸、杂交测定和使用这类产物的免疫测定以及制备这类产物的方法。根据本发明，提供了被可检测标记的标志组分，该组分包括偶联有一个或多个聚氧烃基部分的荧光团部分。聚氧烃基部分能有利地减轻或消除溶剂敏感性和非特异性结合的难题。在免疫测定中使用这类可检测的标记物或标志组分是有利的，因为这些标记物在有或无生物液体如血清存在下，具有基本上与瞬态荧光发射的平行和正交组分相同的强度。因此，采用这些标记物的测定方法能够检测生物液体中的低浓度靶分析物。这些标志组分可用作标记分析物、抗原、抗体或其它分子的标记物。这些标志组分可任选地官能化以包含连接臂，这种连接臂使得标志组分能与分析物、抗原、抗体或其它分子连接。文献中已描述了适合于此目的的各种连接臂。Kricka，J.J.；配体一结合物测定；标记物和分析策略(Ligand-BinderAssays；LabelsandAnalyticalStrategies)；15-51页；MarcelDekker，Inc.，NewYork，NY(1985)。采用常规技术使标志组分与分析物、抗原、抗体或其它分子连接。本发明一方面提供了被可检测标记的标志组分，该组分包括(1)荧光团部分，该荧光团部分包括能发光的基本上为平面的分子结构，发射波长至少约500nm，和(2)与荧光团偶联的一个或多个聚氧烃基部分。本文详细描述了优选的荧光团、聚氧烃基部分和这两者之间的连接基的实例。此外，所提供的证据还表明了这些标志组分在降低溶剂敏感性和减少非特异性结合方面的效果。在特别优选的实施方案中，本发明的标志组分可用于制备探针[见我们1993年4月21日递交的美国专利申请08/051,446中的一般性描述]，并可用于免疫测定[见我们1993年3月23日递交的美国专利申请08/035,633中的一般描述]。这两篇文献的全部内容(包括附图)在此引入本文用作参考。附图简述图1为双活性CY5.5和PEG-胺在0.1M，pH9.3碳酸盐缓冲液中进行的反应的RPHPLC洗脱曲线。其中峰9和10中无非特异性结合。图2类似于图1，只是反应是在无水条件下于DMF和NMP中进行。峰a，b和c均显示出较强的非特异性结合，而峰1和2中则无非特异性结合。图3为与图2中所述相同的反应混合物在经过旋转蒸发除去DMF和NMP和真空干燥之后的RPHPLC洗脱曲线。图4为用BiogelP-6分离时快速移动峰的RPHPLC洗脱曲线。图5类似于图4，只是为P-6分离时的慢移动峰的RPLHLC流出曲线。图6说明了在用一组血清组分进行试验以揭示非特异性结合时，反应混合物199-146A(在DMF+NMP中的反应)的RPHPLC馏分的情况。瞬态荧光的偏振可作为非特异性结合的指数。作为参考，还说明了本发明特别优选的染料LaJolla蓝的数据。每组中的第一条给出了染料或仅在缓冲液(TDX缓冲液)中所观测到的馏分的偏振。数据表明，在采用试验盘进行试验时，峰A，B和C(分别对应于图2中的a，b和c)强烈结合，而当用LaJolla蓝时，峰1(图2)和峰2(图2)则显示出可忽略的结合。LaJolla蓝(197239B)，在缓冲液中峰1和峰2的偏振之间的差异仅反映了不同染料结构的光物理性质的差异，而与聚集或是否存在非特异性结合无关。因此，可以看出，CY5.5在与PEG一胺反应之后实质上无非特异性结合，而且峰a，b和c对应无屏蔽、无保护染料的各种形式，而峰1和2是与PEG偶联。图7说明了可用于本发明的其它染料的实例。化合物编号对应于有机着色剂(Okawara等，1986)中所用的那些编号，此文献的全部内容(包括附图)在此引入本文用作参考。发明详述下面描述中包括实施本发明的优选方式，只是用于说明本发明的一般原理，而不以任何方式限制本发明。I.优选的标志组分A.优选的荧光团部分一般来讲，优选的荧光团部分为使用波长约200至约1000纳米，优选使用波长约600至约800纳米，更优选大于650nm的光激发时能有效产生荧光的荧光团。合适的荧光团包括下述荧光团，它们应能在不同于其它溶液组分(如样品中存在的蛋白质)的最大激发和发射波长下吸收和/或辐射，以使背景荧光降到最低程度。由于这些标志组分特别适用于生物液体的测定，因此，在此应用中，优选具有至少约500纳米激发和/或发射波长的荧光团，此波长能够减少其它样品组分的环境荧光干扰。当使用小于500nm的波长激发时，某些样品，如血清可能会显示出来自黄素、黄蛋白、NADH等的明显干扰背景荧光。对于某些应用，如荧光偏振免疫测定，当结合时，优选的荧光团还可以显示出高荧光偏振程度和低荧光偏振程度，对于某些如荧光瞬态测定的应用，优选的荧光团的特征还在于具有约1纳秒至约50纳秒，优选约5至约20纳秒可测荧光衰变时间。对于其它应用，如磷光标记，可使用具有更长衰变时间的荧光团。术语“衰变时间”是指使激发态分子的浓度从其最初浓度降低至该浓度的1/e所必须经过的时间。因此，优选能有效产生荧光的荧光团，即其特征为在适当波长下具有高吸收能力和高荧光量子产率的荧光团。