专利名称：作为血管内一氧化氮贮器的流体碳氟化合物乳剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用流体碳氟化合物乳剂治疗至少部分因缺乏内源性一氧化氮而引起的局部或全身性疾病。
背景技术：
内源性一氧化氮是维持微循环稳态的关键因素，它是由一氧化氮合成酶氧化L一精氨酸而形成的。其功能是抑制血栓形成，调节免疫、作为神经递质，部分参予伤口愈合。例如，在非致命性烧伤后可观察到在组织中一氧化氮合成酶的活性及尿硝酸盐的排泄增加。生化杂志(联合王国)304/1 pp 201-204(1994)。
一氧化氮也是一种有效的血管扩张药，其局部或全部缺乏与血管收缩相关。已知，它由血管内皮细胞分泌，当释放到内皮细胞下面的血管壁时，能引起平滑肌松驰，从而可导致血管舒张。在大鼠的口腔组织结构，如牙银舌及下颌下腺中施用辣椒素诱导血管舒张时，一氧化氮的形成起着重要作用。实验医学研究194/6 pp 357-365(1994)。此外，人们期望治疗新生儿呼吸窘迫综合症及肺动脉高压时，肺内施用一氧化氮可替代其它的血管舒张药，如妥拉唑啉、前列环素和硝普盐等。欧洲儿科学杂志153/9 pp S7-S11(1994)。
但是，当血管内皮细胞分泌的一氧化氮释放到周围的血浆中时，会很快地被血浆血红蛋白清除掉。因此，血浆中一氧化氮的半寿期只有几秒。一氧化氮持续释放到血管内皮周围的血浆中造成的损失会限制内源性一氧化氮的效力。
除了局限局部产生的内源性一氧化氮的效力外，这种血浆中的低存在可使外源性一氧化氮成为器管特异的肺血管舒张剂。这是因为导入呼吸道的一氧化氮(通过吸呼充有一氧化氮的空气)被肺动脉中的血红蛋白从循环中移去。因此，这一途径施用的一氧化氮只影响到肺的血管，一氧化氮(一氧化氮)疗法目前也只限于治疗肺部疾病。
除了清除溶于血浆的一氧化氮外，血红蛋白清除一氧化氮还有另一个显著的结果。已知键合有一氧化氮的血红蛋白因形成高铁血红蛋白而成为失活的血红蛋白。尽管红细胞内有酶系统保护血红蛋白使之免于失活，但周围血管中的细胞间血红蛋白因内源性一氧化氮而失活。尽管血浆中一氧化氮的半寿期短，但它的存在仍然能抑制在红细胞外施用外源性血红蛋白进行治疗的效果。这是脂质体包埋血红蛋白产物一个尤为重要的问题。
因此需要调整溶于血浆中一氧化氮的存在。首先，通过延长一氧化氮在循环血浆中的寿命，使一氧化氮最大限度地扩散到循环系统中的血管壁上，来减轻至少部分因内源性一氧化氮缺乏而引起的局部或全身性疾病的状况。其次，通过降低形成高铁血红蛋白的溶于血浆中的一氧化氮来提高施用外源性血红蛋白治疗的疗效。
发明概述本发明应用生物相容性碳氟化合物乳剂来增加内源性一氧化氮的有利效果，并提高施用外源性一氧化氮进行治疗的效力。尽管碳氟化合物乳剂已用作携带和输送氧的试剂，但是人们在治疗中还没有认识到或应用它作一氧化氮载体的功效。
气体在流体碳氟化合物中相对高的溶解度使静脉内注入的碳氟化合物乳剂的不连续相能起到一氧化氮贮器的功能。流体碳氟化合物的小滴提供血浆中溶解的一氧化氮扩散的隔离空间，并使一氧化氮免于与血浆血红蛋白接触。
因此，本发明提供流体碳氟化合物乳剂在制备适于增加患者血流中循环一氧化氮的数量和稳定半寿期的药物中的用途，该患者需要增加循环一氧化氮的数量和稳定的半寿期，其中静脉内施内有效量的流体碳氟化合物乳剂。
本发明的另一实施方案是提供流体碳氟化合物乳剂在制备适于降低脊椎动物血流循环中因一氧化氮而造成的外源性血红蛋白失活的药物中的应用，其中有效量的流体碳氟化合物乳剂与有效量的外源性血红蛋白一起施用或预先静脉内施用。
本发明的另一实施方案是提供碳氟化合物乳剂在制备适于治疗全部或部分因内源性一氧化氮缺乏而引起的疾病的药物中的应用，其中有效剂量的碳氟化合物乳剂与有效剂量的外源性一氧化氮一起肺内施用或预先在静脉内施用。
本发明的另一实施方案是提供碳氟化合物乳剂在制备促进血管舒张药物中的应用，其中给需要血管扩张的患者静脉内施用有效量的碳氟化合物乳剂。
