一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物芯片领域，具体涉及表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用。所述的表面等离子体共振免疫传感芯片是通过在固相载体固定虾原肌球蛋白、虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水或虾原肌球蛋白单克隆抗体作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，芯片活化后在生物芯片上固定探针得到的；该生物芯片可应用于虾原肌球蛋白单克隆抗体或检测虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水的检测和过敏原（虾原肌球蛋白）的检测，具有操作简便、快速、灵敏度高、不需要标记、成本低、设备简单、对环境无污染等优点，有望实现大量样品的现场实时检测。
【专利说明】一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]二十世纪九十年代,人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)和分子生物学相关学科的发展为生物芯片、基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。生物芯片(biochip)是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程固着于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。蛋白质芯片(proteinchip)是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质固定在微型载体上获得，芯片上的探针构成为蛋白质或芯片作用对象为蛋白质者统称为蛋白质芯片。
[0003]尽管生物芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多问题，例如技术成本昂贵、操作复杂、重复性差、分析范围较狭窄、通常需要放射性元素标记或者荧光标记等。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等方面。荧光法是目前使用最多的标记方法，灵敏度不高，需要避光，用于检测结果的激光扫描仪价格昂贵。同位素标记法需要同位素和放射自显影，使用不便，操作复杂，耗时，有严重的污染。本发明不需要标记，可解决荧光标记和放射性元素标记对环境有污染的问题，同时样品处理简单，检测时间短，操作简便。
[0004]全世界约有30%?40%的人患有各种各样的过敏疾病。食品过敏反应是机体受同一抗原再次刺激后，表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，临床表现包括荨麻疹、疱疹样皮炎、口腔过敏综合症、肠病综合症、哮喘及过敏性鼻炎等，甚至会引起过敏性休克，严重影响患者的生活质量。食物过敏是涉及食品安全的重要问题，海产品是其中重要的一类。虾及其制品味道鲜美，营养丰富，但具有较高的致敏性，是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一，过敏病人中约有20%对虾过敏，小儿发病率高达60%，严重影响人们的生活质量。世界各地都出产虾，产量丰富，随着水产品贸易的全球化，水产品的过敏原问题受到广泛关注，美国食品药品管理局(FDA)、欧洲食品安全局(EFSA)、日本和中国香港都先后针对食品中的过敏原成分制定了相应的法规。很多国家对进口食品过敏原标签的要求越来越严格，食品中过敏原的检测已成为新的食品国际贸易技术壁垒。因此食品中过敏原的检测与安全评价已成为食品安全研究领域一个重要的课题。因此，虾过敏原的检测、过敏反应的研究、抗过敏药物的研制是急需研究的课题。为现场检测食品中虾过敏原、检测临床上血清中虾过敏原，研究特异、灵敏、快捷地的方法意义重大。
[0005]过敏原(anaphylactogen)又称为变应原,是能诱导I型超敏反应的抗原；过敏反应，又称变态反应，是异常、有害、病理性的免疫反应。虾过敏属于I型过敏反应，其机理是过敏原进入机体后，诱发能合成IgE的B细胞产生特异性IgE，IgE与肥大细胞、嗜碱性颗粒细胞结合成为致敏靶细胞。IgE—旦与靶细胞结合，机体就会呈现致敏状态。当机体再次接触同样的过敏原刺激时，再次进入的相同过敏原与已经结合的靶细胞上的IgE结合发生特异性反应，引起水肿、哮喘、荨麻疹、腹泻等过敏症状，伴随着患者血清IgE水平升高。目前国内对过敏性疾病的实验诊断，主要采用过敏原检测和特异性IgE、IgG检测法，检测试剂主要依赖进口，检测费用较高。同时，食品中过敏原的检测与安全评价是食品安全领域的重要课题。
[0006]目前，过敏原的检测主要是酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA),该方法灵敏度高，但是检测过程复杂，使用的荧光标记物污染环境，仪器价格昂贵，在实际应用中受到限制。表面等离子体共振生物芯片不需要标记，可对分子间的相互作用进行实时检测，已被广泛用于药物分析、食品分析、环境监测等许多领域。
[0007]表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)是一种基于麦克斯韦电磁波理论的物理光学现象，它产生于具有复介电常数这一特性的金属表面。表面等离子体共振技术(SPR)利用P偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时进入金属薄膜内的隐失波(倏逝波)，引发金属中的自由电子产生表面等离子体，当隐失波的波矢与表面等离子体的波矢相匹配时，二者将发生共振，入射光的能量被表面等离子体吸收，反射光强急剧下降，发生SPR现象，这时对应的入射角度称为谐振角或者共振角。如果将探针或配体固定于传感器芯片表面，含待分析物的样品流经传感器表面，若流过生物芯片表面的样品中含有与之结合的物质，它们之间发生的相互作用将导致芯片表面的介质折射率发生改变，引起SPR共振角发生改变。通过检测SPR信号改变检测分子间的相互作用的特异性、浓度、动力学、亲合性、协同作用、相互作用模式等。在生物分子相互作用分析过程中，靶物质可以天然存在于分析物中，在自然条件下进行分析，保证了所得结果的真实性。因此，SPR生物传感器具有实时、免标记、操作简单、可定量检测生物分子、检测两种或多种分子间结合的优点。目前，SPR技术已广泛应用于食品检测、药物筛选、疾病诊断等领域。
【发明内容】