对于某些应用，优选的荧光团具有至少2纳秒级的可测荧光衰变时间，并显示出高荧光偏振程度。适宜的荧光团部分包括能发光的基本上为平面的分子结构。其中一类荧光团部分的能发光基本平面分子结构包括基本平面的大环多齿配体，这类配体能配位中心原子，其中的中心原子还可以配位有两个轴向配体，大环配体的每一面(即具有反向取向)各有一个。术语“轴向配体”是指能与大环配体和中心原子一同形成配合物的取代基。轴向配体与大环配体所述的平面成正交关系。优选的中心原子为可以形成八面体配合物的元素，该配合物包含有两个位于大环配体平面两侧并与平面正交的反式或轴向取向的配体。对于在某些应用中作为荧光标志组分的使用来说，中心原子不应当具有过高的原子序数(约30或更低)，以致通过跃迁到三重态而损失大部分荧光。对于如体内治疗肿瘤的应用，可使用具有较高原子量的原子，或者对于分离型测定或对于磷光标记来讲也是如此。对于在荧光免疫测定中作为标志组分的应用，合适的中心原子为以下原子，它们可配位有两个轴向配体，而且不为高原子序数的原子，以免通过跃迁到三重态而引起荧光大规模猝灭。优选的中心原子的元素包括硅，锗，磷和锡，尤为优选硅和锗。优选的多齿配体包括具有pi-电子共轭环系的含氮大环。这些大环可被任选地取代，包括在桥碳或氮上的取代。适宜的大环包括卟啉衍生物、氮杂卟啉、可啉、sapphyrin和porphycene以及其它类似的具有共轭π-电子环系的大环。鉴于它们结合有众多上述特性，因此一类特别优选的大环包括卟啉衍生物和氮杂卟啉衍生物(其中至少一个桥碳被氮原子取代的卟啉衍生物)。氮杂卟啉衍生物包括单一，二—和三—氮杂卟啉和金属卟啉(porphyrazine)衍生物。这些大环可任选地具有稠合的芳环。这些氮杂卟啉衍生物包括酞菁，苯并三氮杂卟啉和紫菜嗪和它们的衍生物。这些化合物中许多化合物的制备和荧光性质是已知的，而且其中一些可从市场上购得。Moser，F.；酞菁化合物(PhthalocyanineCompounds)；ReinholdPublishingCo.，纽约(1963)；Wilkinson，G.(编者)；综合配位化学(ComprehensiveCoordinationChemistry)；卷2，第813-898页；PergamonPress，纽约(1987)；Hanack，M.等人；“一类新的单向导体的合成和性质”(SynthesisandPropertiesofaNewKindofOne-DimensionalConductor)，有机金属化学杂志(JournalofOrganometallicChemistry)204315-325(1981)；和Lezhoff，C.C.和Lever，A.S.P.(编者)；酞菁性质和用途(PhthalocyaninesPropertiesandApplications)；VCHPublishers，Inc.，NewYork(1989)。根据本发明，连接有一个或多个聚氧烃基的其它种类荧光团见下文实施例和图7中所述。对于某些应用如荧光偏振测定，优选的大环为显示出高偏振度的氮杂卟啉衍生物，即能发射出强偏振光的化合物。对于这些应用，优选具有较低对称度(优选具有低于D4h的对称度)的大环。优选的一组包括具有至少一个稠合芳环或外部取代基的大环。因此，优选的大环包括在能导致对称性降低的位置上具有稠合芳环的氮杂卟啉衍生物。优选的氮杂卟啉衍生物的种类包括具有低于D4h对称性的单氮杂卟啉、二氮杂卟啉、和三氮杂卟啉衍生物。优选的荧光团包括(1)多甲川染料；(2)醌型染料；(3)阴丹士林染料；(4)靛属染料；(5)吖嗪，如尼罗蓝A和激光染料；(6)芳基甲烷染料及杂环类似物；(7)吡喃鎓，硫代吡喃鎓和squarylium染料；(8)醌的甲基化物；(9)共轭甜菜碱染料(N-环戊二烯酐吡啶鎓衍生物)(derivativesofpyridiniumN-cyclopentadienide)；和(10)大环如卟啉，氢化卟啉(hydroporphyrin)，氮杂卟啉包括酞菁、corroles、可啉和五吡咯并大环如sapphyrins。这类染料的实例见下文所述。多甲川染料包括对称或不对称花青，它们可以是阳离子型，阴离子型或中性花青(份菁)。端接在多甲川链上的基团的结构决定了具体花青在上述种类中的归属。最长的吸收波长不仅取决于端基，而且还取决于多甲川链中的-CH＝CH-基团的数量。多甲川链上的取代基能够引起红移或蓝移，这取决于取代基的结构和它们在链中的位置。其它结构修饰可通过环合或同偶联结构完成。因此，可以理解，可能的花青的数量变化很大。为寻求更好的照相增感剂，已经合成了上千种这类化合物。特别优选的荧光团包括(1)芳基终止的多甲川染料，如三甲川，五甲川和七甲川；(2)醌型染料，如1-氨基-2-苯甲酰基-4-(芳基氨基)蒽醌，6-(芳基氨基)萘并[2，3，c]-9，10-二氢化吖啶-5，8，14-三酮；(3)阴丹士林染料；(4)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二甲酰胺；(5)四氨基蒽醌；(6)吖嗪染料；(7)吡喃鎓，硫代吡喃鎓和squarylium染料；(8)蒽醌的甲基化物。