因此，本发明公开了一种方法，它能提高需要增加循环一氧化氮患者血流中循环一氧化氮的量，其中包括静脉内施用有效量的流体碳氟化合物乳剂。循环中一氧化氮的水平可通过肺内施用有效量的外源性一氧化氮而增加，或者在静脉内施用碳氟化合物乳剂之前溶解有效量的一氧化氮于碳氟化合物中。通过应用本发明的方法，一些生理疾病，包括血管痉挛和血管狭窄也许会得到更有效的治疗。
本发明的另一方面是通过与流体碳氟化合物乳剂一起使用，施用外源性血红蛋白进行治疗的效果可得到提高。同时施用碳氟化合物可降低血浆中游离一氧化氮的存在，从而可降低因一氧化氮诱导的血红蛋白失活。
附图简述该图是给兔子注射碳氟化合物乳剂和同时注射碳氟化合物乳剂及一种一氧化氮产物的抑制剂-L-NAME时，肾血流的对比图。
发明详述碳氟化合物乳剂可用作治疗和诊断性试剂。因为已知碳氟化合物液体能溶解高浓度的气体，如氧气、二氧化碳等，所以碳氟化合物用以治疗时大多与它们的携氧能力相关。纯流体碳氟化合物和碳氟化合物水乳剂均成功地用作氧的运载剂。Fluosol(Green Cross公司，大阪，日本)一种碳氟化合物乳剂商品，经皮冠状脉状腔内成形术中可用作气体的载体以氧化心肌(R.Naito，K.Yokoyama，技术信息系列编号5和7，1981)此外，在癌症的治疗中形成了一种疗法，用碳氟化合物作载体把氧气输送给肿瘤组织。静脉内注射碳氟化合物乳剂之前或同时吸入富含氧气的空气，利用这种方法把癌症的放疗增加到最大限度。Schweighandt等的美国专利公开号4,781,676直接把氧化的碳氟化合物乳剂注射到肿瘤细胞内，以提高瘤块缺氧区放疗的效果。
流体碳氟化合物的携氧容量使它能当作血液替代物，尤其是流体通气应用，其中受试动物或患者呼吸氧化的流体碳氟化合物，把氧通过肺输送到血流中。碳氟化合物乳剂也可在诊断成像中应用，如可应用全氟辛基溴(C8F17Br，“PFOB”或“perflubron”)等不透射线的碳氟化合物，尤其优选用1-溴全氟辛烷。
尽管现在还没有建立模型来准确地预计气体在流体碳氟化合物中的溶解度，但是气体的溶解度通常随分子体积的增加而增加。因此，一氧化氮在流体碳氟化合物中的溶解度应该介于氧分子(O2)和氮分子(N2)之间。以分子体积为基础，O2的溶解度在37℃大约为20mM，N2的大约为14mM。为此，一氧化氮在37℃的溶解度大约为17mM，大约能达到碳氟化合物/一氧化氮混合物的38％v/v。
在动物中已证明了流体碳氟化合物把临床上有效量的一氧化氮输送到呼吸道的能力。在一研究中，通过静脉内施用U46619(2mcg/kg/min)在六只羔羊中诱导了肺动脉高压。动物均常规用含一氧化氮达80ppm的空气换气，并用含一氧化氮的流体碳氟化合物进行部分流体换气。每一例中均能观察到肺动脉压和血管张力下降。常规施用一氧化氮或溶于流体碳氟化合物中施用，其药物动力学没有出现差别。
但如前所述，仍然存在的问题是一氧化氮治疗的临床效果仅限于肺组织。本发明提供了一种方法，它能提高除肺血管外机体局部需要高浓度一氧化氮的受试者血浆一氧化氮水平。
如果一氧化氮从存在的血红蛋白中分离出来，将会降低循环血浆中自由一氧化氮的清除率。气体在流体碳氟化合物中有相对较高的溶解度，这使得静脉内注射的碳氟化合物乳剂的不连续相就可执行这一功能。流体碳氟化合物的小滴给溶于血浆中的一氧化氮进行扩散提供了独立的空间，并且可使一氧化氮免于与血浆血红蛋白相接触。注射前把一氧化氮溶于碳氟化合物中，而不注射无一氧化氮的碳氟化合物乳剂，并且有内源性一氧化氮从血浆扩散到乳滴中，这样可进一步增加远端组织和器管中的一氧化氮因此，通过同时应用静脉内注射碳氟化合物乳剂可提高一氧化氮的治疗。
