专利名称：基于内吗啡肽2和神经肽ff的嵌合肽及其合成和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生化技术领域，涉及一种基于内吗啡肽2和神经肽FF而构建的嵌合肽及其合成方法；本发明同时还涉及该嵌合肽在制备镇痛药物中的应用。
背景技术：
在临床上，吗啡类的阿片药物已被人们广泛的应用于治疗和缓解各种疼痛，但是由于阿片类的镇痛药能引起严重的不良反应和阿片依赖作用，而大大限制其在临床治疗中的应用。已有的研究表明哺乳动物中枢和外周都广泛存在着阿片受体。1997年， 发现内吗啡肽(endomorphins，EMs),即内吗啡肽 1 (EM-1，Tyr-Pro- Trp-Phe-NH2)和 2 (EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)为μ阿片受体(MOR)内源性的高效选择性的激动剂，它们对 μ 阿片受体的 Ki 分别为 360 ρΜ Π 690 pM (.Nature. 1997，386:499; Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999;897:136)。它们的性能类似于吗啡，能参与体内多种生理功能的调节， 尤其是痛觉调节，因此被视为潜在的可替代吗啡的深层次镇痛药物C/卯.J. Pharmacol. 1998，78337 -,Brain Res. 2000，881:1 -J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999，291:12; Pharmacol. Rev. 2007, 59:88等)。内吗啡肽为μ -阿片受体的高效选择性激动剂，能介导明显的镇痛活性。已有研究发现中枢注射EM-I和ΕΜ-2在CPP实验中表现出完全相反的结果，即分别引起环境的偏爱和厌恶O； Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309:816 ； Neurosci. Lett. 2004，365:157等)。因此EM-2比EM-I具有更低的药物成瘾性。1985 年，神经肽 FF (NPFF, Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2)作为一种抗阿片肽而从牛脑中被分离和鉴定，并发现它具有抗吗啡镇痛的作用Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1985，82:7757)。随后的研究表明，神经肽FF系统涉及到两种不同的受体前体(Pro-NPFFA 和 NPFI7b 受体)和两种不同受体(NPFF1 和 NPFF2 受体)QFEBS Lett. 1997， 409426 -MoL Pharmacol. 1999，55:804 -,Nat. Cell Biol. 2000，2: 703 -J. Biol. Chem. 2001，276:36961 -J. Biol. Chem. 2000，275:25965 -J. Biol. Chem. 2000， 275:393 等)。大量的研究结果表明，NPFF及其相关肽能介导多种生物学活性，即在痛觉、 心血管活性、体温、胃肠道活动、摄食、内分泌、阿片耐受和依赖等方面具有一定的调节作用，特别是对阿片类物质所引起的镇痛、耐受和成瘾都具有重要的影响(/ ; Neurobiol. 1996，48:461 -,Eur. J. Pharmacol. 1998，345 (1) 1 -,Curr. Top. Med. Chem. 2005， 5:341 等)。众所周知，内源性的神经肽在机体内都能介导一种或多种主要的生理和药理学活性。但是，神经肽在发挥其主要活性的同时，经常伴随着产生了其次要活性，而这些次要活性就成为了它的副作用。比如，阿片肽在缓解疼痛的同时，会伴随着耐受、成瘾和呼吸抑制等副作用的出现。为了解决这一矛盾，传统的研究策略是以神经肽的母体为化学模板，来进行系统的化学修饰而筛选出受体选择性较高且具有优势构象的神经肽类似物，从而达到保持较高生物活性并降低其副作用的预期效果。近年来还发展了一些新策略，基于内源性神经肽设计并构建了一系列杂合肽并对其进行了研究，以期使嵌合肽能够在发挥主要活性的同时，最大限度的减少其副作用的出现。尤其是，Foran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物质(SP )而成功地设计构建了一类全新的杂合肽ESP7 (Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) ，并且发现脊髓水平注射ESP7能产生阿片受体依赖的镇痛作用，但又不产生镇痛耐受现象的副作用(/"roc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 2000，97:7621)。 近年的药理学活性鉴定表明，NPFF不仅具有抗阿片的功能，还具有原阿片活性，从而被归为一类重要的阿片调节肽(β/rr. Top. Med. Chem. 2005, 5341 )。NPFF自身对基础痛阈值无影响，即在生理剂量水平对机体的生物学活性影响不大。但NPFF作为阿片调节肽之一，在维持机体的内源性阿片和抗阿片系统平衡过程中起着重要作用，参与了镇痛耐受的调节，并能减弱吗啡等阿片物质所引起的条件位置偏爱作用(β/rr. Top. Med. Chem. 2005，5:341 -,Peptides. 2006, 27:964 -,Peptides. 2007, 28:2235 -,Peptides. 2010， 31:1374等)。因此，NPFF的药理学特性使其适合作为化学模板分子来发展成一类全新的阿片类嵌合肽。