[0008]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表面等离子体共振免疫传感芯片，该芯片表面固定虾原肌球蛋白、虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水或虾原肌球蛋白单克隆抗体，作为探针。
[0009]本发明的另一目的在于提供上述表面等离子体共振免疫传感芯片的制备方法。
[0010]本发明的再一目的在于提供上述表面等离子体共振免疫传感芯片的应用。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0012]一种表面等离子体共振免疫传感芯片的制备方法，包含如下步骤:
[0013](1)在玻璃基底上沉积厚度为40~60nm的金膜作为表面等离子体共振免疫传感芯片的固相载体；
[0014](2)在培养皿中注入含有HS (CH2)ltlCOOH (巯基十一酸)和HS (CH2)60H (巯基己酸)的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后注入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；
[0015](3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
[0016](4)流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；[0017](5)在生物芯片表面固定虾原肌球蛋白、虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水或虾原肌球蛋白单克隆抗体，记录表面等离子体共振角的变化，监测生物探针固定的过程，SPR响应值有大幅升高，则探针固定效果较好，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后通入PBS缓冲液清洗；
[0018](6)加入乙醇胺(Eth)溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗，得到表面等离子体共振免疫传感芯片。
[0019]步骤(I)中所述的玻璃基底优选为直径20mm、厚度Imm的圆形玻璃片；所述的金膜厚度优选为50nm ；
[0020]步骤(2)中所述的HS(CH2)iciCOOH的终浓度为0.5?10mM，优选为ImM ;所述的HS (CH2)6OH的终浓度为4.5?IOOmM,优选为9mM ；
[0021]步骤(2)中所述的化学修饰的条件为37°C温浴，避光反应0.5?48h，优选为2h ；
[0022]步骤(2)所述的氮气吹干的温度为40?60°C，优选为50°C ；
[0023]步骤(4)中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L;所述的N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ；
[0024]步骤(4)中所述的活化芯片的时间为3?60min,优选为15min ；
[0025]步骤(5)中所述的虾原肌球蛋白的分子量为36kD，浓度为0.105mg/mL ;所述的虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水是将效价为15000的虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水稀释100倍得到的；所述的奸原肌球蛋白单克隆抗体的浓度为0.0042mg/mL ;所述的固定时间为10?90min,优选为 30min ；
[0026]步骤(6)中所述的乙醇胺溶液的浓度为lmol/L，pH值为8.5 ;所述的封闭灭活的时间为I?IOmin,优选为6min ；
[0027]步骤(2)、(4)、(5)和(6)中所述的PBS缓冲液清洗的次数是I?5次，每次清洗的时间是I?5min ；
[0028]步骤(2)、(4)、(5)和(6)中所述的PBS缓冲液清洗的次数优选为3次，每次清洗的时间优选为2min ；
[0029]所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4 ；
[0030]所述表面等离子体共振免疫传感芯片的应用，该应用包括利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白单克隆抗体或检测虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水的应用和利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测过敏原(虾原肌球蛋白)的应用；
[0031]所述的利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白单克隆抗体，包含如下步骤:
[0032](一)建立标准曲线:
[0033]已知浓度的虾原肌球蛋白单克隆抗体或已知效价的虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水用PBS缓冲液配置成不同浓度或稀释倍数的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别通入表面等离子体共振仪的微流通池，与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；[0034](二)未知样品的检测:
[0035]将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(一)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中虾原肌球蛋白单克隆抗体的浓度或未知虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水的稀释倍数；
[0036](三)下一样品的检测:
[0037]步骤(二)中的免疫反应检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗I?5次，每次清洗的时间是I?5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I?3次，每次清洗时间是I?3min ；，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液I?5次，每次清洗的时间是I?3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
[0038]步骤(一)中所述的表面等离子体共振免疫传感芯片的探针为虾原肌球蛋白；
[0039]步骤(一)中所述的虾原肌球蛋白单克隆抗体标准溶液的浓度范围为I μ g/mL?