B.优选的聚氧烃基部分优选的加溶聚氧烃基部分包括水溶性糖类如葡萄糖，蔗糖，麦芽三糖等；水溶性糖衍生物如葡糖酸和甘露糖醇，以及低聚糖；多肽如polysine和天然存在的蛋白质；以及水溶性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，聚乙烯亚胺，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，环氧乙烷共聚物如PluronicTM(聚醚)和TetronicTM(BASF)，多元醇类表面活性剂，以及特别是聚醚如包括聚乙二醇的其它聚氧化烯，或其它水溶性混合氧化烯聚合物等。特别优选的一类加溶聚氧烃基部分包括聚乙二醇(PEG)和聚乙二醇衍生物，如聚乙二醇单甲醚。其它合适的PEG衍生物包括PEG-硅衍生醚类。这些聚合物中的许多可从市场上以不同分子量形式购得。其它则可以方便地由市售原料制备，如通过将氨基-PEG偶联到卤代烷基甲硅烷基或硅烷部分上制备。当连结有荧光团部分时，这些聚氧烃基部分在水溶液中能赋予特别优越的溶解特性，进而改进可测荧光衰变时间和荧光强度。此外，所产生的标志组分为水溶性的，并显示出减弱的非特异性结合，尤其降低了与血清白蛋白的结合，而这对于某些荧光团来讲迄今仍为一难题，特别是对于卟啉或酞菁染料，这些染料现已用如磺酸盐之类的基团官能化，以赋予分子提高的水溶性。荧光团或标志组分的非特异性结合降低免疫测定结果的准确性。这些包括连结有PEG的荧光团的标志组分在水溶液中还显示出改善的荧光强度，而且荧光猝灭减少。合适的PEG的分子量可以在约200至约20,000或更大之间变化，较优选为2,000至20,000，更优选为4,000至15,000，最优选8,000至10,000。特定分子量的选择取决于所选择的特定荧光团及其分子量和疏水程度，以及所使用荧光团-PEG复合物的特定应用。C.优选标志组分的吸收和偏振行为无溶剂敏感性和对HSA及血清组分的非特异性结合能够通过测定吸收光谱和瞬态荧光发射证实。包括中心原子(例如硅)的标志组分能够通过测定瞬态荧光灵敏地表征。其中中心原子上偶联有一个或多个聚氧烃基部分如PEG。在这种测定中，在相当于约3倍标志组分衰变时间的时间周期内监测平行或正交于激发脉冲偏振方向的偏振的两种组分的强度。这种曲线反映了消光系数，量子产率，衰变时间和偏振状态的情况，并提供了对标志组分的化学和物理条件的灵敏指数。例如，倘如激发态被减活化或者转化成三重态，总强度则被降低，而且衰变时间也缩短。如果分子的转动布朗运动通过增加粘度或通过结合到大分子上被改变，则平行组分与正交组分的强度比将增大。术语“结合”是指其中分子和其特异性结合配对物(partner)之间形成相互结合的状态。本发明的某些标志组分在DMF(一种有机溶剂)中显示出和在SAP(叠氮化物磷酸盐盐水，中性缓冲水溶液)中相同的强度、衰变时间和偏振情况(在约5％实验误差之内)。在某种程度上，其它标志组分制品都共有这些特性。本发明标志组分的特殊和重要性质是对血清组分的不敏感性(和不与这些组分结合)，这可以通过血清对荧光的强度，衰变时间或偏振组分的相对强度无任何可测作用证实。对于可用于如采用生物物质的测定的应用的标志组分来讲，这种特性是十分重要的。含平均分子量350的PEG单甲基醚的羟基硅酞菁产物在可见光和近红外区的吸收光谱表明，最大吸收的位置和高度在DMF(一种有机溶剂)和在SAP(叠氮化物磷酸盐盐水，一种中性水缓冲液)中几乎相同。相反，未被加溶性聚氧烃基轴向配体取代的硅酞菁几乎不溶于这些溶剂中，并且在DMF中仅显示出非常低的吸收水平，而在SAP中实际上无吸收。对于与上所述相同的PEG-取代硅酞菁，其瞬态荧光发射表明，向SAP中的样品内加入人血清，实际上不影响发射。通过用磺酸盐衍生酞菁大环加溶的硅酞菁(不含PEG配体)显示出，当加入血清后，不仅荧光强度发生变化，而且偏振化作用也发生变化。用PEG轴向配体取代羟基，则能消除这些变化。对于PEG取代的硅酞菁(其中酞菁大环被磺化)，瞬态荧光发射证明在HSA和HSA+血清存在下的瞬态发射与仅在缓冲液(SAP)中的发射相同。大环的磺化不影响轴向加溶聚氧烃基部分防止标志组分非特异性结合HSA或血清组分的能力。对于中心硅原子上不连结有任何加溶聚氧烃基部分的磺化硅酞菁，在DMF中的瞬态荧光发射表明，相对于激发脉冲偏振方向的平行或正交偏振的两种组分大约等同。相同浓度的同样物质在SAP中的瞬态荧光是溶剂敏感的，而且其荧光在SAP中有大约40％被猝灭。向溶液中加入血清产生增强的荧光并诱导此类染料的发射偏振，从而导致平行和正交组分的强度实际上大不相同。这说明磺化硅酞菁与血清组分能够显著结合。加入血清后的强度变化也是结合血清组分的标志。