专利名称：局部使用的无环鸟苷衍生物的制作方法
无环鸟苷(ACV)是一种含有稀有不完全(无环)糖部分的鸟苷的抗病毒核苷类似物。核苷类似物中断NDA在细胞中的复制过程，并由此用作抗病毒和抗肿瘤剂。ACV在I型和II型单纯疱疹病毒感染的治疗中特别有效。ACV在细胞中的抗疱疹病毒活性以低毒性存在，这是因为ACV可选择性地被HSV胸苷激酶磷酸化，而不会受宿主细胞胸苷激酶影响。结果，只有被HSV感染的细胞可形成一磷酸ACV(ACV-MP)。然后ACV-MP通过细胞酶合成代谢转化为三磷酸ACV，这是干扰病毒复制的活性剂。(Fyfe，J.等人，生物化学杂志2538721-8727(1978)；Furman，P.等人，病毒学杂志3272-77(1979))。
无环鸟苷的抗疱疹病毒活性已在其抑制单纯疱疹病毒在组织培养细胞中的复制中得到证明(O’Brien，W.，等人，抗微生物剂与化学疗法(Antimicrob. Agents and Chemother.)341178-1182(1990))；此外还在临床研究中得到证明，其中感染HSV的患者通过口服ACV来进行治疗(Whitley，R.，免疫生物学和人体疱疹病毒感染的预防，C.Lopez等人(eds)Plenum Press，NY 1990；和Straus，S.，性传播疾病(Sexually Transmitted Diseases)16(2)107-113(1989))。
尽管接受局部无环鸟苷治疗的患者表现出某些症状减轻，治愈缓慢且不完全，但仍选择无环鸟苷来治疗粘膜和皮肤HSV感染(Spruance，S.等人，传染病杂志14685-90(1982)；和Spruance，S.等人，抗微生物剂与化学疗法25553-555(1984)。
利用ACV与干扰素一起组合治疗疱疹病毒感染的培养细胞(O’Brien，W.，等人，抗微生物剂与化学疗法34(6)1178-1182(1990))或利用ACV与HSV灭活剂A1110U一起局部治疗无胸腺小鼠的疱疹角膜炎(Lobe，D.等人，抗病毒研究1587-100(1991)显示协同的抗疱疹病毒I活性，超过单独使用ACV时的效果。
无环鸟苷已有些成功地用于临床试验来治疗另一种病毒疾病-水痘(chickenpox)(Whitley，R.等人，免疫生物学和人体疱疹病毒感染的预防，C.Lopez(ed)，Plenum Press，NY 1990，pp.243-253)。同时还曾尝试性地用其治疗其他病毒病因学未确定的疾病如再生障碍性贫血(Gomez-Almaguer，D.等人，美国血液学杂志29172-173(1988)和十二指肠溃疡(Rune，S.J.等人，Gut 31151-152(1990))，但未取得成功。
已有显示表明磷酸无环鸟苷在体外对野生型或实验室分离的HSV-1感染的培养细胞是有效的，但是在相同条件下，对HSV的胸苷激酶缺乏突变体则疗效很小或无效。(参见
图1和图2数据)。
对于免疫抑制的病人，如感染HIV(AIDS)或服用了免疫抑制药以防止移植排斥的接受了移植物的病人，ACV可长期使用预防令人烦恼的疱疹的突发。这种治疗提供了一种选择性的压力，将导致HSV胸苷激酶(90％频率)以及DNA聚合酶(10％频率)的突变，从而依次产生ACV病毒抗性菌株。对于这些无环鸟苷抗性疱疹病毒菌株没有有效的局部疗法。
按照本发明，提供了可有效治疗因疱疹病毒感染而引起的粘膜和皮肤疱疹损害的无环鸟苷磷酸酯，和其他抗疱疹抗病毒核苷类似物磷酸酯。这些制剂对于因胸苷激酶缺乏型疱疹病毒感染引起的损害显示出令人惊异的抗病毒活性，尽管它们对于培养细胞中的这些突变体病毒是相对迟钝的。本发明还提供了供局部使用的药物制剂，包含处于合适的药物载体中的、有效的、抗病毒浓度的无环鸟苷衍生物，可以是一磷酸无环鸟苷、二磷酸无环鸟苷、三磷酸无环鸟苷、一磷酸无环鸟苷甘油酯、二磷酸无环鸟苷甘油酯、无环鸟苷一磷酸吗啉化物(morpholidate)、无环鸟苷二磷酸吗啉化物、一磷酸无环鸟苷异亚丙基甘油酯、二磷酸无环鸟苷异亚丙基甘油酯、无环鸟苷磷酸亚甲基二膦酸酯，或其混合物。
当依赖于通过病毒胸苷激酶磷酸化的其他抗单纯疱疹核苷以它们的磷酸酯制成合适的局部制剂，并应用于感染患者的皮肤时，也将显示出增强的活性。
按照本发明的另一方面，提供了一种病毒感染的局部治疗方法，包括将包含本发明的任何一种磷酸无环鸟苷衍生物或其混合物的制剂应用于病毒感染动物，包括人或其他哺乳动物的粘膜或皮肤损害。在该方法的优选实施方案中，动物是被疱疹病毒感染的。在特别优选的实施方案中，动物是被对无环鸟苷抗性的疱疹病毒菌株感染的。无环鸟苷抗性疱疹病毒菌株可能是一种由于胸苷激酶基因改变或缺乏而可抵抗抗病毒剂的病毒菌株。
按照本发明的另一方面，将至少一种抗疱疹核苷类似物磷酸盐用于制备可治疗粘膜或皮肤病毒感染的药剂。在优选的实施方案中，该磷酸核苷是水溶性盐。在另一个优选的实施方案中，病毒感染是I型或II型单纯疱疹病毒。
在本发明的另一方面，按照本发明的抗疱疹核苷类似物磷酸酯与药学上可接受的载体一起用于制备可治疗粘膜或皮肤病毒感染的药剂。在优选的情况下，药学上可接受的载体选自含水乳膏和聚乙二醇。
另外还提供了抗疱疹核苷磷酸酯如无环鸟苷氨基磷酸酯和硫代磷酸酯，以及包含硫和亚甲基桥基的抗疱疹核苷类似物多磷酸酯。
附图简述图1显示无环鸟苷与一磷酸无环鸟苷对单纯疱疹病毒在Wi38成纤维细胞中的复制的影响的对比。
图2显示无环鸟苷与一磷酸无环鸟苷对HSV-DM.21TK突变体在体外复制的作用的对比。
图3显示无环鸟苷与无环鸟苷磷酸酯对HRS/J小鼠中，TK缺乏型无环鸟苷抗性HSV-1感染的局部作用的对比。
图4显示无环鸟苷与无环鸟苷磷酸酯对HRS/J小鼠中，TK改变型无环鸟苷抗性HSV-1感染的局部作用的对比。
图5显示无环鸟苷与无环鸟苷磷酸酯对HRS/J小鼠中，野生型无环鸟苷抗性HSV-1感染的局部作用的对比。
图6显示无环鸟苷与一磷酸无环鸟苷对HRS/J小鼠中，TK改变型无环鸟苷抗性HSV-1感染的局部作用的对比。
本发明提供了无环鸟苷磷酸盐衍生物，它对单纯疱疹病毒(HSV)、特别是对于HSV的ACV抗性突变体感染具有优良的局部活性。
无环鸟苷是嘌呤碱-鸟嘌呤的类似物，其在9位具有取代基，且有无环糖基，常用名即由此衍生而来。无环鸟苷的化学名是9-(2-羟乙氧甲基)鸟嘌呤，其结构为
本发明的无环鸟苷磷酸衍生物在无环糖基的末端O-位上带有取代基R，如下所示
其中取代基R如下所示
-一磷酸 -二磷酸
-一磷酸甘油 -二磷酸甘油
-一磷酸吗啉化物 -二磷酸吗啉化物
-一磷酸亚异丙基甘油 -二磷酸亚异丙基甘油相关的三磷酸衍生物具有包含另外磷酸基的对应结构。
