专利名称：一种提高寡核苷酸链Tm值的核苷酸单体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核苷酸单体，尤其涉及一种带有MGB的核苷酸单体，将这种带有 MGB的核苷酸单体(DQ)应用于寡核苷酸的合成，可以提高寡核苷酸链Tm值；此外，本发明还涉及该核苷酸单体的制造方法及其在分子生物学等领域的应用。
背景技术：
实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。目前有下面几种常用的荧光定量方法=TaqMan探针、Beacon探针、FRET技术等。 MGB探针是在TaqMan探针基础上研发的一种探针修饰方法，该探针是指带有一个小沟结合物基团的DNA探针，它可与单链的靶DNA形成极为稳定的异源双链，同时这种探针相对于通常的探针序列更短一些。MGB探针是在原有设计的寡核苷酸探针的基础上在其5'或3'连接上一个化学基团一二氢环化吲哚卟啉_三肽(DPI3)，DPI3可折叠进入由探针末端5 6bp核苷酸形成的小沟内。DPI3呈新月型，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，通过范德华力稳定其结构。无论是3' -MGB寡核苷酸探针还是5' -MGB寡核苷酸探针，都比没有MGB的寡核苷酸探针显示了更强的空间稳定性。同时5' -MGB寡核苷酸探针能够阻止引物的延伸，因此可以作为荧光定量PCR体系中的探针使用。研究表明，一般情况下，同MGB-寡核苷酸形成的错配异源双链其熔点温度比没有 MGB的寡核苷酸形成的双链熔点温度高，而且由于ΔΤπι(完全匹配的Tm值与错配的Tm值之差)由错配的位置和类型决定，在小沟结合区内形成的错配特别不稳定。比起通常的寡核苷酸探针，MGB寡核苷酸探针更容易辨认在MGB结合区形成的错配。同时分子分析表明， 与寡核苷酸探针3'连接的MGB可向探针的5'-末端滑行l_2bp，以便有更好的小沟结合位。MGB结构连接到12-18mer的寡核苷酸时，能显著增加异源双链的稳定性。据报道，Tm 值在66-70°C之间，而没有MGB的相同序列Tm值在44 56°C。探针越短，整体异源双链的稳定性越大。有研究表明，一个没有MGB的27mer寡核苷酸探针形成的异源双链的稳定性 (Tm = 650C )与有MGB的12mer寡核苷酸探针(Tm = 66°C )相同，从这12mer的寡核苷酸探针的序列中可以看出，富含A/T的3 ‘-末端附近的MGB配体对稳定性的作用等于在序列的5'-末端另加15个mer。目前的MGB探针是MGB结构连接在3’端的淬灭基团上，而且结构单一的使用了 DPI3，因次，目前的MGB探针不适合做多重荧光定量检测，另外针对不同基因设计的灵活性不够高，造成很多地方应用的局限性。DQ探针很好的解决了目前MGB的不足，我们可以使用不同的淬灭基团来淬灭不同波长的荧光报告基团，又可以在不同的位置同时修饰多个碱基分子，灵活的根据需要选择设计探针。另外DQ探针也可以用在PCR扩增、FISH杂交、芯片等，大大提高了 DQ探针的应用领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于利用化学修饰技术，提供一种能提高寡核苷酸链Tm值的新型核苷酸单体，以下简称DQ，将小沟结合物MGB通过共价连接到单个核苷酸的碱基上，从而提高被修饰的寡核苷酸链的Tm值。本发明要解决的技术问题之二在于提供所述的DQ的制备方法。本发明要解决的技术问题之三在于提供一种经小沟结合物MGB修饰的核酸片段。本发明要解决的技术问题之四在于提供所述的经过小沟结合物MGB修饰的核酸片段作为引物或TaqMan探针在荧光定量PCR检测中的应用。本发明的技术问题是通过如下的技术方案实现的。在本发明的一方面，提供一种提高寡核苷酸链Tm值的核苷酸单体，其结构如通式 (I)所示
权利要求
1.一种提高寡核苷酸链Tm值的核苷酸单体，其结构如通式(I)所示
2.如权利要求1所述的核苷酸单体，其特征在于，所述碱基Base为腺嘌呤或胸腺嘧啶。
3.如权利要求1所述的核苷酸单体，其特征在于，所述MGB为DPI2或DPI3。