磺化硅酞菁在DMF中的可见光和近红外吸收分别在673nm(0.634)和603nm(0.107)显示出最大吸收波长和吸光度。相同浓度的磺化硅酞菁在SAP中的吸收光谱分别在678nm(0.509)和606nm(0.092)显示出最大吸收波长和吸光度。II.优选标志组分的制备制备本发明优选标志组分的一种方法是按照下列一般反应式使合适的含羟基或卤化物基团作为轴向配体的荧光团部分与活化形式的加溶聚氧烃基部分进行配体交换反应Mcl-CA-(X)2+2(SM)＿Mcl-CA-(SM)2+2X其中Mcl表示大环配体，CA表示中心原子，X表示置换配体以及SM表示加溶部分。此反应可以在无溶剂存在下进行或者，如果需要的话，在溶剂中进行。适宜的溶剂包括喹啉，THF，DMF，咪唑等。适宜的反应温度是可变的，这取决于大环原料和加溶部分的性质。反应一般在大约2分钟至大约24小时内完成。反应混合物可以方便地通过回流或借助如沙浴等方式加热。为方便起见，反应可以在环境压力下进行。据信，此反应分两步进行，每一次配位一个聚氧烃基作为轴向配体。聚氧烃基部分与配位有大环配体的中心原子的反应可分阶段进行。可观测到PEG与二羟基硅酞菁(PcSi(OH)2)的反应产物。在第一阶段(“早蓝阶段”(EarlyBlueStage))中，荧光团部分(SiPc)[使它们在DMF和SAP(叠氮化物磷酸盐盐水缓冲液)均变为可溶的]对溶剂明显敏感，并且大约85％被猝灭。相反，后一阶段的反应产物(“蓝绿产物”(BlueGreenProduct))对溶剂完全不敏感，并在两种溶剂中显示出相同的发射强度和衰变时间。优选的合成方法见我们所拥有的USP5,403,928(1995年4月4日授权)中的实施例5所述。III.实用性本发明的标志组分可用作荧光探针的荧光标记物，和用于荧光免疫测定，以及在体内成像和体内肿瘤治疗方面用作标记物。这些标志组分优选用作常规荧光免疫测定(包括荧光偏振免疫测定)中的荧光标记物。当如此使用时，这些标志组分可以连结特异性结合对(“标记的结合配对物”)中的一个或其类似物。标志组分可直接与此部分连结或共轭，或者经连结臂连结或共轭。术语“特异性结合对”是指两种不同的分子(或组分)，其中一个分子在其表面或空腔中具有这样区域，该区域能够准确地识别分子或包括其它分子的分子配合物的特定空间和极性组织并与之连结。术语“结合配对物”是指这样的分子或分子复合物，它们能够准确识别或准确识别特定的分子或分子复合物或被特定的分子或分子复合物所识别。这些标记结合配对物可用于各种形式的测定中，如涉及竞争分析物或分析物结合配对物(如果使用标记分析物或分析物类似物的话)的测定，并可用于均一或异质测定中。鉴于它们在水溶液中不聚集和对溶剂的不敏感性(说明无可检测的聚集)以及它们对血清组分和其它生物大分子无非特异性结合的优点，这些标志物特别适合于在检测含生物液体如血清的样品中的分析物的测定中应用。因此，这些标志组分可用作检测溶液中分析物的荧光探针的标记物，其中血清组分的非特异性结合会严重损害测定的灵敏度，影响测定的准确度和精度。另一方面，这些标志组分可用作体内成像物质。当用作体内成像物质时，这些标志组分与特异性结合对中的一员共轭产生标记结合配对物。将标记结合配对物导入到动物体内。如果存在特异性结合对的另一成员，标记结合配对物将与其结合，随后可以测量由标志组分所产生的信号，并进而确定其位置。这些标志组分还可以用于体内肿瘤治疗。例如，光动力学疗法包括使用标志组分作为光敏剂。标志组分(荧光标记物)与结合配对物共轭，此结合配对物能够特异性地识别肿瘤细胞组分并与之结合。光激发之后，结合标志组分共轭物的定域三重态发射会引起化学反应，并选择性损伤和/或破坏肿瘤细胞。为了有助于理解本发明，本文还包括用于说明一系列实验结果的下列实施例。当然，本发明的下述实施例不应当认为是对本发明的具体限制，在本领域技术人员的专业知识范围内，他们目前和将来都可以对本发明作出各种改进，而且所有这些改进均落在前面所述的说明书和后面附加的权利要求的范围之内。实施例酞菁、卟啉和花青或多甲川类染料偶联有一个或多个聚氧烃基，如PEG(聚乙二醇)。在各种情况下，一个或多个聚氧烃基的存在导致聚集倾向明显降低，更为重要的是与生物物质(在实际实验中为人血清或人血清成分)非特异性结合的倾向也明显降低。在血清或全血存在下对异羟基洋地黄毒苷原进行混合—读出(mix-and-read)测定，比较自身未保护的染料和连结有聚氧烃基的染料。在该测定中，对于进行异羟基洋地黄毒苷原治疗的患者来讲，为获得监测其体内异羟基洋地黄毒苷原水平所必需的灵敏度，荧光标记物(酞菁)的保护是绝对必需的。对于任何实际应用来讲，用自身未保护形式的酞菁制备的探针是无用的。治疗药物测定领域目前主要使用的异羟基洋地黄毒苷原测定法在探针中采用无保护染料(荧光团)。然而，为进行此测定，必须首先进行分离，离线沉淀和离心以变性和除去血清成分，否则它们会使测定不可能进行。