按照本发明，将无环鸟苷一磷酸(ACV-MP)、无环鸟苷二磷酸(ACV-DP)、无环鸟苷三磷酸(ACV-TP)、无环鸟苷一磷酸甘油(ACV-MP-G)、无环鸟苷二磷酸甘油(ACV-DP-G)、无环鸟苷一磷酸吗啉化物(ACV-MP-吗啉)、无环鸟苷二磷酸吗啉化物(ACV-DP-吗啉)、无环鸟苷磷酸亚甲基二膦酸(ACV-PMDP)、无环鸟苷一磷酸异亚丙基甘油(ACV-MP-isoP-G)、无环鸟苷二磷酸异亚丙基甘油(ACV-DP-isoP-G)等化合物单独或结合应用，制备成合适的局部用药物制剂，并用于HSV感染个体的皮肤损害。所述化合物ACV-MP、ACV-DP、ACV-TP、ACV-DP-G、ACV-PMDP、无环鸟苷的吗啉衍生物以及所述无环鸟苷的异亚丙基甘油衍生物是非脂类、水溶性磷酸酯，因此优选制成含水基局部制剂。
令人惊异的是，我们已经发现了无环鸟苷的磷酸酯，且我们希望其他核苷的一磷酸和多磷酸衍生物将显示出增强的局部抗HSV活性。我们还证明了核苷类似物的一磷酸、二磷酸和三磷酸盐以及磷酸亚甲基二膦酸衍生物盐可容易地制备，且这些盐显示出在含水基质，即乳膏、凝胶或其他含水分散体中的增强的溶解性。另外，这些盐能溶于可提供一种独特的粘膜或皮肤分散体的聚乙二醇基质。
用于本发明方法的其他核苷类似物的多磷酸酯包括亚甲基-和硫链多磷酸酯核苷类似物以及单和多氨基磷酸酯，和单及多硫代磷酸酯核苷类似物。
与上述化合物类似，其他抗单纯疱疹核苷的一磷酸、二磷酸及其他磷酸酯将显示出增强的局部活性。下列疱疹抗病毒核苷的磷酸酯显示出增强的活性1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-E-5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶；2′-氟碳环-2′-脱氧鸟苷；6′-氟碳环-2′-脱氧鸟苷；1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5(E)-(2-碘乙烯基)尿嘧啶；(1r-1α，2β，3α)-2-氨基-9-(2，3-双(羟甲基)环丁基)-6H-嘌呤-6-酮；9H-嘌呤-2-胺，9-((2-(1-甲基乙氧基)-1-((1-甲基乙氧基)甲基)乙氧基)甲基)-(9C1)；三氟胸苷；9-〔(1，3-二羟基-2-丙氧基)甲基〕鸟嘌呤；5-乙基-2′-脱氧尿苷；E-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷；5-(2-氯乙基)-2-′脱氧尿苷；1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC)；1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿苷(FIAU)；布昔洛韦；6-脱氧无环鸟苷；
9-(4-羟基-3-羟甲基丁-1-基)鸟嘌呤；E-5-(2-碘乙烯基)-2′-脱氧尿苷；5-乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶(V-araU)；1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶(ara-T)；2′-去甲-2′-脱氧鸟苷(2′NDG)；9-(4-羟基-3-羟甲基丁-1-基)鸟嘌呤(penciclovir，BRL 3912)；1-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤(ara-A；vidarabine)。
通式为下式的一磷酸、二磷酸和三磷酸酯
其中N为抗单纯疱疹病毒核苷类似物；Z为O、S或NH；n为1或2；或者通式也可以是
其中N为抗单纯疱疹病毒核苷类似物；Z为O、S或NH；X为O、CH2或S；和n为1或2。
因此，磷酸酯可以是磷酸酯、硫代磷酸酯或氨基磷酸酯，二酯和三酯也可带有除氧原子外的桥原子，例如2，3-μ-硫代三磷酸酯或2，3-μ-亚甲基二膦酸。
与预料相反，这些核苷类似物磷酸酯可通过HSV感染的皮肤细胞的细胞膜，并通过抑制HSV DNA聚合酶而降低病毒复制的速度。本发明的一和二磷酸核苷通过细胞合成磷酸化作用转化为它们的三磷酸酯，但三磷酸类似物不需要抑制细胞DNA聚合酶就可直接抑制HSV DNA聚合酶。本发明还提供了各种浓度核苷类似物一磷酸、二磷酸和三磷酸的药物制剂，它们可局部应用并有效地降低感染皮肤细胞中HSV的增生。当DNA链终止二脱氧核苷磷酸以适宜的局部制剂应用于皮肤时，将类似地降低HSV复制。这些包括无环鸟苷、ganciclovir、penciclovir、BVaraU、二脱氧胞苷、二脱氧胸苷、二脱氧鸟嘌呤、二脱氧腺苷、二脱氧肌苷、3′-叠氮基二脱氧胸苷、二脱氧氢化二脱氧胸苷(d4T)和其他二脱氧核苷类似物如未审美国专利申请SN 07/373,088中公开的那些。
这些化合物盐的制备很容易，且这样的盐应当显示出在含水基质，即乳膏、凝胶或其他含水分散体中的增强的溶解性。一般说来，这些化合物的有用的盐包括钠、钾、锂、铵或氢盐。也可使用本领域技术人员熟知的任何生理上可接受的阳离子。另外，这样的盐在提供良好的粘膜或皮肤分散体的聚乙二醇乳膏和洗剂中是可用且有效的。
这些化合物的各种磷酸酯可基本上按照下述方法进行制备。无环鸟苷磷酸酯的合成本发明提供了无环鸟苷一和二磷酸、无环鸟苷一磷酸吗啉化物、无环鸟苷一和二磷酸甘油、以及无环鸟苷一和二磷酸1，2-异亚丙基甘油的合成方法。
按照Yoshikawa，M.等人，日本化学会通报423505-3508(1969)的方法，利用Toorchen，D.和Topal，M.，Carcinogenesis41591-1597(1983)的方法对其改进，可从无环鸟苷制备无环鸟苷一磷酸，这用实施例1进行说明。通过Ott，D.G.等人，分析生物化学21469-472(1967)的方法，利用三丁基磷酸铵或三丁基焦磷酸铵作为磷酸供体，可以象其他核苷类似物那样制备出无环鸟苷二磷酸。
无环鸟苷二磷酸甘油的制备方法见实施例2-4。一般说来，核苷磷酸甘油是以与制备磷脂酰核苷类似的方式制备的。在实施例3描述的方式中，按照实施例2，无环鸟苷磷酸通过加入离去基团例如吗啉而活化，并在N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)的存在下，与3-磷酸甘油酯二环己基铵盐缩合。另一方面，如实施例4中所述，带有被异亚丙基部分保护的活性羟基的磷酸甘油酯通过加入吗啉化物而活化，然后在实施例2描述的条件下，与无环鸟苷一磷酸缩合。
过去，通过合适的二酰基磷脂酸吗啉化物(PA-吗啉化物)与无环鸟苷一磷酸(ACV-MP)缩合已制备出含有不同酰基链的大量无环鸟苷-二磷酸-甘油二酯(ACV-DP-DG)。Agranoff，B.和Suomi，W.，生化制品1047-51(1963)描述了一种可进行的方法。另外，题为“脂核苷酸合成”的美国专利申请序列号No.07/706,873和Hong等人的英国专利申请No.2,168,350中公开了制备核苷一磷酸的吗啉化物并与磷脂酸缩合。