碳氟化合物乳剂包括连续的水相和不连续的流体碳氟化合物相。本领域中的人们熟知制备适于在动物和人类静脉内注射的生物相容性碳氟化合物乳剂的方法。尽管当乳剂在机体的非静脉系统如脑脊液室和腔中应用时，碳氟化合物粒的大小没有特别严格的限制，但静脉内应用时，优选小的颗粒尺寸，优选0.05-0.3微米。大的颗粒尺寸很危险，它们易于在肝、脾、肺和其它器管中聚集，使它们扩大，危及到其功能。
经典地，乳剂用乳化剂稳定。通常水相也包括渗透剂和生物相容性pH缓冲液，以保持生物学上适宜的摩尔渗透压浓度和pH。常规摩尔渗透压浓度保持在290～300毫渗压单位可帮助细胞，如红细胞、血管内皮细胞等免受损伤，这些细胞与注射入体内的乳剂相接触。但是在一些应用中，在心肺旁路中显著的氧化，人们发现给予较高渗透压浓度的溶液，优选约700或800毫渗摩尔的溶液可提高乳剂的效果。碳氟化合物乳剂的应用在Runge等的美国专利号5,114,932中有所描述，在此引入作为参考。
已知有许多不同的商品化碳氟化合物和碳氟化合物联合可制备合适的乳剂，已知单溴碳如全氟辛基溴(C8F17Br，“PFOB”或“perflubron”)，1-溴十五氟庚烷(C7F15Br)，1-溴十三氟己烷(C6F13Br，全氟己基溴，或“PFHB”)可制成合适的乳剂，并具有高氧溶解度。优选碳氟化合物以水相存在，接近5-125％，重量(克)比乳剂体积(毫升)。
乳化剂可包括表面活性剂，如卵磷脂、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，或脂肪酸等，氟化的表面活性剂也适宜应用。用本领域中熟知的技术对上述成份进行乳化，如通过高压匀浆在商品化的微流体仪中进行。
渗透剂可为六羟基醇，如甘露醇或山梨糖醇，或者是糖，如葡萄糖、甘露糖或果糖。缓冲液也可影响渗透性，这些缓冲液可选自异吡唑或三羟甲基氨基甲烷(二者的优点为不沉淀钙)，或选自氯化钠、碳酸氢钠、氯化镁、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、或碳酸氢钠或碳酸钠。这些试剂的生物相容性组合可在体内外降低红细胞的损伤，降低粘度，降低氧化率。
那些具有携氧功能的流体碳氟化合物乳剂也应具有足够的一氧化氮溶解度，以有效地促进一氧化氮溶于血浆。根据寿命、生物相容性、和颗粒大小的稳定性，本发明的碳氟化合物乳剂应具备有合适的特性。制备适于本发明应用的生物相容性碳氟化合物乳剂的方法，在美国专利号4,895,876，Schweighardt等；美国专利号4,866,096，Schweighardt；美国专利号4,865,836、号4,993,415，号4,987,154及号4,927,623,Long。及Weers等的国际申请号PUT/US93/10286(国际公开号WO94/09625)论述中所描述，在此引入作为参考。
于是，在本发明的一实施方案中，给需要血管扩张的患者静脉内施用螯合有一氧化氮的有效量的碳氟化合物乳剂。希望其效果能持续到接近于循环中乳剂的半寿期，已知半寿期依不同的碳氟化合物和碳氟化合物混合物而有所变化，但这种变化与从数小时到数天相似。同样也考虑重复剂量。
如上所述，螯合一氧化氮的功能在与血红蛋白治疗联合应用时也有效。本发明的这一实施方案中，接受外源性血红蛋白的患者，在施用血红蛋白之前、当时或之后不久也接受有效量的、保护血红蛋白的碳氟化合物乳剂。
在本发明的另一实施方案中，给一患有任何一种其它的全部或部分因缺乏内源性一氧化氮而引起的生理性疾病的患者静脉内施用螯合有效量的一氧化氮的碳氟化合物乳剂。可用这种方法治疗的生理性疾病包括循环性休克，关节硬化症和血管损伤后的再狭窄。
在任何一种治疗方案中，碳氟化合物乳剂的施用量通常为0.5-5.0g-PFC/kg，更优选1.0，1.2，1.4g PFC/kg-1.6，2.0或3.0g PFC/kg，表达式为每公斤体重(以千克表式)施用的乳剂中施用的碳氟化合物总重、(以克表式)。因为生理状况的改变，更为具体地讲，因为与施用碳氟化合物乳剂相关的血液动力学变化相对地较易测定，对任何特殊疾病或状态的合适剂量可通过确定该患者对某一特殊碳氟化合物的剂量/反应关系进行确定，而不需进行过度的实验。