我们概述了各种IR/近IR染料的制备方法，这些染料具有据此认为它们可用作荧光探针的光物理参数。下文所示的反应说明了如何制备用于消除聚集和非特异性结合的染料。可以用类似的流程说明如何通过连结合适的半抗原，抗体或其它生物分子将这类制备的染料转化成有用的探针。实施例1芳端化多甲川染料可与一个或多个聚氧烃基部分连结的芳端化多甲川染料包括下述文献中所述的那些W.BTuemmler，B.S.Wildi，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，1958，80，3772-3777；R.Wizinger，G.Renckhoff，杂环化学学报(Helv.Chim.Acta)1941，24，369E-388E；和H.Lorenz，R.Wizinger，杂环化学学报(Hely.Chim.Acta)1945，28，600-612，上述各文献的全部内容(包括附图)在此均引入本文用作参考。可与一个或多个聚氧烃基部分偶联的芳端化多甲川染料优选具有下述结构其中n为0，1，或2，且R为H，Cl，或N(CH3)2。具上述结构的芳端化多甲川染料具有下述光谱特性</tables>具上述结构的芳端基多甲川染料可用W.BTuemmler，B.S.Wildi在有机化学杂志(J.Org.Chem.)1958，80，3772-3777中所述的方法合成。例如，三甲川(n＝0)可按下述合成其中在n为0且R1和R2为H、Cl或N(CH3)2时，得到39-56％收率。类似地，五甲川染料(n＝1)可按下所述合成其中在n为1且R1和R2为H、Cl或N(CH3)2时，得到50-99％收率。七甲川染料(n＝2)可按下述合成其中在n为2且R为H、Cl或N(CH3)2时，得到37-96％收率。芳端基多甲川染料的聚乙二醇(PEG)共轭物包括其中n为0、1或2，且R包括但不限于H、Cl、Br、I、N(CH3)2、连接基和O-PEG-OCH3。这些含PEG的染料可按下述合成此产物是进行上面Teummler和Wildi所述合成的关键中间体，并按下所述得到多甲川染料PEG三甲川染料n＝0，R1＝H；R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝Cl，Br，I，F；R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝连接基R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝O-PEG-OCH3；R2＝Hn＝0，R1＝O-PEG-OCH3；R2＝Cl，Br，I，Fn＝0，R1＝O-PEG-OCH3；R2＝连接基PEG五甲川染料和PEG七甲川染料其中n为1或2，且R为O-PEG-OCH3。实施例2醌型染料醌型染料可以偶联有一个或多个聚氧烃基部分。这些染料包括1-氨基-2-苯甲酰基-4-(芳氨基)蒽醌类化合物，如L.Boguslavskaya，V.I.Gudzenko在Z.Organ.Khim.1968，4，101-104中所述的化合物[此文献的全部内容(包括附图)在此并入本文用作参考]，而且它们优选具有下述结构Z＝p-OCH3p-OC2H5，p-OH，p-Cl，p-NO2，m-Cl，M-CF3，H，m-NO2这些化合物具有下述光谱特性λmax范围为约670-720nm，ε范围为约100,000-200,000。这类化合物中的含PEG共轭物可按下述合成可用于本发明的其它醌型染料包括6-(芳氨基)萘并[2，3，c]吖啶-5，8，14-三酮类化合物[如L.Boguslavskaya，V.I.Gudzenko在Z.Organ.Khim.1968，4，101-104中所述]，并优选具有下述结构这类化合物具有下述光谱特性λmax＝732nm。含PEG共轭物可按下述合成实施例3阴丹士林染料阴丹士林染料也可以与聚氧烃基偶联，而且包括A.Tundo在Ann.Chim.(Rome)1957，47，291-298中所述的那些染料[此文献的全部内容(包括附图)在此并入本文用作参考]。这类化合物优选具有下述通式结构这类化合物具有下述光谱特性λmax范围为约715nm-790nm，logε范围为约4.0-4.6。含PEG的共轭物可按下文所述合成采用此途径，也可以进行在位置“a”和位置“b”上分别连结上单个PEG残基和合适的官能化芳基的混合缩合反应。实施例41，4-二氨基萘醌-2，3-二甲酰胺(dicarboxamide)染料也可以使用1，4-二氨基萘醌，这些萘醌包括下述文献中所述的那些化学文摘1984，100，193530n[该文献的全部内容(包括附图)在此并入本文用作参考]。这类化合物优选具有下述结构X＝O，S，NH，NR′2这类化合物具有下述光谱特性对于R＝n-C6H13的化合物，λmax＝763(液晶相)。