上述化学方法一般公开了它们制备本发明化合物的常规应用。偶尔，该反应不可如所描述的那样适用于包括在其公开范围内的每一种化合物。本领域技术人员很容易识别这样的化合物。在所有这样的情况下，该反应可通过本领域技术人员熟知的常规改进而成功地进行，例如通过适宜的干扰基团的保护，通过改变可供选择的常规试剂，或通过反应条件的常规改进而进行。另一方面，本文中公开的或是常规的其他反应将应用于本发明对应化合物的制备。在所有制备方法中，所有起始物是已知的或易于从已知起始物制备的。除非另有说明，所有份数和百分数是基于重量的。核苷一磷酸、二磷酸和三磷酸以及核苷磷酸类似物的合成通过与磷酰氯反应而合成核苷一磷酸的方法已公开于美国未审专利申请SN 07/373,088和SN 08/060,258中，并如前所描述(Yoshikawa等人，日本化学会通报423505-3508，1969；Toorchen，D.和Topal，M.，Carcinogenesis41591-1597，1983)。通过Ott，D.G.等人(分析生物化学21469-472，1967)的方法制备核苷二磷酸。
核苷三磷酸利用Seela和R ling的方法(核酸研究2055-61，1992)制备，或利用Moffat和Khorana方法(美国化学会会志83663，1991)从核苷一磷酸制备，或利用Hoard和Ott方法(美国化学会会志871785-1788，1963)制备。后面的实施例体现了用于制备核苷及核苷类似物的磷酸酯的一些合成的细节。
可利用本领域技术人员熟知的方法合成其他核苷磷酸类似物，包括核苷硫代磷酸酯、核苷氨基磷酸酯、核苷膦酸酯和核苷氟化磷酸酯，并由，例如D.W.Hutchinson进行了概述(核苷一、二、三和四磷酸酯以及磷酰基残基不同的核苷的合成、反应和性能。见核苷酸及核苷化学，L.Townsend编，1991，pp81-146，在此引入作为参考)。常用合成方法总结如下。
(1)核苷硫代磷酸酯是核苷酸的类似物，其中的一个或多个磷酰基氧原子被硫取代。早期合成方法是使保护的核苷与三(1-咪唑基)膦硫反应，而更近期的合成方法是用硫代磷酰氯(PSCL3)代替后一种试剂。用氢氧化钠和二硫化碳处理核苷磷苯胺盐(Phosphoranilidate)可将其转化为硫代磷酸酯。直接将核苷5′-亚磷酸酯硫化可得到核苷5′-硫代磷酸酯。嘌呤核苷2′(3′)-硫代磷酸酯可通过使它们的2′，3′-O-二-正丁基甲锡亚烷基衍生物与硫代磷酰氯反应，然后碱解而合成。
(2)核苷氨基磷酸酯是其中一个或多个磷酰基氧原子被氮取代形成P-N键的类似物，该P-N键即使在弱酸性条件下，也认为其比核苷硫代磷酸酯的P-S键更加相当地不稳定。这些化合物的合成包括氨基核苷的磷酸化和用磷酸三酯对核苷叠氮化物的处理。亲油性核苷氨基磷酸酯是特别有用的抗HSV化合物，因为它们在细胞中水解为生物活性化合物后能更容易地被细胞吸收。
(3)核苷膦酸是其中的磷酰基氧被碳取代形成稳定的P-C键的化合物，当磷原子被供电子烷基基团而不是氧取代时，其P-OH基团的酸性下降。本领域技术人员利用Arbusov或Michaelis-Becker反应可容易地从核苷卤化物制备核苷膦酸。可利用本领域技术人员熟知的方法从2′，3′-保护的5′碘-5′-脱氧核苷合成核苷5′-膦酸。通过将适当保护的核苷5′-醛与三苯基亚正膦基甲基膦酸二苯基酯偶合得到α，β-不饱和膦酸二酯，然后将其还原并对磷酰残基脱保护得到膦酸而合成其中5′-氧被亚甲基取代的等配核苷5′-膦酸。等配核苷3′-膦酸是从与嘌呤或嘧啶的重金属盐偶合的膦酰化核糖-1氯开始合成的。膦酸的极性一般比它们的磷酸对应物要低，并因此可用作抗HSV剂，因为当它们局部应用时更容易被细胞吸收。
(4)核苷氟化磷酸酯是单核苷酸的类似物。用2，4-二硝基氟苯处理核苷5′-磷酸，经核苷酸的2，4-二硝基苯基酯产生核苷5′-氟化磷酸酯。
(5)其他核苷多磷酸类似物包括在核苷的二和三磷酸中的α，β-磷原子间，或在核苷三磷酸中的β，γ-磷原子间除氧原子以外的其他原子被取代的那些(包括列于D.W.Hutchinson，核苷酸及核苷化学，L.Townsend编，1991，119页表III中的那些)。通常，α，β-类似物是通过2′，3′ O-保护的核苷与焦磷酸类似物在DCC的帮助下缩合，或通过涉及甲苯磺酰基核苷的糖残基的5′位上的甲苯磺酰基(tosyl)被亚甲基二膦酸根离子取代的亲核取代反应来制备。
我们发现，在局部治疗无环鸟苷抗性HSV-1感染的疱疹损害中，本发明的无环鸟苷衍生物，包含ACV-MP、ACV-DP、ACV-TP、ACV-MP-甘油、ACV-DP-甘油、ACV-MP-异亚丙基甘油、ACV-DP-异亚丙基甘油和ACV-P-亚甲基二膦酸特别有效。实施例7证明，被HSV的野生型分离物和HSV的实验室菌株感染的培养细胞用无环鸟苷和无环鸟苷一磷酸治疗取得同等成功(实施例7；图1)。对于Wi38成纤维细胞中的这些病毒感染，无环鸟苷和无环鸟苷一磷酸具有相同的IC50，约为1或2μM浓度。不过，当相同的培养细胞系统被病毒的无环鸟苷抗性菌株HSV-DM.21感染时，由于缺乏将无环鸟苷转化为无环鸟苷一磷酸所必需的胸苷激酶，无环鸟苷和无环鸟苷一磷酸在减少病毒噬斑的数目方面是无效的(实施例7；图2)。
根据上述培养细胞的体外数据，无环鸟苷磷酸酯对无环鸟苷抗性皮肤HSV-1感染的功效是令人惊异的。在减少无环鸟苷抗性HSV-1感染的小鼠的疱疹损害的数目方面，以含水乳膏形式应用的无环鸟苷磷酸酯比天然无环鸟苷更有效(实施例9；图3和4)。
因此，根据这些结果，我们相信，作为局部用洗剂在体外掺入无环鸟苷，和无环鸟苷磷酸酯优于通过不同操作方式在体内应用。核苷类似物磷酸酯的局部制剂如前所述的本发明的核苷类似物衍生物可以通过混合入本领域技术人员熟知的在皮肤病学上应用的各种有用和常用的制剂中而制备成局部用的制剂。该核苷类似物衍生物是水溶性的，因此水溶液、油包水型乳剂或含水乳膏是高度优选的制剂。无环鸟苷和其他核苷一磷酸的水溶性可通过盐的制备来增强，如钠、钾、铵或氢盐。在特别优选的制剂中，活性成分用聚乙二醇(PEG)赋形剂制备。另一方面，活性成分可以利用不溶性粉末如淀粉或滑石作为稀释剂或载体而应用于干粉制剂中。
载体是某些局部制剂的重要成分，因为可选择它来增强渗透，延长活性的持续时间，或适应用药部位的需要。例如，用于身体胼胝状部位如手掌或足底的制剂，可包括渗透增强剂如二甲亚砜丙二醇或azoneTM；对于擦烂的区域如两腿分叉处、内肘或手指或脚趾间可选用粉状制剂。也可将该制剂制备成含有本领域技术人员熟知的各种有机聚合物或其他组合物，以使活性抗病毒无环鸟苷衍生物持续释放。