4.2mg/mL ;所述的奸原肌球蛋白单克隆抗体腹水稀释倍数范围为10?150倍；
[0040]步骤(一)所述的标准溶液的检测量优选为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3?5min,优选为3min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5?4° ,优选为I?2° ；
[0041]步骤(二)中所述的未知样品的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3?5min,优选为3min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5?4° ,优选为I?2° ；
[0042]步骤(三)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.0lmol/L0
[0043]步骤(三)中所述的PBS缓冲液清洗次数优选为3次，每次清洗的时间优选为3min ；
[0044]所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4 ；
[0045]样品中的抗体与芯片表面的抗原发生免疫反应，形成抗原-抗体结合物，SPR响应值增大，虾原肌球蛋白与虾原肌球蛋白单克隆抗体结合能力较强。随样品中虾原肌球蛋白单克隆抗体浓度的增大，即稀释度小，相同反应时间，更多的抗体与抗原结合，SPR响应值增大。由此方法，可得到检测虾原肌球蛋白单克隆抗体的标准曲线，随稀释倍数的增大，SPR响应值下降，呈倒S曲线。该方法适用于过敏原抗体筛选、患者血清样品中过敏原抗体检测。
[0046]SPR生物芯片可以连续检测多个样品，能进行大量样品的现场检测。至少可以连续检测80个样品，超过80个样品，检测灵敏度会降低，芯片需再生。该方法有希望直接用于临床,检测患者血清中的过敏原抗体。
[0047]所述的利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测过敏原(虾原肌球蛋白)，包含如下具体步骤:
[0048](I)建立标准曲线:
[0049]已知浓度的虾原肌球蛋白用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别通入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
[0050]( II )未知样品的检测:
[0051]将未知样品通入微流通池与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(I )得到的回归标准曲线，计算出未知样品中虾原肌球蛋白的浓度；
[0052](III)下一样品的检测:
[0053]步骤(II )中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗I?5次，每次清洗的时间是I?5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I?3次，每次清洗时间是I?3min ；，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液I?5次，每次清洗的时间是I?3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
[0054]步骤(I)中所述的表面等离子体共振免疫传感芯片的探针为虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水或虾原肌球蛋白单克隆抗体；
[0055]步骤(I)中所述的标准溶液的浓度范围为I μ g/mL?2.lmg/mL ；
[0056]步骤(I)所述的标准溶液的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3?5min;优选反应时间为3min;所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5?4°，优选为I?2° ;
[0057]步骤(2)中所述的未知样品的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3?5min ;优选反应时间为3min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5?4°，优选为I ?2° ;
[0058]步骤(3)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.0lmol/L0
[0059]步骤(3)中所述的PBS缓冲液清洗次数优选为3次，每次清洗的时间优选为3min;
[0060]所述所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmo I/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L 的 Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4 ；
[0061]本发明中所述的虾原肌球蛋白、虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水和虾原肌球蛋白单克隆抗体根据参考文献(黄建芳，王彩霞，向军俭，吕思，黄晟.凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白单克隆抗体的制备及其过敏原表位[J].免疫学杂志，2012,28 (9):746-749.)制备得到；
[0062]本方法可进行大量食品中过敏原的检测与安全评价。使用未纯化抗体或纯化抗体作为生物探针，不需要标记和二抗，降低了成本，简化操作步骤，缩短检测时间。
[0063]本发明的原理是:利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，经活化后芯片可以固定探针。在固相载体(镀金膜的玻璃片)分别固定虾原肌球蛋白、虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水、虾原肌球蛋白单克隆抗体作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振(SPR)响应。样品通入微流通池，与探针发生免疫反应，由P偏振光检测生物芯片探针与样品的反应。当检测样品中有与探针匹配的物质时，共振角发生变化，SPR检测仪记录检测结果，根据标准曲线，分析实验结果。
[0064]本发明与现有技术相比具有如下突出的优点及有益效果:
[0065](I)本发明不需要对样品标记，对环境无污染，克服了目前生物芯片检测方法荧光标记或放射性元素标记污染环境的问题。
[0066](2)本发明只需单一抗体，样品处理简单且用量少甚至不需要纯化，简化了操作步骤，实验操作简便，缩短了检测时间。
[0067]( 3 )本发明采用虾原肌球蛋白或其抗体作为探针，应用SPR技术进行信号检测，灵敏度高。
[0068](4)本发明设备简单，不需要昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件，可以用便携式SPR检测仪实现样品的现场快速检测。