PEG共轭物可按下文所述合成实施例5四氨基蒽醌类染料也可使用四氨基蒽醌类化合物，这些蒽醌包括T.Ohyamata，K.Takuma；S.Kuroda，H.Aiga.在欧洲专利申请EP323,184(1989年7月5日)所述的那些[此文献内容在此全部并入本文用作参考]。这类化合物优选具有下述结构这类化合物具有下述光谱特性对于R＝烷基的化合物，λmax＝741(EtOH)。PEG共轭物可按下文所述合成实施例6吖嗪染料吖嗪染料也可被使用，并优选它们具有下述结构Y＝O，SX＝ClO4-，Cl-更优选的染料为高氯酸尼罗蓝A，其结构如下这类化合物具有下列光谱特性</tables>※引自“激光染料”(“LaserDyes”)，MitsuoMaeda。对于星号标记的栏目，Abs.λmax是指红宝石脉冲激光的最大吸收波长，荧光λmax是指激发波长。PEG共轭物可按下所述采用染料化学进展(ProcessesofDyeChemistry)(Interscience，NewYork)1949中所阐述的技术合成。实施例7吡喃鎓和硫代吡喃鎓型染料吡喃鎓和硫代吡喃鎓染料也可被使用，并优选它们具有下述结构X＝O，SR，R′，R″＝烷基，芳基或烯醇醚这类化合物可按下所述并采用下述文献中所描述的技术合成A.T.Balaban，W.Schroth，G.W.Fischer，高级杂环化学(Adv.HeterocyclicChem.)1969，10，241；和A.T.Balaban，A.Dinculescu，G.N.Dorofeenko，G.W.Fischer，A.V.Koblik，V.V.Meqheritskii，W.Schroth“PyryliumSalts.Syntheses，ReactionsandPhysicalProperties”，Adv.HetercyclicChem.，Suppl.2，Ed.A.R.Katritsky编辑，AcademicPress，纽约，1982，这两篇文献的全部内容(包括附图)在此并入本文用作参考。硫代吡喃鎓类似物可通过用硫化钠处理吡喃鎓盐制备。这类化合物具有下述性质</tables>a在二氯甲烷中测得的光谱b在乙酸中测得的光谱实施例8萘醌甲基化物染料本发明还可使用萘醌甲基化物染料，并优选具有下述结构这类化合物可按下文所述采用下述文献中所述的方法合成TheChemistryoftheQuinoidCompounds，ed.S.Patai.，Y.Kubo，F.Mori，K.Yoshida，ChemistryLetters，1987，1761-1762，此文献的全部内容(包括附图)在此并入本文用作参考。这类化合物具有下列性质a在氯仿中测得的光谱PEG共轭物可按照上述途径合成，其中R或′R＝PEG。实施例9咔嗪(carbazines)(也称作9，10-二氢化吖啶)本发明还可使用咔嗪染料，它们包括下述文献中所描述的那些HeterocyclicCompoundsVol.9“Acridines，”Ed.R.M.Acheson，JohnWileyandSons，Inc.，纽约，1973[该文献的全部内容(包括附图)在此并入本文用作参考]。这类化合物优选具有下述结构这类化合物可按下所述合成在这些反应中，一个或多个R基团可以为PEG。实施例10非特异性结合试验长期以来，菁染料一直在照相法中用作增感剂。最近，含化学活性基团的水溶性菁染料可以从市场上购得用作荧光标记物。这些染料化合物之一，即Cy5.5在大约680nm处具有最大吸收，而其发射波长稍大于700nm。将1.7微摩尔浓度的Cy5.5样品在异羟基洋地黄毒苷原探针稀释物中保持72小时。经过这段时间后，起始活性酯应当转化成游离羧基形式。利用标准血清组样品进行非特异性结合试验，结果表明血清或血清成分对强度和偏振化作用具有显著作用。这些作用表明，强度与浓度的关系为非线性函数关系(表I和II)，强度随血清组分的种类和浓度的变化也为非线性函数关系(表III)，并且通过非特异性结合能够提高偏振化作用。表I-Cy5.5/异羟基洋地黄毒苷原稀释物浓度nM荧光强度毫偏振单位17041627982.817580613超出可读度1.7150069129.00.1738842122.6表II-Cy5.5/TDX缓冲液1701074511-34.2171338283超出可读度1.7150069129.00.1722280130.2表III-1.7nMCy5.5+添加剂添加剂强度毫偏振单位0.5％BSA665960285.55％Bov.Ser.555277260.10.25％BGG326543191.25％PHS608260282.95％PHS383004231.9双活性酯可以与二异丙胺偶联，而且这种形式可与受测血清结合。此试验应当表现出所期望的由Cy5.5制备的生物-探针的行为。异羟基洋地黄毒苷原探针可通过使双-官能染料和过量3-氨基-3-脱氧洋地黄毒苷(DIG)反应制备，结果每分子染料将结合两分子洋地黄毒苷。