在所有药剂师都知道的药典Remington’s药物科学，第15版，1975，Mack出版公司，Easton，宾西法尼亚18042(87章Blaug，Seymour)中可找到大量合适的局部制剂。这些制剂包括，例如粉末、糊、软膏、凝胶、蜡、油、类脂、无水吸收基质、水包油或油包水型乳剂、乳化碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有碳蜡的半固体混合物。
活性成分在本发明的局部制剂中的浓度可为约0.01gm％-100gm％；优选约0.1gm％-50gm％；最优选约1gm％-约15gm％。该制剂可进一步包含有效浓度的可帮助促进皮肤渗透和愈合的其他制剂，如在上面参考的药典中描述的和本领域普通技术人员熟知的那些。
含有本发明活性磷酸酯的局部制剂的效力可利用本领域技术人员熟知的常规测试方法来评估。例如，一种特别高效的方法是Ellis，M.等人的《抗微生物剂与化学疗法)》33304-310(1989)中描述的鼠“口面模型”。在这一测试系统中，在小鼠的口鼻部上划痕并接种HSV的发病机理是免疫抑制宿主中皮肤HSV感染疾病周期的合理模型。
该制剂可反复用于受影响皮肤的损害，例如一天一次、两次或几次，治疗可持续数天直到痊愈。其毒性和刺激性是最小的。
实施例1无环鸟苷核苷衍生物的磷酸化无环鸟苷核苷衍生物可通过下述方法制备。基本上按照Yoshikawa等人，《四面体快报》505065-5068(1967)和Yoshikawa，M.，Kato等人，《日本化学会通报》423205-3208(1967)中的描述，使未保护的无环鸟苷与POCL3在磷酸三甲酯((CH3O)3PO)中反应。边搅拌边向2M POCL3的300-400mL磷酸三甲酯的冷却溶液(0℃)中逐滴加入无环鸟苷(1M)，反应温度保持在0-5℃之间。通过HPLC，利用Mono Q HR5/5阴离子交换柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)监测反应进展。一般，用氢氧化钠水溶液中和5μL反应混合物(最终pH7)并注射到柱上。
如下进行洗脱用水洗涤，用0.1M碳酸铵、NH4HCO3洗脱出无环鸟苷一磷酸，接着用0.1-0.6M NH4HCO3进行线性梯度洗脱，得出一些更高磷酸化的产物。利用此方法测定该反应基本在45-75分钟完成，将反应产物水解并用2体积氢氧化钠水溶液中和到最终pH7。
通过上述反应混合物的分析方法精制该产物化合物。利用这一方法，制得0.8摩尔无环鸟苷一磷酸，并利用相同的洗脱条件以Q琼脂糖快速流动柱精制。
反复从水中冻干后，产率在80％-96％之间变化。
用显影系统1-丙醇/25％NH3/H2O(体积20∶20∶3)进行TLC分析(二氧化硅60/F254板，Merck)显示出单一U.V.和Pi阳性斑点。
实施例2无环鸟苷一磷酸吗啉化物的制备将无环鸟苷一磷酸(5mmol)和吗啉(20mmol)悬浮于叔丁醇(50mL)中，并在轻微回流条件下加热，同时在1小时内逐滴加入溶解于叔丁醇(50mmol)的N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC，20mmol)。该混合物在回流条件下搅拌12-36小时并蒸发至干燥。残余物用乙醚研制，并用相同溶剂通过倾析洗涤。从甲醇-乙醚混合物中重结晶而精制产物。
实施例3从无环鸟苷一磷酸吗啉化物制备sn-甘油-3-二磷酸无环鸟苷将如实施例2所述制备的无环鸟苷一磷酸吗啉化物(2mmol)溶解于干燥吡啶(20mL)并真空蒸发至干燥。将残余物溶于吡啶并蒸发这一过程再反复进行三次以从化合物中除去微量水。将3-磷酸甘油酯二-单环己基铵盐(3mmol)加入干燥残余物中，并将该混合物溶于20mL吡啶，在60℃，惰性气氛中搅拌12-36小时。真空蒸发溶剂，残余物用乙醚滴定，所得固体通过离子交换柱经DEAE交联葡聚糖柱(2.5cm×30cm)，利用碳酸氢铵线性梯度(10mmol-300mmol，每次500mL)洗脱而精制。汇集含有纯产物的馏分(利用TLC和分析型HPLC鉴别)并冻干得到标题化合物。
实施例4从1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-一磷酸吗啉化物制备sn-甘油-3-二磷酸无环鸟苷A.制备1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-磷酸在30分钟内，将磷酰氯(25mmol)逐滴加入冷却到0℃的1，2-异亚丙基甘油(20mmol)(Sigma，St.Louis，MO.)和三乙胺(100mmol)的混合物中。将该混合物在0℃搅拌10-90分钟后，加入水(1mL)使反应停止。然后将混合物溶于氯仿(500mL)并用水洗涤(3×100mL)。合并水洗溶液后再用氯仿(50mL)萃取并冻干。产物不需任何另外的精制，立即用于随后的反应。B.制备1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-一磷酸吗啉化物按照实施例2中描述的制备无环鸟苷磷酸吗啉化物的过程，将在(A)中所述制得的1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-磷酸与吗啉缩合制得1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-一磷酸吗啉化物。
中间体化合物1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-一磷酸吗啉化物与无环鸟苷一磷酸在实施例2描述的条件下进行反应，得到1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-一磷酸吗啉化物。
将1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-二磷酸无环鸟苷(1mmol)溶于50-90％含水乙酸中，并在室温下搅拌4-12小时，如上所述精制粗产物甘油-3-二磷酸无环鸟苷。
实施例5sn-甘油-3-磷酸无环鸟苷的制备将1mM(如实施例4B中制备的)1，2-异亚丙基-sn-甘油-3-磷酸和无环鸟苷(1mM)悬浮于干燥吡啶(10mL)和DCC(4mmol)中。加入溶解的吡啶(4mL)，该混合物在25-60℃下搅拌12-72小时。蒸除溶剂，残余物用乙醚滴定。粗产物利用如实施例3中所述的离子交换色谱进行精制。然后产物用含水乙酸处理，以去除异亚丙基保护基，得到标题化合物。
另外，标题化合物也可利用2，4，6-三异丙基苯磺酰氯(TPS-Cl)作为缩合剂来制备。
实施例6通过无环鸟苷二磷酸二棕榈酰甘油的碱解制备无环鸟苷磷酸酯混合物将无环鸟苷二磷酸二棕榈酰甘油(1mmol)溶于氯仿，并向其中加入甲醇化氢氧化钠(2.1mmol)。反应进行20-90分钟，用TLC监测反应进展。反应一完成，即向反应混合物中加入Dowex-50 X-2(H+)，并将pH调到7。过滤分离树脂，将滤液冻干，如实施例1所述精制粗产物。