发明内容
本发明的目的是针对吗啡等阿片类镇痛药物在临床应用中具有阿片依赖和成瘾等副作用，提供一种基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽。本发明的另一目的是提供一种合成基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽的方法。本发明还有一个目的，就是提供该嵌合肽在制备镇痛药物中的应用。(一)基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽
本发明基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽，基于内吗啡肽2和神经肽FF而构建的， 其N末端和C末端分别为内吗啡肽-2和神经肽FF (3-8)的结构，其结构式如下
权利要求
1.基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽，其结构式
2.如权利要求1所述基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽的制备方法，包括以下工艺步骤(1)树脂预处理将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌30-40min,使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；(2)脱除Fmoc基团保护使溶胀、抽干溶剂后的树脂在体积浓度20-22%的六氢吡啶 DMF溶液中，搅拌3-5min后抽干，重复2_3次；再加入到体积浓度20-22%的六氢吡啶DMF 溶液，搅拌10-15min，使Fmoc基团脱除完全，然后抽干溶剂；最后用DMF洗涤除净六氢吡啶；(3)缩合依次将24eq的α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、0_苯并三氮唑-N，N，N',舻-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入4_8eq的二异丙基乙胺后混勻混合溶液；然后在氩气保护下使脱除Fmoc基团保护的树脂在上述混合溶液中搅拌反应50-60min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤除去未反应的α -Fmoc保护基团氨基酸、 N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N，N, N',舻-四甲基脲-六氟磷酸盐；(4)肽链的延长重复步骤(2)、(3)，依次将带有α-Fmoc保护基团氨基酸逐个缩合至树脂上，直至完成所有氨基酸残基的缩合，得到肽树脂；(5)肽链从树脂上的切割肽链缩合全部完成后，按照步骤(2)的方法将肽树脂最后一个氨基酸的Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15-20ml的切割剂，于室温下切割反应2-3小时；过滤，滤液在不高于37°C的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10°C的乙醚析出沉淀；静置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相，合并水相，冷冻干燥得白色的粗肽固体粉末；(6)粗肽的脱盐和纯化以体积浓度15-20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽过kphadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末。
3.如权利要求1所述基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽的制备方法，其特征在于 步骤(5)所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2. 5:2. 5的体积比混合形成的溶剂。
4.如权利要求1所述基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽在制备镇痛药的应用。
全文摘要
本发明提供了一种基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽，其在保留内吗啡肽2的N末端结构和神经肽FF的C末端结构基础上，利用内吗啡肽2的C末端和神经肽FF的N末端中都存在的苯丙氨酸残基的特点而构建的一种全新的嵌合肽EN-9。体内的药理学研究发现EN-9表现出比内吗啡肽2更强、更持续的镇痛活性，并具有无耐受作用、低成瘾性等优点。此外，化合物EN-9皮下EN-9能引起显著的镇痛作用，能克服内吗啡肽外周注射无镇痛活性的缺陷，从而具有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。
文档编号C07K1/06GK102206285SQ20111009784
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者方泉, 李宁, 王锐, 韩政岚 申请人:兰州大学