然后对血清组样品和抗异羟基洋地黄毒苷原进行探针测试，以确定其作为异羟基洋地黄毒苷原探针的性质。为抑制非特异性结合，正如在有关酞菁(如制备LaJolla蓝中所用的那些酞菁)时我们通常所进行的那样，可以使Cy5.5偶联聚乙二醇单甲醚(PEG)。如果使用这种双活性形式，结果则是每分子染料可偶联两分子PEG。如果使用单活性形式染料，则仅能偶联一个PEG，因此能够获得达到所需抑制程度所必需的PEG的量的技术情报。含有一分子洋地黄毒苷和一分子PEG的混杂分子可以按下所述制备首先使双活性染料与限定量DIG反应，得到一些单取代物，随后再与过量PEG反应，并通过高效液相色谱(HPLC)纯化。实施例11非特异性结合与溶解性之间的关系非特异性结合和水溶性之间不一定存在并行关系，但代替的染料在水溶液中可以为单体形式，而且还显示出强有力的非特异性结合。作为我们工作的实例，可以在pH8.0的磷酸钾缓冲液中，测量加入不同浓度HSA时的瞬态荧光，据此可以计算出结构如下式A所示的酞菁和人血清白蛋白(HSA)的结合常数。式A(未修饰的二羧基硅酞菁)在相同的缓冲液中，利用相同仪器对经过化学修饰的式A染料进行类似测量，其中对式A的修饰是在每一硅醇的OH基团上连结聚乙二醇分子，从而得到LaJolla蓝染料。测量结果见下表IV中所示。表IV在加或不加HSA条件下对式A染料和LaJolla蓝进行瞬态荧光强度和偏振化作用测定。在这两种情况中，染料浓度为3.1E-10M.式A染料％HSA强度偏振化(mP)01646962.40.00210508063.50.0267714153.90.263672192.82.078321191.74.081328201.1LaJlooa蓝0857431.30.002848874.80.028271818.10.28107320.82.05608535.84.07157371.8表IV中的数据可用于确定其中的染料为半游离和半结合状态时HSA的浓度。对于未修饰染料和LaJolla蓝，HSA的浓度分别为3.2E-7M和5.0E-4M，计算得到的结合常数分别为3E6和2E3M-1。也就是讲，导入分子量为2000的PEG分子能够降低非特异性结合常数1000倍。权利要求1.一种被可检测标记的标志组分，该标志组分包括(a)荧光团部分，该荧光团包括能发光的基本上为平面的分子结构，并具有至少约500纳米的激发波长；该荧光团偶联于(b)一个或多个聚氧烃基部分，与未与一个或多个聚氧烃基部分偶联的未修饰荧光团部分相比，其中所述标志组分与血清组分的非特异性结合减少。2.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团部分具有大约600至800纳米的激发波长。3.根据权利要求2的标志组分，其中所述荧光团部分具有至少650纳米的激发波长。4.根据权利要求1的标志组分，其中所述标志组分在有或无血清存在时具有与基本类似的强度、衰变时间和偏振组分相对强度。5.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团部分本身的结合常数比完整标志组分的至少大50倍。6.根据权利要求5的标志组分，其中所述荧光团部分本身的结合常数比完整标志组分的至少大100倍。7.根据权利要求6的标志组分，其中所述荧光团部分本身的结合常数比完整标志组分的至少大500倍。8.根据权利要求7的标志组分，其中所述荧光团部分本身的结合常数比完整标志组分的至少大1000倍。9.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自(1)芳端化多甲川染料；(2)醌型染料；(3)阴丹士林染料；(4)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二甲酰胺类化合物；(5)四氨基蒽醌类化合物；(6)吖嗪染料；(7)吡喃鎓或硫代吡喃鎓染料；和(8)萘醌甲基化物。10.根据权利要求1的标志组分，其中所述聚氧烃基部分选自聚醚、多元醇、水溶性糖类、水溶性糖类衍生物和水溶性聚合物。11.根据权利要求10的标志组分，其中所述聚氧烃基部分包括聚乙二醇或聚乙二醇衍生物。12.根据权利要求11的标志组分，其中各个所述聚氧烃基部分的分子量为大约200至大约20,000。13.根据权利要求12的标志组分，其中各个所述聚氧烃基部分的分子量为2,000-20,000。14.根据权利要求13的标志组分，其中各个所述聚氧烃基部分的分子量为4,000-15,000。15.根据权利要求14的标志组分，其中各个所述聚氧烃基部分的分子量为8,000-10,000。16.根据权利要求1的标志组分，该标志组分在血清组分存在下在水溶液中的特征在于具有基本上与无血清情况下相同强度的平行和正交组分的瞬态荧光发射。17.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为芳端化多甲川染料。18.