实施例7从单核苷制备核苷三磷酸脱氧核糖核苷酸、二核糖核苷酸及类似物的5′三磷酸盐的制备包括下面所述的一系列反应。
在1993年5月12日申请的未审美国专利申请系列No.08/060,258和实施例1中描述了核苷类似物一磷酸的合成。另一种方法如下在室温下，核苷酸(I)与过量1，1′-羰基二咪唑(II)反应约1小时，形成咪唑化物(imidazolidate)(III)。用甲醇分解未反应的1，1′-羰基二咪唑，然后加入过量无机焦磷酸(IV)。这排除了可能随后不得不从反应物中去除的无机多磷酸的形成。加入了无机焦磷酸(IV)后，磷酸化反应将在约24小时完成，然后通过DEAE-纤维素阴离子交换色谱精制核苷三磷酸产物(V)，接着将产物转化为盐如钠盐。因为核苷酸(I)与咪唑化物(III)可一起反应形成对称的焦磷酸副产物，所以在较低的pH下进行DEAE-纤维素阴离子交换色谱，这时所需产物(V)比不希望的副产物具有更少的电荷，由此将这两种化合物分离。
用于合成的一种试剂是利用下述方法制备的三丁基焦磷酸铵。将焦磷酸四钠十水合物溶液(446mg，1mmol)通过Dowex 50W-X4TM(吡啶鎓)树脂(17mL)柱，向由此得到的吡啶鎓焦磷酸水溶液中加入三丁胺(0.24mL，1mmol)。将该溶液真空浓缩，然后通过连续添加并蒸除无水吡啶，随后加入并蒸发两个10mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)来干燥残余物。
核苷三磷酸的合成是利用下述方法完成的。向作为无水三丁基铵盐的单核苷酸(0.1mmol)的1mL DMF溶液或悬浮液中加入在1mL DMF中的1，1′-羰基二咪唑(80mg，0.5mmol)。将该结合物混合30分钟，然后在室温下，在干燥器中保持4-12小时，再将其用33μL(0.8mmol)甲醇处理，并在室温下反应30分钟。加入三丁基焦磷酸铵(0.5mmol)的5mL DMF液并剧烈混合，然后将该混合物在室温下，在干燥器中保持约24小时以使咪唑鎓焦磷酸沉淀。通过离心并再悬浮于DMF而去除沉淀，并用四份1mL DMF洗涤，得到约80-100％的纯度。上清液用等体积的甲醇处理，并真空蒸发至干。残余物用2×20cm DEAE-纤维素柱层析，用三乙基碳酸氢铵线性梯度洗脱(3L，约0-0.4M的梯度，在pH5-7.5条件下)，收集馏分，并进行分光光度测定以鉴别含有核苷三磷酸的馏分。将合适的馏分真空蒸发，并将三乙铵核苷三磷酸溶于甲醇到约0.05M的浓度，加入5体积高氯酸钠的丙酮溶液(15当量)以形成核苷三磷酸钠盐的沉淀。本领域技术人员将理解，可通过合适的沉淀反应制得核苷三磷酸的其他盐。离心收集沉淀的盐，用四份1mL丙酮洗涤，并用五氧化二磷真空干燥。
合成核苷三磷酸的其他方法是可以获得的，包括在下一个实施例中将叙述的那个方法。
实施例8利用2，2，2-三溴乙基偶磷吗啉代氯化物合成核苷一、二和三磷酸利用van Boom等人的方法(《四面体快报》322779-2782，1975)，从单一中间体制备核糖核苷的一、二和三磷酸盐及其衍生物。一般说来，该反应包括使单官能试剂(2，2，2-三溴乙基偶磷吗啉代氯化物)与核糖核苷(或其衍生物)反应使带有2，2，2-三溴乙基保护基的磷酸三酯衍生物附着到核糖核苷上(即生成核糖核苷5′-磷酸吗啉化物或核糖核苷5′-磷酸吗啉化物衍生物)。通过Cu/Zn偶合反应去除保护基，并酸性解封，进行中和，根据解封步骤中所用的酸和中和步骤中所用的铵盐不同，分别生成一、二和三磷酸盐。也就是说，为了得到一磷酸核糖核苷，使用HCL和氨；为了得到二磷酸核糖核苷，使用磷酸的单(三-正丁铵)盐；为了得到三磷酸核糖核苷，使用双(三-正丁铵)焦磷酸盐。
总体反应的图解如下
通过使2，2，2-三溴乙基偶磷二氯化物和吗啉在无水乙醚中反应制得单官能试剂(1)2，2，2-三溴乙基偶磷吗啉代氯化物，并用本领域中熟知的方法，从中去除反应产物，并利用环己烷/正戊烷重结晶。晶状2，2，2-三溴乙基偶磷吗啉代氯化物的熔点(mp)为79℃。
在20℃下，将单官能试剂(2mmol)与1mmol核苷或其衍生物在无水吡啶中混合48小时，然后将反应混合物层析分馏(B.J.Hunt& W.Rigby，Chem. & Ind. 1868，1967)得到无色核苷固体(III)。在20℃，用Cu/Zn电偶在无水DMF中对核苷酸处理10分钟，接着过滤除去过量Cu/Zn得到核苷磷酸吗啉化物。
然后用不同的酸和氨源处理核苷磷酸吗啉化物得到一、二或三磷酸酯。对于一磷酸，将磷酸吗啉化物用0.01N HCL，pH2在20℃处理2小时，然后用氨水(pH9)中和，经Sephadex G-25TM柱精制。
与此类似，通过使磷酸吗啉化物(0.1mmol)的2mL无水DMF液与0.5mmol双(三-正丁铵)焦磷酸的2mL无水DMF液在20℃排除水分的条件下反应3小时，得到核苷5′-三磷酸。将反应产物真空浓缩，用Dowex50TM(铵型)处理，并用2×25cm DEAE-纤维素柱，3L线性梯度的0.0-0.3M Et3NH2CO3溶液洗脱而精制。
通过使磷酸吗啉化物(0.1mmol)与0.6mmol单(三-正丁铵)磷酸的4mL无水吡啶液在20℃排除水分的条件下反应3小时，得到核苷5′-二磷酸，反应产物进行类似的浓缩和精制。另外，可通过用Zn粉在含有单(三-正丁铵)磷酸的吡啶溶液中处理磷酸三酯衍生物(III)而直接转化为对应的核苷二磷酸。也就是说，在20℃排除水分的条件下，将1mmol试剂III加入含有0.1g精细分散的Zn和12mmol单(三-正丁铵)磷酸的15mL无水吡啶的搅拌溶液中，然后将反应混合物离心，使Zn成丸状，在每一步将上清液与15mL水共蒸发三次，然后用DEAE纤维素精制。
实施例9无环鸟苷三磷酸的合成(1)无环鸟苷-5′-三磷酸，三乙铵盐，合成。将无环鸟苷(25mg，0.1mmol)溶于磷酸三甲酯(250μL，1.07mmol)，并加入POCL3(18.5μL，0.2mmol)。该混合物在0℃搅拌1.5小时，然后边剧烈搅拌边在1分钟内加入0.5M双(三-正丁铵)焦磷酸的1mL无水DMF液和1mL三正丁胺的混合物，用1M Et3NH2CO3水溶液，pH7，中和该溶液，并真空蒸发至干。残余物用2.6×30cm DEAE-Sephadex柱精制，利用线性梯度的Et3NH2CO3，pH7(11 H2O/11 0.7M TBK)溶液洗脱得到无色固体，其UV(H2O)λmax为258nm。
实施例10无环鸟苷磷酸亚甲基二膦酸的合成基本上按照Myers等人的方法1进行合成(《美国化学会会志》853292-3295，1963)。核苷5′-氨基磷酸酯与亚甲基二膦酸反应生成核苷多磷酸的膦酸类似物。另外，利用Myers等人的方法2(同上)，使核苷一磷酸与亚甲基二膦酸反应，用二环己基碳化二亚胺(DCC)作为缩合剂。
