一种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：(1)提取虾肌肉中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中所得峰面积代入标准曲线回归方程中计算得到样品中原肌球蛋白的浓度。本发明用毛细管电泳快速检测水产品过敏原——虾原肌球蛋白的方法，提取虾肌肉中的全蛋白，加入到阴离子交换层析柱中，用洗脱液洗脱，收集穿透峰对应的溶液，加入毛细管电泳仪中，通过毛细管区带电泳，对样品液中的虾原肌球蛋白进行定性和定量检测。
【专利说明】
一种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及过敏原检测技术领域，具体的说，是涉及一种虾原肌球蛋白的定性及 定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖业和国际贸易的发展，由水产品等食品过敏导致的疾病呈增多趋 势。全世界大约有30%~40%的疾病由过敏引起，且水产品过敏尤其严重。而虾类、蟹类等 甲壳类水产品中最主要过敏原是原肌球蛋白（tropomyosin，TM)。因此，建立一种快速简便 的原肌球蛋白检测方法可以预防和治疗水产品过敏疾病，从而有效减少水产品过敏发病 率。
[0003] 目前确定食品过敏原的检测方法主要有以下几种：
[0004] (1)利用抗原抗体特异性反应的原理进行检测，通常采用酶联免疫的方法，利用食 品过敏原抗体和过敏原进行特异性的结合，然后酶标记的二抗与过敏原形成复合物，利用 显色底物，通过颜色的深浅来判断食品中过敏原的含量；
[0005] (2)组胺释放实验，组胺释放实验主要是通过食品过敏原激发致敏的靶细胞，引起 细胞释放组胺，组胺含量可应用荧光测定法、放射免疫法等方法测定，与适宜参照进行比 较，确定组胺释放率阳性标准，从而进行过敏原活性测定及鉴定的一类方法；
[0006] (3)过敏原指纹图谱快速检测方法，在食物总蛋白双向电泳指纹图谱的基础上，对 总蛋白双向电泳图谱上的单个点进行了飞行质谱分析，以飞行质谱图谱的分子量峰和图谱 形状为基本参数来鉴定特征性的蛋白点。
[0007] 目前这些方法普遍存在检测速度慢，操作复杂繁琐，灵敏度、精确度不高的问题。
【发明内容】
[0008] 针对上述问题，本发明提供一种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法， 快速、准确、灵敏的定性及定量检测虾原肌球蛋白。
[0009] -种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)提取虾肌肉中的全蛋白并溶于pH为7~8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交 换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；
[0011] (2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中虾原肌球蛋白对 应的峰面积代入虾原肌球蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品中虾原肌球蛋白的浓 度。
[0012] 本发明用毛细管电泳快速检测水产品过敏原一一虾原肌球蛋白的，属于过敏原检 测技术领域，用于对虾原肌球蛋白进行定性和定量检测。提取虾肌肉中的全蛋白，加入到阴 离子交换层析柱中，用洗脱液洗脱，收集穿透峰对应的溶液，加入毛细管电泳仪中，通过毛 细管区带电泳，对样品液中的虾原肌球蛋白进行定性和定量检测。本发明所采用的毛细管 电泳法分析速度更高，分离度更好，准确度和灵敏度更高，能快速、准确的定性和定量检测 虾原肌球蛋白
[0013]本发明的步骤(1)中：
[0014]优选地，虾肌肉中的全蛋白采用试剂盒提取。
[0015] 所述试剂盒为凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司）。
[0016] 优选地，所述平衡缓冲液为pH为7.3~7.6的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的 浓度为5~10mm 〇l/L。进一步优选地，所述平衡缓冲液为pH为7.5的tris-HCl溶液，所述 tris-HCl溶液的浓度为10mmol/L。
[0017] 优选地，阴离子交换层析柱中所用填料为DEAE-Sepharose Fast Flow。
[0018] 优选地，洗脱液为0. l-0.2mol/L的NaCl溶液。
[0019]优选地，溶有全蛋白的平衡缓冲液以0.3~0.6ml/min的流速加入阴离子交换层析 柱中，洗脱液以0.8~1.2ml/min的速度洗脱层析柱，进一步优选地，溶有全蛋白的平衡缓冲 液以〇.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱。
[0020] 进行蛋白分离前以1.5ml/min的流速加入3~5倍柱体积的平衡缓冲液以平衡层析 柱。
[0021] 虾为南美白对虾。
[0022]本发明的步骤(2)中：
[0023]电泳条件为:毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为210~220nm，进样方式 为压力进样，分离电压为15±11^，毛细管柱温为25±1°(：，运行缓冲液为?!19.0~9.2的硼砂 缓冲溶液。
[0024] 优选地，电泳条件为:毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为214nm，进样方 式为压力进样(〇.5psi，5s)，分离电压为15kv，毛细管柱温为25°C，运行缓冲液为pH9.2且浓 度为25mmol/L的硼砂缓冲溶液。