注射之前把外源性一氧化氮包涵到乳剂中会进一步增强一些疗法。为了达到这一目的，可应用本领域中熟知的把气体溶于碳氟化合物乳剂的不连续相的方法。由于应用碳氟化合物乳剂作输送氧气的试剂，这些技术先前用于碳氟化合物的氧化。最简单的实施方案中，只接触气体和流体碳氟化合物。血液充氧器及类似的装置是适宜的商品化装置的实例。在一典型的程序中，把乳液与要溶于碳氟化合物中的气体放置在一弹性袋中。这一方法的优点是碳氟化合物和碳氟化合物乳液易于在弹性容器的内表面形成薄膜或一层，因为乳液的表示张力低。当给袋子充气时，填充的乳液优选低于袋子的一半。填充合适的气体后，移动并旋转袋子，使乳液以薄膜的形式覆盖在袋子的内表面。这样气体就容易地溶于碳氟化合物的不连续相。该方法及其它溶解气体的方法在美国专利号4,927,623，Long，中有详细论述，在此引入作为参考。本发明中该气体优选与有效量的一氧化氮混合的氮。气体中要被溶解的一氧化氮的浓度变化很大，从近于0-50，80或100ppm或更高。
一氧化氮在体内也可输送给乳液，方法是静脉内注射上述生物相容性乳液的同时或之后，把它暴露给含一氧化氮的空气。一氧化氮在吸入气体中的浓度也可有很大的变动。一氧化氮的这种施用方法在其浓度小于5ppm时就显效，优选一氧化氮在吸入气体中能达到20-150ppm。本领域的人们熟知吸收外源性一氧化氮进行治疗的方法，下列文献中有更为详细的论述，柳叶刀340818-819(1992)，儿科杂志122743-750(1993)，儿科杂志123103-108(1993)，新英格兰医学杂志329207(1993)，在此引入这些文献作为参考。
本发明的这一实施方案中，碳氟化合物乳剂的施用量通常为0.5和5.0g-PFC/kg，更优选的用量为1.0，1.2或1.4g PFC/kg-1.6，2.0或3.0gPFC/kg，表达为每公斤体重(4克)施用的乳液中碳氟化合物的总重(克)。同样，对任何特殊疾病或状况的合适剂量可通过确定该患者对某-特殊碳氟化合物的剂量/反应关系进行确定，而不需进行过多的试验。
但是，需强调的是，流体碳氟化合物乳剂作为一氧化氮贮器的好处并不只限于施用外源性一氧化氮的疗法。血流中的碳氟化合物滴可为血浆中的一氧化氮提供保护性空间，使它扩散于其中，由此可提高血流中一氧化氮的水平，尤其是在那些碳氟化合物易于集聚的组织中。另外，还值得注意的是碳氟化合物乳剂的施用与外源性血红蛋白的应用相关时优选碳氟化合物中或呼吸道内没有额外的一氧化氮。
实施例注射Perflubron乳剂后兔子肾血流的增加麻醉七只兔子，在肾动脉安置多普勒监测装置。适当安定一段时间和持续麻醉之后，给兔子静脉内注射2.7g-PFC/kg90％w/v的perflubron乳剂，其中用蛋黄磷脂(AF 0104，Alliance Pharmaceutical，SanDiego，CA)作稳定剂，注射的同时监测肾血管舒张的效果。随后，当肾血流回到基线时，给3只兔子注射10mg/kg的一种内皮一氧化氮产物的抑制剂，L-NAME。然后给七只兔子再次静脉内注射2.7g-PFC/kg的perflubron乳剂(AF0104，Alliance Pharmaceutical，San Diego，CA)，同时监测肾血管舒张的效果。
了第二次静脉内施用流体碳氟化合物乳剂时，兔子肾血流的反应。如图所示，单独应用乳剂可在5分钟内诱导肾血流增加60％，持续时间超过30分钟。与此相对，预先注射一氧化氮合成酶的抑制剂L-NAME(NG-硝基-L-精氨酸甲基酯)，可降低或消除血流的增加。这表明内源性一氧化氮摄取足够的碳氟化合物以增加血浆中一氧化氮的稳定半寿期，由此可增强一氧化氮诱导的肾血管舒张。
