专利名称：基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽及其合成和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生化技术领域，涉及ー种基于阿片肽和神经肽FF而构建的嵌合肽及其合成方法；本发明同时还涉及该嵌合肽在高效、低副作用镇痛药物制备中的应用。
背景技术：
疼痛是人类所经受的最常见的病症之一，每个人的一生都会经历疼痛的困扰。据统计全球大约有1/3的人忍受着持续或周期性疼痛的折磨，美国在疼痛相关社会问题的花费约为 I 千亿美元/年(/"roc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 2001，98: 11845)。在临床上，吗啡类的阿片药物已被人们广泛的应用于治疗和缓解各种疼痛，但由于阿片类的镇痛药物能引起严重的耐受、成瘾、便秘和呼吸抑制等不良反应，从而大大限制了其临床应用范围。
已有的研究结果表明，机体内的阿片肽同样也能通过激活阿片受体而介导镇痛作用。为了获得选择性高、高效、分子较为稳定的阿片类配体分子，在脑啡肽等阿片肽的结构基础上通过化学修饰并筛选出了大量的高效配体。Lipkowski等人以脑啡肽为化学模板分子，通过2位氨基酸定点替换、肽链C末端肼键连接实现了分子ニ聚化，成功构建了ー个高效的阿片肽 Biphalin，其化学结构为(TyrjAla-Gly-Phe-NH)2 (.Peptides 1982，3:697 ；Life Sci 1987，40:2283)。进ー步的药理学活性研究表明，Biphalin在中枢和腹腔注射时都能引起强镇痛作用，特别是侧脑室注射时其镇痛強度为吗啡的257倍，并且腹腔注射Biphalin 引起的成瘾戒断反应较小(プ Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 265:1446)。因此，Biphalin在低副作用的阿片类镇痛药的研发中具有较好的应用前景。众所周知，神经肽在机体内都能介导ー种或多种主要的生理和药理学活性。但是，神经肽在发挥其主要活性的同时也伴随着ー些次要活性，而大部分次要活性成为了它的副作用。例如，内源性阿片肽在缓解疼痛的同时，会伴随着耐受、成瘾和呼吸抑制等副作用。为了解决这ー矛盾问题，传统的策略是以神经肽的母体为化学模板，进行了系统的化学修饰而筛选出受体选择性较高且具有优势构象的神经肽类似物，从而达到保持较高生物活性并降低其副作用的预期效果。近年来还发展了ー些新策略，即基于高效的肽类配体设计并合成了一系列嵌合肽，以期使嵌合肽在发挥主要活性的同时，能最大限度的降低其副作用。尤其是，Foran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物质(SP)而成功地设计构建了一种全新的杂合肽ESP7(Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met- NH2),并且发现脊髓水平注射ESP7能产生阿片受体依赖的镇痛作用，但又不产生镇痛耐受的阿片样副作用O0Toa Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000，97:7621)。神经肽FF最早是作为ー种抗阿片肽从牛脑中被分离和鉴定的，并发现它具有抗吗啡镇痛的作用GdTOC. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 1985，82:7757)。神经肽FF系统涉及到两种不同的受体前体(Pro-NPFFA和Pro_NPFFB受体)和两种不同受体(NPFF1和NPFF2受体)(.FEBS Lett. 1997，409:426 -Mol. Pharmacol. 1999，55:804 -,Nat. Cell Biol. 2000，2: 703 J. Biol. Chem. 2001，276:36961 J. Biol. Chem. 2000，275:25965 J. Biol.Chem. 2000，275:39324等)。近年的药理学活性鉴定表明，NPFF及其相关肽能介导多种生物学活性，NPFF不仅具有抗阿片的功能，还具有原阿片活性，从而被归为ー类重要的阿片调节肽(β/rr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341 )。NPFF自身对基础痛阈值无影响，即在生理剂量水平对机体的生物学活性影响不大。但NPFF作为阿片调节肽，在維持机体的内源性阿片和抗阿片系统平衡过程中起着重要作用，它參与了镇痛耐受的调节，井能减弱吗啡等阿片物质所引起的条件位置偏爱作用(β/rr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341 -,Peptides.2006，27:964 -,Peptides. 2007，28:2235 -,Peptides. 2010，31:1374 等)。因此，NPFF 的药理学功能使其适合作为化学模板分子来发展ー类全新的阿片/NPFF系统的嵌合肽。中专利申请201110097843. 4公开了ー种基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽，其在保留内吗啡肽2的N末端结构和神经肽FF的C末端结构基础上，利用内吗啡肽2的C末端和神经肽FF的N末端中都存在的苯丙氨酸残基的特点而构建的一种全新的嵌合肽EN-Q0体内的药理学研究发现EN-9表现出比内吗啡肽2更强、更持续的镇痛活性，并具有无耐受作用、低成瘾性等优点。此外，化合物EN-9皮下EN-9能引起显著的镇痛作用，能克服内吗啡肽外周注射无镇痛活性的缺陷，从而具有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。但是，EN-9的镇痛活性比临床用镇痛药吗啡低4-10倍，从而导致其有效镇痛剂量高于吗啡。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供ー种镇痛效果好、副作用低的基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9。本发明的另一目的是提供一种基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9的合成方法。本发明还有ー个目的，就是提供该基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9在制备镇痛药物中的应用。(一)基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽
本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽(BN-9)，是以高效阿片肽Biphalin和神经肽FF为化学模板，构建的嵌合肽，其N末端为阿片肽“药效团”(即半个分子的Biphalin)，C末端为NPFF “药效团”(即NPFF的C端五肽结构，NPFF (3_8))，其结构式如下
权利要求
1.一种基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽，其结构式如下
2.如权利要求I所述基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的合成方法，包括以下エ艺步骤 (1)树脂预处理将Rink-Amide-MBHA树脂在ニ氯甲烷中搅拌30-40min,使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂； (2)脱除Fmoc保护将溶胀、抽干溶剂后的树脂在体积浓度18-25%的六氢吡啶/DMF溶液中，搅拌3-10min后抽干，重复2_3次；再加入体积浓度18-25%的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌10-15min，使Fmoc基团脱除完全，然后抽干溶剂；最后用DMF洗涤除净六氢吡啶，得到脱除Fmoc基团保护的树脂； (3)缩合依次将#-a-Fmoc保护基团氨基酸、#-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入ニ异丙基こ胺后混匀得混合溶液；然后在氩气保护下，将脱除Fmoc基团保护的树脂加入所述混合溶液中搅拌反应40-60min,抽干溶剂；用DMF重复洗涤除去未反应的#- a -Fmoc保护基团氨基酸、#-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N, N，N’，が-四甲基脲-六氟磷酸盐； 所述N- a -Fmoc保护基团氨基酸、#-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N, N, N、が-四甲基脲-六氟磷酸盐的用量分别为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2-5倍； 所述ニ异丙基こ胺的用量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的4-10倍； (4)肽链的延长重复步骤(2)、(3)8次，按照嵌合肽结构由C-末端向N-末端的顺序，依次将带有#-a -Fmoc保护基团氨基酸逐个缩合至树脂上，直至完成所有氨基酸残基的缩合，得到肽树脂； (5)肽链从树脂上的切割按照步骤(2)的方法将肽树脂最后ー个氨基酸的Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入10_25ml的切割齐U，于室温下切割反应I. 5-5小时；过滤，滤液在不高于37°C的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10°C的こ醚中析出沉淀；静置后先去除上清的こ醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去こ醚相，水相经冷冻干燥，得白色粗肽固体粉末； (6)粗肽的脱盐和纯化以体积浓度10-20%的こ酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末。
3.如权利要求I所述基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的合成方法，其特征在于步骤(5)所述切割剂是由三氟こ酸、三异丙基硅烷、水以95:2. 5:2. 5的体积比混合形成的溶剤。
4.如权利要求I所述基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽，该嵌合肽是以高效的阿片肽Biphalin和神经肽FF为化学模板，在保留阿片高效激动剂和神经肽FF“关键药效团”的基础上构建而成。体内痛觉调节、耐受和胃肠运动等一系列的药理学实验表明本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9表现出比吗啡更强的中枢镇痛活性，并具有无镇痛耐受、对胃肠运动影响小等优点，有效克服了阿片类镇痛药物普遍存在的耐受和便秘等副作用问题。此外，侧脑室注射BN-9能显著地抑制福尔马林所引起的急性痛和炎症痛，且镇痛作用稍强于吗啡，因此该嵌合肽BN-9制备临床镇痛药物方面具有潜在的应用价值。
文档编号C07K1/06GK102850431SQ20121009883
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者王锐, 方泉, 韩政岚, 王子龙, 李宁 申请人:兰州大学