[0025] 标准曲线线性回归方程的制作方法如下：精密配制虾原肌球蛋白标准溶液5yg/ mL、10yg/mL、25yg/mL、50yg/mL、100yg/mL，按步骤(2)中电泳条件进样，每个样品重复3次， 以峰面积对浓度进行线性回归，得标准曲线线性回归方程。
[0026] 毛细管的预处理:选用未涂层石英毛细管柱(45cmX75ym，P/ACE? MDQ System， Beckman公司），新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10~12min，蒸馏水冲洗5~6min，0.1M NaOH 溶液冲洗30~35min，蒸馏水冲洗5~6min，最后再用运行缓冲液冲洗10~12min;进样前依 次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2~3min。
[0027] 进一步地，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1M NaOH溶液 冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min;进样前依次用蒸馏水及运行 缓冲液各冲2min。
[0028] 毛细管电泳在食品过敏原检测方面的应用并不广泛，尤其在水产品过敏原的检测 中，目前还没有可行的方法。这是由于水产品中蛋白成分比较复杂，从而对水产品中某一过 敏原的检测产生干扰，而毛细管电泳检测要求样品中的成分尽可能的简单。因此，需要发展 简单、快速、有效的样品前处理方法，使其适合毛细管电泳对样品的要求。
[0029] 本发明提供了一种简单、快速的样品前处理方法。首先是利用试剂盒将水产品中 的全蛋白提取出来，再采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析的方法将目的过敏原与其他蛋 白分离，使样品成分单一，适合毛细管电泳对样品的要求；同时，本发明还对毛细管电泳的 条件进行优化，实现了对样品中原肌球蛋白含量的测定。
[0030] 在前处理的优化条件与毛细管电泳优化条件的组合下，检测更快速、灵敏度和精 确度更高。
[0031] 与现有检测方法相比，本发明的有益效果如下：
[0032] 本发明用所建立的定性和定量分析虾原肌球蛋白的方法，未见文献报道，为快速、 准确的检测虾原肌球蛋白提供新的依据。本发明所采用的毛细管电泳法分析速度更高，分 离度更好，准确度和灵敏度更高，能快速、准确的定性和定量检测虾原肌球蛋白。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 1.样品的制备
[0035] 使用试剂盒提取虾肌肉中的全蛋白，将虾全蛋白溶于PH7.5的平衡缓冲液中得到 样品液。以1.5 m 1 / m i η的流速加入3~5倍柱体积的平衡液，平衡层析柱，再将样品液以 0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，然后用0.1~0.2mol/L的NaCl洗脱液以1.0ml/ min的速度洗脱层析柱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品。
[0036] 2.毛细管电泳分析条件优化
[0037] (1)毛细管选择及预处理:选用未涂层石英毛细管柱，新毛细管柱先依次用甲醇冲 洗lOmin，蒸馏水冲洗5min，0.1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲 液冲洗lOmin;进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min;
[0038] (2)毛细管电泳分析条件:检测波长是214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)， 分离电压为15kv，毛细管柱温25°C;运行缓冲液是25mmol/L硼砂缓冲溶液(pH=9.2)。
[0039] 3.标准曲线的建立:精密配制虾原肌球蛋白标准溶液5、10、25、50、100yg/mL进样， 每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，回归方程为Y = 0.060+0.087x，相关系数 R2 = 0.999,在5-100yg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.1yg/mL(S/N> 3)〇
[0040] 4.回收率测定和精密度测定:按样品的处理方法(不加底物），取5、10、25、50、100μ g/mL浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表1)。
[0041] 表1虾原肌球蛋白添加回收率和精密度测定(n = 6)
[0043] 由表1的结果可知，在5-100yg/mL浓度添加范围内，回收率>95%，RSD〈6%，在蛋白 质大分子的检测中，是可以被接受的。
[0044] 实施例2
[0045] 1.样品的制备
[0046]使用试剂盒提取虾肌肉中的全蛋白，将虾全蛋白溶于PH7.5的平衡缓冲液中得到 样品液。以1.5 m 1 / m i η的流速加入3~5倍柱体积的平衡液，平衡层析柱，再将样品液以 0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，然后用0.1~0.2mol/L的NaCl洗脱液以1.0ml/ min的速度洗脱层析柱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品。