4.如权利要求1所述的核苷酸单体，其特征在于，所述桥接部分bridge末端的活性基团与MGB共价连接，从而得到含有MGB的核苷酸单体。
5.如权利要求1所述的核苷酸单体，其特征在于，所述桥接部分bridge的末端活性基团是指丙烯酰胺，羧酸的活化酯，羟基，醛基，烷基卤化物，磺酸基，氨基，酸酐，苯胺，芳基卤化物，叠氮基，氮丙碇，硼酸盐，羧酸，碳二亚胺，重氮烷，环氧化合物，二醇，胼基，羟胺，亚胺碳酸酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，酮，马来酰亚胺，亚磷酰胺，氯磺酸，或者巯基。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的核苷酸单体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将MGB 溶解于有机物中，加入 amino-dT-C6、amino-dA_C6、amino-dG_C6、 amino-dC-C6或amino-dU_C6进行反应，经脱盐，酸化，经HPLC纯化得到化合物A ；(2)将化合物A用双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，四氮唑和DIPEA在干燥二氯甲烷中进行亚磷酰胺化反应，经过HPLC提纯制得核苷酸单体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机物包括DMF和NaHC03， 所述加入amino-dT-C6或amin0-dA-C6进行反应，反应温度为25V，反应时间为2小时；所述脱盐，酸化采用60% CF3C00H-H20在25°C反应30min。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述亚磷酰胺化的反应时间为 2h，反应温度为25°C。
9.一种经过小沟结合物MGB修饰的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段为标记有小沟结合物MGB的寡核苷酸链，其中经过小沟结合物MGB修饰的核苷酸单体的结构如权利要求1-5任一项所示。
10.如权利要求9所述的经过小沟结合物MGB修饰的核酸片段，其特征在于，所述小沟结合物MGB通过化学修饰共价连接在所述寡核苷酸的1个或几个碱基上。
11.如权利要求9或10所述的经过小沟结合物MGB修饰的核酸片段，其特征在于，所述寡核苷酸链的长度为10-18个碱基。
12.如权利要求9所述的经过小沟结合物MGB修饰的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段为TaqMan探针，所述寡核苷酸链的5'还标记有报告荧光基团，3'标记有不发光的淬灭基团。
13.如权利要求9-12任一项所述的经过小沟结合物MGB修饰的核酸片段作为引物或 TaqMan探针在荧光定量PCR检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种提高寡核苷酸链Tm值的核苷酸单体，其结构如通式(I)所示，其中，R1，R2为氢原子或羟基或通过氧原子相连形成锁核酸；碱基Base为嘌呤衍生物或嘧啶衍生物，该碱基为鸟嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶；碱基上带有桥接部分bridge，该桥接部分的末端带有活性基团与MGB相连，该桥接部分为中性脂肪链；MGB为小沟结合物。此外，本发明还公开了该核苷酸单体的制备方法和应用。将MGB通过化学修饰连接在单个核苷酸上，将经过修饰的单个核苷酸用于寡核苷酸的合成。本发明的核苷酸单体能够提高寡核苷酸链Tm值够高灵敏度，将该核苷酸单体连接到寡核苷酸的碱基上，可提高荧光定量PCR探针的特异性，可有效地对基因多态性位点进行准确甄别。
文档编号C07H21/04GK102219819SQ201110097470
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者方维佳, 李辉, 金大智 申请人:李辉, 浙江大学医学院附属第一医院, 浙江省疾病预防控制中心