专利名称：检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析方法
技术领域：
本发明涉及食物过敏的检测方法，特别是涉及一种检测水产品食 物过敏的免疫胶体金层析方法，该方法主要是针对曱壳类原肌球蛋白
(TM)和鱼类小清蛋白(Par)食物过敏的免疫胶体金层析检测。
背景技术：
食物过敏医学上也称变态反应。引起食物过敏反应的物质叫做食 物过敏原，如鱼、虾、蟹、牛奶、蛋类等。其反应机理为过敏原进入 机体以后，会导致机体发生正常或过度免疫应答，即超壽丈反应。当再 次接触相同过敏原时多个IgE分子和抗体结合，引起IgE的Fc端结 构改变，导致细胞脱颗粒，释放组胺、5-羟色胺、白三烯等生物呼吸 活性物质并作用于效应器官，表现为平滑肌收缩、毛细血管扩张、通 透性增加、皮肤过壽丈、呼吸道过敏、造血系统过敏甚至过敏性休克(赵 俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志，2007， 8: 948-950 )。
近年来食物过敏问题已引起广大消费者、食品生产者和科学研究 者的普遍关注。根据流行病学调查，全球约有2%-2. 5%的成人受到食 物过敏疾病的困扰，婴幼儿的发病率更高，达到4%-6%,儿童约为 2°/。-3%。在联合国粮农组织公布的全球八大类过敏食物中，鱼类和曱 壳类水产品是其中重要的两大类，其主要过敏原分别为曱壳类原肌球蛋白(TM)和鱼类小清蛋白(Par) (Food and Agriculture Organization. Report of the FAO technical consultation on food allergies. Rome, Italy. 1995.)。
对于食物过敏目前无特别的治疗方法，严格避免接触过敏食物是 最有效的方法。常用的检测过敏原方法有体内过敏原点刺试验、体外 检测特异性IgE (RAST抑制实验和EAST抑制实验)、双盲食物激发 试验和酶联免疫吸附试验等。这些方法中，体内过敏原点刺试验易出 现假阳性；RAST抑制实验和EAST抑制实验的不足是对人体血清的依 赖性，血清是很难保证一致的，因此该方法难以标准化；双盲食物激 发试验易受其它因素影响，实践中也不易操作，实验剂量、安慰剂及 双盲控制等环节还有待完善；酶联免疫吸附试验步骤多、时间长(赵 俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华冲全验医学杂志，2007, 8: 948-950 )。
免疫胶体金层析技术是2Q世纪80年代发展起来的一种将免疫技 术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法。其原理是以条状纤维 层析材料为固相，借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时使 样品中的待测物与层析材料上的受体(如抗体或抗原)发生高特异、 高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材 料的一定区域(检测带)，通过酶促显色反应或直接使用可目测的着 色标记物，5-10 min内便可得到直观的实验结果。它不需进行结合 标记物与游离标记物的分离，省去了繁瑣的加样、洗涤步骤。因而这 种分析技术操作简单快速，分析结果清楚，易于判断，无需仪器设备， 成本低，可在市场、医院、家庭、办公场所甚至野外进行各种现场快 速检测，检测结果也可长期保存(吴刚，等。胶体金免疫层析技术 在食品检测中的应用。食品工业科技,2007， 12: 216-218),但目
前尚无曱壳类原肌球蛋白(TM)和鱼类小清蛋白(Par)食物过敏的 免疫胶体金层析检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测水产品食物过敏的免疫胶体金 层析方法。该方法利用动物抗体的免疫胶体金层析才企测水产品食物过 敏原TM和Par ，以及利用天然水产过敏原的免疫胶体金层析检测人 体血清中TM和Par抗体，从而达到快速、灵每丈检出水产品食物过敏 的目的。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是 本发明是一种检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析方法，其具 体步骤如下
(1) 制备胶体金吸取O. 5-2. 0 mL氯金酸加到50-200 mL超纯 水中，加热至沸腾后，迅速加入2-5 mL 1 %柠檬酸三钠，加热煮沸 5-10 min,获得透明、酒红色的胶体金溶液；
(2) 胶体金标记蛋白质边搅拌边逐滴加入蛋白溶液(过敏原抗 体或过敏原)至胶体金溶液中，蛋白质终浓度约为5-15ng/mL，继续 搅拌0.5-1 h;边搅拌边逐滴加入100-300 10 %牛血清白蛋白