[0069](5)通过本发明，可以广泛应用于普通实验室，有望在超市、市场、工厂等需要食品质量实时监控的场所，实现大量样品的现场快速检测。
[0070]总之，该技术的研制成功将真正实现生物芯片技术的快速、实时、能现场检测的特点，可迅速给出定量结果、灵敏度高而成本低，不污染环境。表面等离子体共振生物芯片检测过敏原及单抗，为直接法检测，设备便携，实验操作简单，检测时间短，不需标记，不使用二抗，对环境无污染，适合商场、码头、集市中大量样品的现场检测。表面等离子体共振生物芯片方法为我国食品安全领域过敏原的检测、临床诊断、虾过敏原疫苗设计和制定我国食品过敏原标签管理奠定了一定的技术基础，为食品过敏原的检测和食品中致敏成分的标识管理提供技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0071]图1是本发明生物芯片检测系统结构模式图。
[0072]图2是本发明芯片系统模式图。
【具体实施方式】
[0073]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0074]N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、乙醇胺(Eth),十二烷基硫酸钠(SDS)、HS (CH2) 10COOH酸)和HS (CH2) 60H (巯基己酸)购于美国Sigma公司；其它试剂购于北京化学试剂公司。PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水；所述的PBS缓冲液的PH值为7.4 ；SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L。
[0075]虾原肌球蛋白的分子量为36kD，虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水母液的效价为15000，虾原肌球蛋白单克隆抗体浓度为4.2mg/mL，根据参考文献(黄建芳，王彩霞，向军俭，吕思，黄晟.凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白单克隆抗体的制备及其过敏原表位[J].免疫学杂志，2012，28 (9) =746-749.)制备得到；
[0076]实施例1表面等离子体共振免疫传感芯片的制备
[0077](I)以直径20mm、厚度Imm的圆形玻璃片作为基底，在基底上沉积厚度为50nm的的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
[0078](2)在培养皿中通入含有终浓度为ImM的HS(CH2)iciCOOH (巯基十一酸)和9mMHS (CH2) 60H (巯基己酸)的乙醇溶液4mL，37°C温浴，避光，对金膜表面进行化学修饰2h ;然后通入PBS缓冲液清洗，充分清洗3次，每次2min，洗掉未结合物质；50°C氮气吹干；[0079](3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
[0080](4)流通池中通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ;基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的混合液150 μ L，活化芯片15min ;然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ;其中，混合液中N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L、N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ；
[0081](5)在生物芯片表面固定分子量为36kD，浓度为0.105mg/mL的虾原肌球蛋白100 μ L，作为生物探针，固定时间为30min ;记录SPR共振角的变化，监测生物探针固定的过程；然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ；
[0082](6)加入lmol/L的乙醇胺溶液(pH=8.5) 100 μ L，封闭灭活剩余的酯键6min ；PBS缓冲液清洗3次，每次清洗时间2min。
[0083]实施例2表面等离子体共振免疫传感芯片的制备
[0084](I)以直径20mm、厚度Imm的圆形玻璃片作为基底，在基底上沉积厚度为50nm的的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
[0085](2)在培养皿中通入含有终浓度为ImM的HS(CH2)iciCOOH (巯基十一酸)和9mMHS (CH2) 60H (巯基己酸)的乙醇溶液4mL，37°C温浴，避光，对金膜表面进行化学修饰2h ;然后通入PBS缓冲液清洗，充分清洗3次，每次2min，洗掉未结合物质；50°C氮气吹干；
[0086](3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
[0087](4)流通池中通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ;基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的混合液150 μ L，活化芯片15min ;然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ;其中，混合液中，N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L、N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ；
[0088](5)在生物芯片表面固定稀释100倍的虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水母液100 μ L，作为生物探针，时间是30min ;记录SPR共振角的变化，监测生物探针固定的过程；然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ；
[0089](6)加入lmol/L的乙醇胺溶液(PH=8.5) 100 μ L，封闭灭活剩余的酯键，6min ；PBS缓冲液清洗3次，每次清洗时间2min。
[0090]实施例3表面等离子体共振免疫传感芯片的制备方法
[0091](I)以直径20mm、厚度Imm的圆形玻璃片作为基底，在基底上沉积厚度为50nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
[0092](2)在培养皿中通入含有终浓度为ImM的HS(CH2)iciCOOH (巯基十一酸)和9mMHS (CH2) 60H (巯基己酸)的乙醇溶液4mL，37°C温浴，避光，对金膜表面进行化学修饰2h ;然后通入PBS缓冲液清洗，充分清洗3次，每次2min，洗掉未结合物质；50°C氮气吹干；
[0093](3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