根据权利要求17的标志组分，其中所述芳端化多甲川染料为三甲川染料。19.根据权利要求17的标志组分，其中所述芳端化多甲川染料为五甲川染料。20.根据权利要求17的标志组分，其中所述芳端化多甲川染料为七甲川染料。21.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为醌型染料。22.根据权利要求21的标志组分，其中所述醌型染料为1-氨基-2-苯甲酰基-4-(芳基氨基)蒽醌。23.根据权利要求9的标志组分，其中所述醌型染料为6-(芳基氨基)萘并[2，3，c]-9，10-二氢化吖啶-5，8，14-三酮。24.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为阴丹士林染料。25.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为1，4-二氨基蒽醌-2，3-二甲酰胺。26.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为四氨基蒽醌。27.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为吖嗪染料。28.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为吡喃鎓或硫代吡喃鎓染料。29.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为萘醌甲基化物。30.根据权利要求9的标志组分，其中所述荧光团部分为咔嗪。31.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)32221；(2)32222；(3)32223；(4)32224；和(5)32225。32.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)35512；(2)35513；(3)35514；(4)35517；(5)35518；和(6)33519。33.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)35523；(2)35524；(3)35525；(4)35526；(5)35527；(6)35528；(7)35529；和(8)35530。34.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)35533；(2)35535；(3)35536；和(4)35538。35.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)50024；(2)50025；和(3)50032。36.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)62303；(2)62401；(3)62403a；(6)62403b；(5)62402；和(6)62411。37.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)64102；(2)64104；(3)64106；(4)64303a；(5)64304；(6)64311；(7)64311；(8)64312；和(9)65212。38.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)66001；(2)66002；(3)66004；(4)66005；(5)66008；(6)66009；(7)66013；(8)66014；(9)66015；和(10)66204。39.根据权利要求1的标志组分，其中所述荧光团选自化合物(1)66206；(2)66210；(3)67102；(4)67422；和(5)91002。全文摘要本发明提供了不聚集和不与血清结合的荧光染料。这些染料适合用于如荧光免疫测定,体内成像和体内肿瘤治疗。本发明提供了荧光免疫测定方法,该方法使用不聚焦和不与血清结合的荧光染料。因而这类荧光免疫测定法特别适合于测定生物液体,如血清、血浆、全血和尿。本发明涉及含有连结有可检测的标记标志组分的低聚核苷酸的组合物,其中标记标志组分包括荧光团部分,该荧光团部分则包括与中心原子配位的基本上为平面的大环多齿配体(该中心原子还能够与两个轴向配体配位)和两个聚氧烃基部分,这两个聚氧烃基部分连结在中心原子上作为轴向配体。本发明还涉及采用这类组合物进行核酸杂化和扩增的方法。文档编号A61K47/48GK1198816SQ96196037公开日1998年11月11日申请日期1996年6月4日优先权日1995年6月6日发明者W·B·丹德利凯尔,R·F·德夫林,P·O·G·阿尔亨尤斯,徐茂麟申请人:海珀里昂有限公司