前面的描述详细论述了本发明的某种优选实施方案，并陈述了所期望的最佳方式。但是，应明了无论前面论述地多详细，本发明可以多种方式实施，并且本发明的解释应该与补充的权利要求及其等同物一致。
权利要求
1.适于静脉内施用形式的流体碳氟化合物乳剂在制备用于增加患者血流中循环一氧化氮的量和稳定的半寿期的药物中的用途，而该患者需要增加循环一氧化氮的量和稳定的半寿期。
2.适于静脉内施用形式的流体碳氟化合物乳剂在制备药物中的用途，而该药物用于降低一氧化氮诱导的对脊椎动物血流中循环外源性血红蛋白的失活。
3.适于静脉内施用形式的碳氟化合物乳剂在制备用于治疗疾病的药物中的用途，该疾病是全部或部分由于内源性一氧化氮的缺陷引起的。
4.适于静脉内施用形式的碳氟化合物乳剂在制备用于促进需要血管扩张的患者血管扩张的药物中的用途。
5.权利要求1或4的用途，其中有效量的外源性一氧化氮在肺内施用。
6.权利要求1或4的用途，其中有效量的一氧化氮在静脉内施用碳氟化合物乳剂之前被溶于碳氟化合物中。
7.权利要求1的用途，其中乳液中的碳氟化合物包括全氟辛基溴。
8.权利要求1的用途，其中患者是人类。
9.流体碳氟化合物乳剂在增加患者血流中循环一氧化氮的量和稳定半寿期中的用途，其中患者需要循环一氧化氮的量和稳定半寿期增加，该用途是通过静脉内施用有效量的流体碳氟化合物乳剂实现的。
10.流体碳氟化合物乳剂在降低脊椎动物血流中循环一氧化氮诱导的外源性血红蛋白失活中的用途，其中有效量的流体碳氟化合物乳剂先于或在施用有效量的外源性血红蛋白的同时静脉内施用。
11.碳氟化合物乳剂在治疗全部或部分因内源性一氧化氮缺陷而引起的疾病中的用途，其中有效量的碳氟化合物乳剂先于或在肺内施用有效量的外源性一氧化氮的同时静脉内施用。
12.流体碳氟化合物乳剂在促进血管扩张中的用途，这是通过给需要血管扩张的患者静脉内施用有效量的碳氟化合物乳剂而实现的。
13.权利要求9或12的用途，其中经肺施用有效量的外源性一氧化氮。
14.权利要求9或12的用途，其中有效量的一氧化氮在静脉内施用碳氟化合物乳剂之前被溶于碳氟化合物中。
15.权利要求9的用途，其中乳液中的碳氟化合物包括全氟辛基溴。
16.权利要求9的用途，其中患者是人类。
17权利要求2的用途，其中所讲的流体碳氟化合物乳剂与外源性血红蛋白相结合。
18权利要求3的用途，其中流体碳氟化合物乳剂与适于脉内施用的外源性一氧化氮相结合。
19.一种在需要增加循环一氧化氮的量和稳定的半寿期的患者中增加血流中循环一氧化氮的量和半寿期的方法，包括静脉内施用有效量的流体碳氟化合物乳剂。
20.权利要求19的方法，还包括肺内施用有效量的外源性一氧化氮这一步。
21.权利要求19的方法，还包括在静脉内施用碳氟化合物乳剂前把有效量的一氧化氮溶于碳氟化合物中这一步。
22权利要求19的方法，其中乳液中的碳氟化合物包括全氟辛基溴，
23.权利要求19的方法，其中患者是人类。
24.一种降低哺乳动物血流中一氧化氮诱导的循环外源性血红蛋白的失活的方法，包括在施用有效量的外源性血红蛋白之前或同时，静脉内施用有效量的流体碳氟化合物乳剂。
25一种治疗全部或部分因缺乏内源性一氧化氮而引起的疾病的方法，包括在肺内施用有效量的外源性一氧化氮之前或同时，静脉内施用有效量的碳氟化合物乳剂。
26一种促进血管扩张的方法，包括给需要血管扩张的患者静脉内施用有效量的碳氟化合物乳剂。
全文摘要
利用生物相容性碳氟化合物乳剂抑制血循环中内源性一氧化氮的清除,从而能抑制血管狭窄和血管收缩,以及任何其它的全部或部分因缺乏内源性一氧化氮而引起的生理疾病或紊乱。也可利用流体碳氟化合物乳剂来增加静脉内施用的血红蛋白的功效,这是通过限制溶于血浆中的、能形成高铁血红蛋白的一氧化氮而实现的。
文档编号A61K47/06GK1192136SQ96195948
公开日1998年9月2日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者S·F·弗莱姆 申请人:联合药品公司