[0094](4)流通池中通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ;基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的混合液150 μ L，活化芯片15min ;然后PBS缓冲液清洗3次，每次2min ;其中，混合液中，N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L、N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ；
[0095](5)在生物芯片表面固定浓度为0.0042mg/mL的虫下原肌球蛋白单克隆抗体100 μ L，作为生物探针，时间是30min ;记录 SPR共振角的变化，监测生物探针固定的过程；然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次2min ；
[0096](6)加入lmol/L的乙醇胺(PH8.5) 100 μ L，封闭灭活剩余的酯键，6min ；PBS缓冲液清洗3次，每次清洗时间2min。
[0097]实施例4利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测过敏原(虾原肌球蛋白)的应用
[0098]( I)建立标准曲线:
[0099]用I3BS缓冲液配置成不同浓度虾原肌球蛋白的标准溶液:将浓度为2.lmg/mL的虾原肌球蛋白母液分别稀释10、25、50、75、100倍；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别取100 μ L依次通入表面等离子共振仪的微流通池，与实施例2制备得到的表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，反应时间设定为3min ;对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液发生免疫反应的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
[0100](2)未知样品的检测:
[0101]将100 μ L的未知样品通入微流通池与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，反应时间设定为3min ;对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品发生免疫反应的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(1)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中虾原肌球蛋白的浓度；
[0102](3)下一样品检测:
[0103]一个样品检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗3次，每次清洗的时间是3min ;再通入SDS-HCl溶液清洗3次，每次3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液3次，每次清洗的时间是3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
[0104]浓度为2.lmg/mL的虾原肌球蛋白母液分别稀释10、50、100倍，样品浓度分别为:210μ g/mL、42l.! g/mL、21l.! g/mL，记为其真实值；同时利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测上述样品溶液中虾原肌球蛋白的含量:通过SPR检测仪测定的数据结合步骤(1)得到的回归标准曲线，计算出样品中虾原肌球蛋白浓度的检测值；检测值与真实值进行对比，如表1所示。检测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，说明SPR生物芯片检测系统具有良好的检测能力，实验方法可行。
[0105]表1利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白的结果分析
[0106]
【权利要求】
1.一种表面等离子体共振免疫传感芯片的制备方法，其特征在于包含如下步骤: (1)在玻璃基底上沉积厚度为40~60nm的金膜作为表面等离子体共振免疫传感芯片的固相载体； (2)在培养皿中注入含有HS(CH2)ltlCOOH和HS(CH2)6OH的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后注入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干； (3)将上述固相载体固定在SPR检测仪上； (4)流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N’ - (二甲氨基丙基)碳二亚胺的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗； (5)在生物芯片表面固定虾原肌球蛋白、虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水或虾原肌球蛋白单克隆抗体，记录表面等离子体共振角的变化，监测生物探针固定的过程，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后通入PBS缓冲液清洗； (6)加入乙醇胺溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗，得到表面等离子体共振免疫传感芯片。
2.根据权利要求1所述的表面等离子体共振免疫传感芯片的制备方法，其特征在于: 步骤(1)中所述的玻璃基底为直径20mm、厚度Imm的圆形玻璃片；所述的金膜厚度为.50nm ； 步骤(2)中所述的HS(CH2)iciCOOH的终浓度为ImM ;所述的HS(CH2)6OH的终浓度为9mM ； 步骤(2)中所述的化学修饰的条件为37°C温浴，避光反应2h ； 步骤(2)所述的氮气吹干的温度为50°C ； 步骤(4)中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L ;所述的N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L ； 步骤(4)中所述的活化芯片的时间为15min ； 步骤(5)中所述的奸原肌球蛋白的分子量为36kD,浓度为0.105mg/mL ;所述的奸原肌球蛋白单克隆抗体腹水是将效价为15000的虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水稀释100倍得到的；所述的奸原肌球蛋白单克隆抗体的浓度为0.0042mg/mL ;所述的固定时间为30min ； 步骤(6)中所述的乙醇胺溶液的浓度为lmol/L，pH值为8.5 ;所述的封闭灭活的时间为 6min ； 步骤(2)、(4)、(5)和(6)中所述的PBS缓冲液清洗的次数为3次，每次清洗的时间为2min ； 所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4。