按照方法1，亚甲基二膦酸是通过其四乙基酯在浓HCL中的水解得到的，其四乙基酯是通过二碘甲烷与过量亚磷酸三乙酯反应而制备的。用54mL刚刚蒸馏的o-氯酚处理1，3-二环己基胍盐无环鸟苷5′-氨基磷酸酯(3.6mmol)和亚甲基二膦酸(10.8mmol)，将该混合物在冰上冷却，并加入36mL干燥吡啶。在冰中冷却时加入300mL水，将所得溶液置于室温下48小时，偶尔进行振摇。将该溶液用乙醚萃取6次(共850mL)。用1N HCL将水溶液调节到pH2，然后用30g酸洗的木炭(NoritA)处理并搅拌30分钟；过滤收集木炭，用水(总体积5L)充分洗涤。用50％含水乙醇-′5％浓氢氧化铵(共3L)洗脱该无环鸟苷衍生物，洗脱液在35℃蒸发而浓缩到400mL。将浓缩后的洗脱液加入到2.7cm×31cmDowex-2TM(氯化物，8％交联)柱上，用通过混合2L 0.003 N HCL(在混合容器中)和2L 0.003 N HCL加0.45N LiCl(在储存器中)制成的线性梯度液洗脱；收集10mL馏分，并用本领域技术人员熟知的方法，用纸层析或紫外线吸收剂鉴别含有无环鸟苷亚甲基二膦酸的馏分。用1NLiOH中和含有无环鸟苷亚甲基二膦酸的馏分，并在30℃蒸发浓缩，浓缩液用250mL丙酮-10％甲醇处理，以沉淀出固体，通过离心将其分离，并用丙酮-10％甲醇混合物洗涤，直到在洗液中检测不到氯化物。可通过下述方法精制无环鸟苷亚甲基二膦酸的锂盐将该盐溶于100mL水，并用LiOH调节到pH8，然后该溶液通过上述Dowex-2TM柱，利用由混合室中的1.5L 0.003N HCl和储存器中的1.5L 0.003N HCl加0.45N LiCl制成的梯度液洗脱，如上处理洗脱液，然后将沉淀溶于6mL水，并用40mL甲醇进行沉淀。将终沉淀物溶于15mL水，并冻干，生成无环鸟苷亚甲基二膦酸四锂盐的粉末。
利用方法2，将亚甲基二膦酸(11.4mmol)和无环鸟苷一磷酸(2.6mmol)溶于吡啶(30mL)和水(4mL)中生成两相混合物，并在室温下边剧烈搅拌边加入三等份DCC(在反应开始加入29mmol，4小时后加入48mmol，12小时后加入19mmol)。24小时后，反应完成，将沉淀的二环己基脲滤除，并用水洗涤。用水将滤液和洗液调到150mL总体积，并用乙醚(共300mL)萃取5次。将该溶液调节到pH8，并用2.5cm×17.5cm Dowex-1TM(甲酸盐，2％交联)柱层析，该柱用1.5L水洗涤以除去吡啶。通过向含有500mL水的混合室中顺序加入下述溶液4N甲酸(500mL)、4N甲酸加0.1M甲酸铵(500mL)、4N甲酸加0.2M甲酸铵(1500mL)，制得梯度液，利用该洗脱液洗脱柱子，并收集15mL馏分。利用本领域技术人员熟知的紫外吸收方法鉴别含有2CdATMDP的馏分(大约在管115-134)。将含有2CdATMDP的馏分合并，并冻干到约200mL的体积，然后用7g酸洗木炭(Norit A)处理，并搅拌15分钟，通过过滤收集木炭，并用水洗涤(共800mL)。用50％含水乙醇-5％浓氢氧化铵(共600mL)洗脱产物，将洗脱液在20℃蒸发浓缩到200mL的体积，过滤除去微量木炭，并冻干成粉。将该粉末溶于4mL水，并用过量1M乙酸钡处理该溶液；离心收集所得沉淀，用水洗涤，并在0℃将其溶于0.1N HBr。用1N NaOH将该溶液调节到pH6.5，通过离心收集所得沉淀，依次用2×2mL水、乙醇和乙醚洗涤。样品在室温下用P2O4干燥12小时，得到2CdATMDP二钡水合物。本发明的其他核苷类似物磷酸亚甲基二膦酸可类似地制备。
实施例11无环鸟苷一磷酸对HSV的无环鸟苷抗性TK突变菌株(DM.21)没有抗病毒作用分别用无环鸟苷或无环鸟苷一磷酸处理用单纯疱疹病毒(HSV)的野生型菌株或HSV的突变菌株(DM.21)感染的Wi38成纤维细胞的分离培养物。DM.21突变体缺少通常将ACV转化为ACV-MP的胸苷激酶，因此对无环鸟苷具有抗性。对HSV-1的结果示于图1中，对HSV-DM.21的结果示于图2中。IC50是抑制病毒噬斑形成50％的抗病毒剂浓度。
在单纯疱疹病毒(HSV-1)的野生型分离物和实验室菌株中，无环鸟苷和无环鸟苷一磷酸的IC50是0.1μM(图1)。相反，在该试验中，无环鸟苷和无环鸟苷一磷酸对突变体HSV菌株的IC50超过100μM(图2)。
基于这些体外结果，就不可能期待当无环鸟苷一磷酸局部给药于被缺乏胸苷激酶的或其他HSV的突变菌株感染的动物时，它会显示出显著活性。
实施例12无环鸟苷磷酸酯在HSV的无环鸟苷抗性菌株感染的小鼠中的抗病毒作用利用Ellis，M.等人的《抗微生物剂与化学疗法》33(3)304-310(1989)中描述的口鼻部刺痕法，将HRS/J型小鼠皮肤感染。简言之，10只小鼠一组，用乙醚轻度麻醉，用25号针在口鼻部刺痕接种，然后用浸泡于稀释病毒中的棉球涂敷器擦10秒钟。用于感染的病毒是TK缺乏菌株，参见Ellis，M.等人(TKD)的描述。按照上面所提到的Ellis法，感染3小时后，用无环鸟苷或无环鸟苷磷酸的含水乳膏(AC)制剂局部治疗动物，一天3次，治疗4天。
结果见图3。含5gm％无环鸟苷的制剂是有活性的。相比而言，含5gm％的80％无环鸟苷一磷酸与20％其他无环鸟苷磷酸酯(无环鸟苷二磷酸和无环鸟苷二磷酸甘油)的混合物的制剂显示出优异的活性，仅有几只小鼠出现疱疹损害。在所有组中，所有损害用8天治愈。
用一种毒性更强的菌株，TK变化的HSV-1病毒(TKA，Ellis，同上)重复上述过程，治疗持续5天。与TKD病毒不同，TKA对未治疗的小鼠是致死性的。用5gm％无环鸟苷治疗适当减少了损害面积，14天后大多数动物生存下来，病情得到基本改善。不过，如图4所示，用相同浓度的磷酸酯，则损害面积极大改善，9天后所有损害治愈，所有动物存活。
实施例13无环鸟苷一磷酸在无环鸟苷抗性野生型HSV-1感染的小鼠中的抗病毒作用利用对无环鸟苷敏感的野生型HSV-1和仅具有无环鸟苷一磷酸(ACV-MP)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。制成两种乳膏，一种是含有14.5mmol/100mL浓度ACV-MP的含水乳膏，另一种具有22.2mmol/100mL的无环鸟苷(均为5gm％，不过，由于加入磷酸基，以一磷酸存在的无环鸟苷的摩尔数相对于净无环鸟苷要低)。
感染24小时后开始治疗，一天四次，持续4天。到第5天10只未经治疗的小鼠出现阶段4损害，到第14天所有小鼠死亡(图5)。用无环鸟苷一磷酸治疗的动物未出现损害，10只动物均存活(图5)。在用无环鸟苷治疗的组中，几只小鼠出现轻微损害，在7-9天治愈，10只动物中有9只存活。