(BSA),继续搅拌10-15 min,静置过夜；取已标记蛋白质的胶体 金溶液于5000 g， 4 。C下离心10-15 min;取上清液于17000 g， 4 。C 下离心30-45 min;吸出上清液，沉淀溶于1-3 mL磷酸緩冲液中， 制得胶体金标记的蛋白质，现用或4 。C保存备用。
(3) 免疫胶体金层析检测依次将玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、吸 水纸贴在底板上组成免疫金试纸条；分别在免疫金试纸条的硝酸纤维
膜的4企测区滴加l-3 iuL胶体金标记的蛋白质(抗体或抗原)和对照 区滴加l-3 pL葡萄球菌A蛋白，胶体金标记的蛋白质浓度为0.5-5 mg/mL,烘干；在金标区滴加10-20 胶体金标记的蛋白质(抗体或 抗原)，胶体金标记的蛋白质浓度为0.5-5 mg/mL;在玻璃纤维区滴 加20-200 待冲企样品反应5-10 mi n,若检测区和对照区都出现红 色斑点，样品检测结果为阳性；若检测区无显色而对照区出现红色斑 点，样品检测结果为阴性；若对照区不显色，样品检测结果无效。
本发明用胶体金标记过敏原抗体或过敏原并制备免疫金试纸条， 用于检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析试剂盒。
本发明是利用兔抗锯缘青蟹TM抗体和兔抗鲢鱼Par抗体的免疫 胶体金层析技术，同时对水产品过敏原TM和Par进行特异性检测； 利用天然的坏蟹类TM和鱼类Par的免疫胶体金层析技术，同时对人 体血清中TM抗体和Par抗体进行特异性检测。本发明的优点是只 需要层析试纸条，待检样品不需前处理或只需简单处理，；险测结果直 接用颜色显示，5-10 min可以判定4企样中是否存在水产品过敏原或 人体血清中是否含有水产品过敏原抗体，因而具有操作简便、成本低、 结果清楚可保存、不受外界因素影响等特点，可在市场、医院、家庭、 办公场所和野外等进行各种现场快速^r测。
本发明利用免疫胶体金层析技术对水产品食物过敏进行检测，该 技术既有酶免疫法的特异性强和灵敏度高的优点，又有点刺试验的快 速、简便检测的优点，可快速检出食物中是否存在水产品过敏原或人 体血清中是否含有水产品过敏原抗体。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
图1免疫胶体金层析试纸条示意图2兔抗TM抗体的胶体金层析检测对奸TM ( A )和鲢鱼Par ( B ) 结果图3兔抗TM抗体的胶体金层析检测对蚱TM ( A )、青蟹TM酶解 液(B)和对奸TM辐照后溶液(C)结果图4坏蟹类TM的胶体金层析检测过敏者血清中TM抗体(A )和 Par抗体(B)结果图5鲢鱼Par的胶体金层析检测过敏者血清中Par抗体(A)和 TM抗体(B)结果图6胶体金层析检测过敏者血清中TM抗体(A ) 、 Par抗体(B ) 和无过敏者血清(C)结果图。
具体实施例方式
实施例1:兔抗TM抗体的胶体金层析检测样品中是否含有TM
(1) 制备胶体金。吸取1. 0 mL氯金酸加到100 mL超纯水中，加 热至沸腾后，迅速加入4 mL 1 %柠檬酸三钠，加热煮沸8 min，获得 透明、酒红色的胶体金溶液。
(2) 蛋白质的胶体金标记。边搅拌边逐滴加入兔抗TM抗体至胶 体金溶液中，蛋白质终浓度约为8 pg/mL，继续搅拌O. 5 h;边搅拌 边逐滴加入200 pL 10 %牛血清白蛋白(BSA),继续搅拌IO min， 静置过夜。已标记胶体金的蛋白质溶液于5000 g, 4 t:下离心10min; 取上清液于17000 g， 4 。C下离心30 min;吸出上清液，制得胶体金 标记的蛋白质，沉淀溶于2 mL磷酸緩冲液，现用或4 。C保存备用。
(3)免疫胶体金层析检测。
如图2所示，标号l.葡萄球菌A蛋白；2.兔抗TM抗体；3.胶 体金标记的兔抗TM抗体。
如图3所示，标号l.兔抗TM抗体；2.胶体金标记的兔抗TM 抗体。
依次将玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、吸水纸贴在底板上组成免疫金试纸 条。在免疫金试纸条的硝酸纤维膜的检测区固定1 兔抗TM抗体， 对照区固定l jliL葡萄球菌A蛋白溶液，在金标区加入12 pL胶体金 标记的兔抗TM抗体，对食品样品中是否含有TM进行检测。从图2中 的纸条A可以看出，待检样品为对虫下TM溶液，膜条上的检测区出现 红色斑点；图2中的纸条B中加入的待检样品为鲢鱼Par溶液，检测 区不显色，表明样品中不含有TM。为了进一步—睑证兔抗TM抗体胶体 金层析法的特异性，分别4全测了对坏TM、青蟹TM酶解液和对蚱TM 经10kGy辐照后溶液，如图3所示，对虫下TM溶液的检测区出现红色 斑点(图3中的纸条A)，而另两种溶液的;f企测区均无显色(图3中 的纸条B和图3中的纸条C),表明这两种溶液中的TM均已降解。