3.一种表面等离子体共振免疫传感芯片，其特征在于由权利要求1或2所述方法制备得到。
4.权利要求3所述的表面等离子体共振免疫传感芯片在生物芯片领域中的应用。
5.根据权利要求4所述的表面等离子体共振免疫传感芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:包括利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白单克隆抗体或检测虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水的应用和利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白的应用。
6.根据权利要求5所述的表面等离子体共振免疫传感芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:所述的利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白单克隆抗体包含如下步骤: (一)建立标准曲线: 已知浓度的虾原肌球蛋白单克隆抗体或已知效价的虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水用PBS缓冲液配置成不同浓度或稀释倍数的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别通入表面等离子体共振仪的微流通池，与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； (二)未知样品的检测: 将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(一)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中虾原肌球蛋白单克隆抗体的浓度或未知虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水的稀释倍数； (三)下一样品的检测: 步骤(二)中的免疫反应检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗I~5次，每次清洗的时间是I~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗I~3次，每次清洗时间是I~3min ；，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓 冲液I~5次，每次清洗的时间是I~3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
7.根据权利要求6所述的表面等离子体共振免疫传感芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于: 步骤(一)中所述的表面等离子体共振免疫传感芯片的探针为虾原肌球蛋白； 步骤(一)中所述的虾原肌球蛋白单克隆抗体标准溶液的浓度范围为lyg/mL~4.2mg/mL ;所述的奸原肌球蛋白单克隆抗体腹水稀释倍数范围为10~150倍； 步骤(一)所述的标准溶液的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤(二)中所述的未知样品的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3min ；所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤(三)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L ； 步骤(三)中所述的PBS缓冲液清洗次数为3次，每次清洗的时间为3min ； 所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为 150mmol/L 的 NaCl 和水，pH 值为 7.4。
8.根据权利要求5所述的表面等离子体共振免疫传感芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于:利用表面等离子体共振免疫传感芯片检测虾原肌球蛋白的应用包含如下步骤: (I )建立标准曲线: 已知浓度的虾原肌球蛋白用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别通入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； (II)未知样品的检测: 将未知样品通入微流通池与表面等离子体共振免疫传感芯片上的探针发生免疫反应，对芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(1)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中虾原肌球蛋白的浓度； (III)下一样品的检测: 步骤(II)中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1~5次，每次清洗的时间是1~5min ;再通入SDS-HCl溶液清洗1~3次，每次清洗时间是1~3min ；，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1~5次，每次清洗的时间是1~3min ；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
9.根据权利要求8所述的表面等离子体共振免疫传感芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于: 步骤(1)中所述的表面等离子体共振免疫传感芯片的探针为虾原肌球蛋白单克隆抗体腹水或虾原肌球蛋白单克隆抗体； 步骤(1)中所述的标准溶液的浓度范围为1 μ g/mL~2.lmg/mL ； 步骤(1)所述的标准溶液的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3min ;所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤(2)中所述的未知样品的检测量为100 μ L ;所述的免疫反应的反应时间为3min ；所述的表面等离子体共振扫描范围为I~2° ; 步骤(3)中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L ； 步骤(3)中所述的PBS缓冲液清洗次数为3次，每次清洗的时间为3min ； 所述所述的PBS缓冲液的组成如下:终浓度为2mmol/L的NaH2PO4、终浓度为2mmol/L的Na2HP04、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。
【文档编号】G01N33/68GK103792368SQ201410040559
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】李莹, 钟金钢, 马骁, 齐攀 申请人:暨南大学