这一研究显示在防止野生型HSV-1感染损害中，低剂量的ACV-MP(14.5mmol/100mL)比无环鸟苷(22.2mmol/100mL)更有效。
实施例14无环鸟苷一磷酸在无环鸟苷抗性HSV-1感染的小鼠中的抗病毒作用利用仅有无环鸟苷一磷酸(ACV-MP)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。感染后3小时开始治疗，感染当天治疗两次，之后一天三次，持续4天。现参见图6，14.5mmol/100mL的ACV-MP显然比22.2mmol/100mL的无环鸟苷在降低无环鸟苷抗性(TK-改变)HSV-1感染的动物的损害得分方面更为有效。
在对照组及用无环鸟苷治疗组中，10只小鼠中有8只存活了14天，而用无环鸟苷一磷酸治疗组，10只小鼠均存活。
实施例15无环鸟苷一磷酸在无环鸟苷抗性HSV-2感染的豚鼠中的抗病毒作用我们以含水乳膏(AC)中的无环鸟苷一磷酸(ACV-MP)进行试验，以测定其是否能比聚乙二醇中的5％无环鸟苷(ACV-PEG)更有效地治疗初期生殖器疱疹。特别是，我们研究了由ACV抗性HSV-2导致的豚鼠的生殖器疱疹感染。因此，我们以两种载体系统含水乳膏(AC)和聚乙二醇(PEG)来对比无环鸟苷治疗。实验用安慰剂对照，未感染动物用ACV制剂处理以测评皮肤和阴道刺激性。
用HSV-2阴道内接种刚断奶的豚鼠，导致初期生殖器感染，其特征是病毒在阴道中开始复制，随后形成外部泡状损害。阴道中的病毒效价在1-3天达到峰值，到7-10天逐渐消除。外部生殖器损害在第4天头次出现，严重损害峰值发生于6-8天，到15-18天损害基本治愈。
用HSV-2菌株12247接种动物，该菌株具有改变的胸苷激酶并在体外对ACV治疗具有耐药性。对重250-300g的雌性Hartley豚鼠(Charles River，Kingston，NY)，首先拭抹阴道以除去阴道分泌物。1小时后，用2.4×104菌斑形成单位(pfu)将动物进行阴道内接种。接种是通过将用病毒浸泡的药签插入阴道并大约旋转6次而完成的。
10只豚鼠一组，每种制剂用0.1mL进行阴道及外部生殖器皮肤治疗(每只动物每次治疗共0.2mL)。从病毒接种后24小时开始，每天治疗动物3次，持续7天。三只未感染的动物按照同样的时间表用每种制剂进行治疗，以测评局部毒性和刺激性。
为了测定各种治疗对阴道内HSV-2复制的效果，在HSV-2接种后初期感染过程中的第1、3、5、7和10天时拭取阴道分泌物。将该拭子置于含有2.0mL基质的试管中，涡旋并在-70℃冷冻直到用HSV滴定。当所有样品收集后，将它们熔化，逐次稀释，利用微量CPE试验中的兔子肾细胞来测定HSV-2效价。
我们还检测了外部生殖器损害的形成及严重度，以测定治疗的效力。损害的严重度分为0-5+级。病毒接种后损害出现或未出现以及损害的严重度情况共记录19天。利用Mann-Whitney U rank sum试验，对PBS安慰剂治疗与PEG药物治疗，或AC安慰剂治疗与AC药物治疗的动物，比较其感染速率、峰值损害得分、病毒效价峰值、病毒效价-天数曲线下的面积，以及损害得分-天数曲线。认为0.05或更小的P-值显著。
ACV制剂对生殖器病毒复制的局部治疗作用示于表1中。只有ACV-MP制剂(5％ACV-MP-PEG或5％ACV-Mp-AC)的治疗显著降低了病毒效价-天数曲线下的面积(AUC)和平均病毒效价峰值。
表1无环鸟苷一磷酸对无环鸟苷抗性HSV-2阴道内接种的豚鼠生殖器病毒效价的治疗作用
A.局部和阴道内治疗是病毒接种后24小时开始的，一天三次，持续7天。在试验中用无环鸟苷一磷酸处理的无环鸟苷摩尔含量(14.5mmol/100mL)低于用净无环鸟苷处理的无环鸟苷摩尔含量(22.2mmol/100mL)。
B.NS＝当与合适的安慰剂治疗组比较时，统计学上差异不显著。
用ACV制剂局部治疗对损害发展的影响列于表II中。当与合适的安慰剂治疗组比较时，ACV和ACV-MP制剂均显著地改变了损害得分-天数AUC。不过，只有用5％ACV-MP-PEG治疗显著降低了平均峰值损害得分。
表II无环鸟苷一磷酸对无环鸟苷抗性生殖器HSV-2感染的豚鼠的外部损害发展的治疗作用
A.局部和阴道内治疗是病毒接种后24小时开始的，一天三次，持续7天。在试验中用无环鸟苷一磷酸处理的无环鸟苷摩尔含量(14.5mmol/100mL)低于用净无环鸟苷处理的无环鸟苷摩尔含量(22.2mmol/100mL)。
B.NS＝当与合适的安慰剂治疗组比较时，统计学上差异不显著。
在ACV抗性HSV-2生殖器疱疹感染的豚鼠模型中，只有ACV-MP显著降低了生殖器病毒复制。而且，ACV-MP-PEG治疗组具有最低的病毒效价-天数和平均效价峰值。ACV-MP和ACV均改变了损害发展，PEG中的药物的得分低于AC中的药物。另外，接受ACV-MP-PEG的动物具有最低的损害得分-天数和平均峰值损害得分。
此外，在整个研究过程中，在用ACV制剂治疗的未感染的动物中没有出现任何生殖器区域的刺激迹象或任何其他毒性。
这些结果证明无环鸟苷一磷酸在治疗HSV-2生殖器疱疹中有强烈活性。另外，令人感兴趣地注意到聚乙二醇分散的无环鸟苷一磷酸在损害的治疗中显示出最佳效力。
实施例16无环鸟苷二磷酸的活性利用仅具有无环鸟苷二磷酸(ACV-DP)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到其效力比单独ACV的效力高。
实施例17无环鸟苷一磷酸甘油的活性利用仅具有无环鸟苷一磷酸甘油(ACV-MP-G)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到其效力比单独ACV的效力高。
实施例18无环鸟苷二磷酸甘油的活性利用仅具有无环鸟苷二磷酸甘油(ACV-DP-甘油)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到其效力比单独ACV的效力高。
实施例19无环鸟苷一磷酸吗啉化物的活性利用仅具有无环鸟苷一磷酸吗啉化物(ACV-MP-吗啉化物)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到其效力比单独ACV的效力高。
实施例20无环鸟苷一磷酸异亚丙基甘油的活性利用仅具有无环鸟苷一磷酸异亚丙基甘油(ACV-MP-isoP-G)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到其效力比单独ACV的效力高。
实施例21无环鸟苷二磷酸异亚丙基甘油的活性利用仅具有无环鸟苷二磷酸异亚丙基甘油(ACV-DP-isoP-G)作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到其效力比单独ACV的效力高。