[0047] 2.毛细管电泳分析条件优化
[0048] (1)毛细管选择及预处理:选用未涂层石英毛细管柱，新毛细管柱先依次用甲醇冲 洗lOmin，蒸馏水冲洗5min，0.1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲 液冲洗lOmin;进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min;
[0049] (2)毛细管电泳分析条件:检测波长是214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)， 分离电压为15kv，毛细管柱温25°C;运行缓冲液是30mmol/L硼砂缓冲溶液(pH=9.3)。
[0050] 3.标准曲线的建立:精密配制虾原肌球蛋白标准溶液5、10、25、50、100yg/mL进样， 每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，回归方程为Y=l. 26+0.0487x，相关系数 R2 = 0.999,在5-100yg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.1yg/mL(S/N> 3〇
[00511 4.回收率测定和精密度测定:按样品的处理方法(不加底物），取5、10、25、50、100μ g/mL浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表2)。
[0052]表2虾原肌球蛋白添加回收率和精密度测定(n = 6)
[0054] 由表2的结果可知，在5-100yg/mL浓度添加范围内，回收率>95%，RSD〈6%，在蛋白 质大分子的检测中，是可以被接受的。
[0055] 以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于 此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专 利范围之中。
【主权项】
1. 一种利用毛细管电泳快速检测虾原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取虾肌肉中的全蛋白并溶于pH为7~8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层 析柱中，NaCl溶液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品； (2) 将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中虾原肌球蛋白对应的 峰面积代入虾原肌球蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品中虾原肌球蛋白的浓度。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中电泳条件为:毛细管选用未涂层石 英毛细管柱，检测波长为210~220nm，进样方式为压力进样，分离电压为15±lkv，毛细管柱 温为25± 1°C，运行缓冲液为pH9.0~9.2的硼砂缓冲溶液。3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中电泳条件为:毛细管选用未涂层石 英毛细管柱，检测波长为214nm，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为5s，分离 电压为15kv，毛细管柱温为25°C，运行缓冲液为pH9.2且浓度为25mmol/L的硼砂缓冲溶液。4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，标准曲线线性回归方程的制作方法如下：精 密配制奸原肌球蛋白标准溶液5yg/mL、1 Oyg/mL、25yg/mL、50yg/mL、100yg/mL，按步骤（2)中 电泳条件进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，得标准曲线线性回归方 程。5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为0.1-0.2mol/L。6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为pH为7.3~7.6的tris-HCl 溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为5~10mm〇l/L。7. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为pH为7.5的tris-HCl溶液， 所述tr i s -HC1溶液的浓度为1 Ommo 1 /L。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，虾肌肉中的全蛋白采用试剂盒提取。9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，阴离子交换层析柱中所用填料为DEAE-Sepharose Fast Flow。10. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，虾为南美白对虾。
【文档编号】G01N27/447GK105865886SQ201610236413
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】傅玲琳, 王彦波, 赵淑淑
【申请人】浙江工商大学