实施例2:奸蟹类TM的胶体金层析检测过每丈者血清中是否含有 TM抗体
如图4所示，标号l.对蚱TM; 2.青蟹TM; 3.胶体金标记的 对奸TM。
免疫胶体金层析试纸条的制备参照实施例1(其中胶体金标记的 蛋白质由实施例1的兔抗TM抗体换为本实施例中的奸蟹类TM)。在 免疫金试纸条的硝酸纤维膜上的两个检测区分别固定1 pL对奸TM 和青蟹TM，金标区加入12 ^L胶体金标记的对虾TM,对人体血清样 品中是否含有TM抗体进行检测。从图4中的纸条A可以看出，待检
样品为TM过每丈者血清，结果两个检测区均出现红色斑点；图4中的 纸条B中加入的待^r样品为Par过敏者血清，结果两个4全测区均不显 色，表明样品中不含有TM抗体。
实施例3:鲢鱼Par的胶体金层析检测过敏者血清中是否含有Par
抗体
如图5所示，标号1.鲢鱼Par; 2.鲫鱼Par; 3.月交体金标记 的鲢鱼Par。
免疫胶体金层析试纸条的制备参照实施例1(其中胶体金标记的 蛋白质由实施例1的兔抗TM抗体换为本实施例中的鲢鱼Par)。在 硝酸纤维膜上的两个检测区分别固定1 piL鲢鱼Par和鲫鱼Par,金 标区加入12 ^L胶体金标记的鲢鱼Par，对人体血清样品中是否含有 Par抗体进行4企测。从图5中的纸条A可以看出，待才企样品为Par过 敏者血清，结果两个检测区均出现红色斑点；图5中的纸条B中加入 的待检样品为TM过敏者血清，结果两个检测区均不显色，表明样品 中不含有Par抗体。
实施例4:胶体金层析同时检测过敏者血清中是否含有TM抗体 和Par抗体
如图6所示，标号1.鲢鱼Par; 2.对奸TM; 3.月交体金标记的 葡萄球菌A蛋白。
免疫胶体金层析试纸条的制备参照实施例1(其中胶体金标记的 蛋白质由实施例1的兔抗TM抗体换为本实施例中的对蚱TM和鲢鱼 Par)。在免疫金试纸条硝酸纤维膜上的两个检测区分别固定1 pL 对虾TM和鲢鱼Par，金标区加入12 jiL胶体金标记的葡萄球菌A蛋 白，对人体血清样品中是否含有TM抗体和Par抗体同时进行检测。 从图6-A可以看出，待检样品为TM过敏者血清，膜条上对坏TM固定
处出现红色斑点，鲢鱼Par固定处不显色；图6-B中加入的待4企样品 为Par过敏者血清，膜条上鲢鱼Par固定处出现红色斑点，对虾TM 固定处不显色；图6-C中加入的待枱二样品为无过每丈者血清，膜条上对 奸TM和鲢鱼Par固定处均不显色。
权利要求
1、一种检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析方法，其特征在于其具体步骤如下(1)制备胶体金吸取0.5-2.0mL氯金酸加到50-200mL超纯水中，加热至沸腾后，迅速加入2-5mL 1％柠檬酸三钠，加热煮沸5-10min，获得透明、酒红色的胶体金溶液；(2)胶体金标记蛋白质边搅拌边逐滴加入蛋白溶液至胶体金溶液中，蛋白质终浓度约为5-15μg/mL，继续搅拌0.5-1h；边搅拌边逐滴加入100-300μL 10％牛血清白蛋白(BSA)，继续搅拌10-15min，静置过夜；取已标记蛋白质的胶体金溶液于5000g，4℃下离心10-15min；取上清液于17000g，4℃下离心30-45min；吸出上清液，沉淀溶于1-3mL磷酸缓冲液中，制得胶体金标记的蛋白质，现用或4℃保存备用。(3)免疫胶体金层析检测依次将玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、吸水纸贴在底板上组成免疫金试纸条；分别在免疫金试纸条的硝酸纤维膜的检测区滴加1-3μL胶体金标记的蛋白质和对照区滴加1-3μL葡萄球菌A蛋白，蛋白质浓度为0.5-5mg/mL，烘干；在金标区滴加10-20μL胶体金标记的蛋白质，胶体金标记的蛋白质浓度为0.5-5mg/mL；在玻璃纤维区滴加20-200μL待检样品反应5-10min，若检测区和对照区都出现红色斑点，样品检测结果为阳性；若检测区无显色而对照区出现红色斑点，样品检测结果为阴性；若对照区不显色，样品检测结果无效。
2、 根据照权利要求1所述的检测水产品食物过敏的免疫胶体金 层析方法，其特征在于用胶体金标记过敏原抗体或过敏原并制备免 疫金试纸条，用于检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析方法，它包括制备胶体金、蛋白质的胶体金标记、免疫胶体金层析检测等步骤。本发明是利用免疫胶体金层析技术对水产品食物过敏进行检测，该技术既有酶免疫法的特异性强和灵敏度高的优点，又有点刺试验的快速、简便检测的优点，可快速检出食物中是否存在水产品过敏原或人体血清中是否含有水产品过敏原抗体。
文档编号G01N33/68GK101358981SQ20081007173
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者刘光明, 曹敏杰, 苑 沈 申请人:集美大学