实施例22无环鸟苷磷酸亚甲基二膦酸和无环鸟苷三磷酸的活性分别利用仅具有ACV-磷酸亚甲基二膦酸和无环鸟苷三磷酸作为无环鸟苷衍生物的制剂重复实施例12的过程。观察到它们的效力比单独ACV的效力高。
实施例23无环鸟苷一磷酸及其盐的溶解性如下测试无环鸟苷一磷酸的各种盐的溶解性在三个10mL的烧杯中各加入2mL蒸馏水，每个烧杯都有磁性搅拌棒。在每一个烧瓶中，加入选自钾、钠、钠/铵和H+(游离酸)的无环鸟苷一磷酸盐直到形成饱和溶液。将每份饱和盐溶液重力过滤。将无环鸟苷一磷酸钠/铵和游离酸盐溶液通过Whatman No.4滤纸过滤，得到澄清溶液。钾和钠盐溶液通过Whatman No.1滤纸过滤，得到微乳色溶液。
利用移液管将饱和盐溶液各1mL转移到事先称重的圆底烧瓶中，然后将溶液干燥。当所有液体蒸发后，将圆底烧瓶再次称重，由此容易地得出每毫升中无环鸟苷一磷酸盐的毫克数。
下表列出了如上所述制备的各种盐相对于无环鸟苷的溶解度表III
根据表III显示的结果可以得知通过形成无环鸟苷一磷酸的盐可急剧提高溶解度。其他核苷一磷酸也将显示出类似的提高的溶解性。因为盐的溶解度提高了，以这种方式就有可能配制含有大量无环鸟苷一磷酸的局部组合物。
权利要求
1.一种抗病毒核苷类似物磷酸酯，其选自抗病毒核苷类似物硫代磷酸酯、核苷类似物氨基磷酸酯和核苷类似物氟化磷酸酯。
2.一种抗病毒核苷类似物磷酸酯，其选自1，2-μ-亚甲基-核苷类似物二磷酸酯；2，3-μ-亚甲基-核苷类似物三磷酸酯；1，2-μ-硫代-核苷类似物二磷酸酯；和2，3-μ-硫代-核苷类似物三磷酸酯。
3.一种按照权利要求1或2的化合物，其中抗病毒核苷类似物是无环鸟苷，即9-(2-羟基乙氧甲基)-鸟嘌呤。
4.一种药物组合物，包含抗病毒有效量的按照权利要求1-3中任一项所述的抗疱疹核苷类似物磷酸酯或其药学上可接受的盐，或其混合物，该物质处于局部使用的药学上可接受的载体中。
5.权利要求4的组合物，其中所述核苷类似物磷酸酯选自核苷类似物硫代磷酸酯、核苷类似物氨基磷酸酯和核苷类似物氟化磷酸酯。
6.按照权利要求4的组合物，其中所述核苷类似物磷酸酯选自1，2-μ-亚甲基-核苷类似物二磷酸酯；2，3-μ-亚甲基-核苷类似物三磷酸酯；1，2-μ-硫代-核苷类似物二磷酸酯；和2，3-μ-硫代-核苷类似物三磷酸酯。
7.权利要求4-6的组合物，其中所述核苷类似物是无环鸟苷。
8.按照权利要求4-6中任一项的组合物，其中所述核苷类似物磷酸酯是无环鸟苷一磷酸。
9.按照权利要求4-6中任一项的组合物，其中所述核苷类似物磷酸酯是无环鸟苷二磷酸。
10.按照权利要求4-6中任一项的组合物，其中所述核苷类似物磷酸酯是无环鸟苷三磷酸。
11.权利要求4-6中任一项的制剂，其中所述抗疱疹核苷类似物选自1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-E-5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶；2′-氟碳环-2′-脱氧鸟苷；6′-氟碳环-2′-脱氧鸟苷；1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5(E)-(2-碘乙烯基)尿嘧啶；(1r-1α，2β，3α)-2-氨基-9-(2，3-双(羟甲基)环丁基)-6H-嘌呤-6-酮；9H-嘌呤-2-胺，9-((2-(1-甲基乙氧基)-1-((1-甲基乙氧基)甲基)乙氧基)甲基)-(9C1)；三氟胸苷；9-〔(1，3-二羟基-2-丙氧基)甲基〕鸟嘌呤；5-乙基-2′-脱氧尿苷；E-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷；5-(2-氯乙基)-2′-脱氧尿苷；1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC)；1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿苷(FIAU)；布昔洛韦；6-脱氧无环鸟苷；9-(4-羟基-3-羟甲基丁-1-基)鸟嘌呤；E-5-(2-碘乙烯基)-2′-脱氧尿苷；5-乙烯基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶；1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶；2′-去甲-2′-脱氧鸟苷；9-(4-羟基-3-羟甲基丁-1-基)鸟嘌呤；1-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤。
12.一种按照权利要求4-6中任一项的组合物，其中核苷类似物磷酸酯是药学上可接受的盐形式。
13.一种按照权利要求11的组合物，其中盐选自钠、钾、铵和氢盐。
14.一种按照权利要求4-6中任一项的组合物，其中药物载体选自含水乳膏和聚乙二醇。
15.一种局部施用疱疹病毒感染动物的皮肤或粘膜损害的方法，包括在损害部位治疗有效量的组合物，该组合物含有有效量的按照权利要求4-6中任一项的抗病毒核苷类似物。
16.一种按照权利要求15的方法，其中核苷类似物磷酸酯是无环鸟苷一磷酸。
17.一种按照权利要求15的方法，其中所述核苷类似物磷酸酯是无环鸟苷二磷酸。
18.一种按照权利要求15的方法，其中所述核苷类似物磷酸酯是无环鸟苷三磷酸。
19.一种治疗疱疹病毒感染的方法，其中该疱疹病毒由于编码胸苷激酶的病毒基因改变或缺失而对一种或多种抗病毒化合物产生了抵抗性，所述的方法包括在动物的疱疹病毒感染的皮肤或粘膜组织处施用有效量的抗疱疹病毒核苷类似物磷酸酯，药学上可接受的抗疱疹病毒核苷类似物磷酸酯盐，或其混合物，它们处于适合局部使用的药物载体中。
20.一种按照权利要求15的方法，其中所述动物为人。
21.一种按照权利要求15的方法，其中所述感染是由于无环鸟苷抗性疱疹病毒菌株引起的。
22.一种按照权利要求15的方法，其中所述病毒的所述无环鸟苷抗性是由于编码胸苷激酶的病毒基因改变或缺失而引起的。
23.一种治疗动物疱疹病毒感染的方法，包括在动物受影响的皮肤或粘膜损害处局部应用含有抗病毒有效量的无环鸟苷三磷酸的组合物。
全文摘要
用于疱疹病毒感染的局部用组合物,包含抗疱疹核苷类似物磷酸酯如无环鸟苷一磷酸、无环鸟苷二磷酸和无环鸟苷三磷酸,它们对疱疹病毒的天然菌株以及对抗性菌株显示出增强的活性,特别是对病毒的胸苷激酶阴性菌株。抗疱疹核苷类似物磷酸酯包括氨基磷酸酯和硫代磷酸酯,以及包含C和S桥原子的多磷酸酯。
文档编号A61K31/7064GK1192138SQ96195922
公开日1998年9月2日 申请日期1996年6月6日 优先权日1995年6月7日
发明者卡尔Y·霍斯泰特勒 申请人:卡尔Y·霍斯泰特勒