棉铃虫和烟夜蛾的npf神经肽及其编码基因和应用的制作方法

棉铃虫和烟夜蛾的npf神经肽及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）序列1所示的氨基酸组成的蛋白质；（b）序列3所示的氨基酸组成的蛋白质；（c）序列6所示的氨基酸组成的蛋白质；（d）将以上氨基酸经过取代和/或缺失和/或添加衍生的蛋白质。本发明还保护抑制所述基因表达的物质在如下（e）或（f）中的应用：（e）培育抗虫转基因植物；（f）制备抗虫剂。本发明发现，抑制该基因表达的物质可以用于培育转基因抗虫作物，即通过干扰害虫的取食作用，从而抑制害虫对植物的危害，无污染，不会将有害物质传递到害虫的天敌体内，与环境的相容性好，对于农业生产具有重大有益价值。
【专利说明】棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]神经肽NPY (Neuropeptide Y)首先在高等动物中发现，之后相继在无脊椎动物中发现，在昆虫中的发现相对较晚。由于最早发现的Neuropeptide Y成熟肽C-末端为酪氨酸(Y)而被命名NPY，无脊椎动物中以苯丙氨酸(F)结尾，所以将无脊椎动物此类神经肽统称为NPF，或无脊椎动物的NPY家族。目前在昆虫中NPY命名尚未统一，以酪氨酸结尾的称NPY (如意大利蜜蜂)，以苯丙氨酸结尾的称NPF (如果蝇)，昆虫NPF或者NPY总称NPY类神经肽。目前，昆虫其他目的物种中，仅发现有NPF或者NPY，而在鳞翅目昆虫中发现同时含有NPF和NPY。该类基因主要分布于主要分布于脑和中肠中，在取食、酒精过敏、性行为、学习和记忆、生物节律等许多方面都起着重要的调控作用。
[0003]目前，在无脊椎动物中，对NPF基因功能的研究相对滞后，主要集中在果蝇和线虫的NPF上。在鳞翅目昆虫中，该基因还未见报道。研究棉铃虫NPF的基因及其功能，对于害虫防治新技术的开发具有广泛的前景。
[0004]烟夜蛾和棉铃虫都属于鳞翅目、夜蛾科，主要以幼虫取食幼嫩组织为害作物，以蛹越冬。烟夜蛾在全国各地均有分布，属寡食性害虫，主要为害烟草。棉铃虫是一种在全球范围内为害农作物的害虫，食性广，为害严重。另外，棉铃虫具有显著的生理生态及行为特点，例如杂食性、滞育、迁飞等，还是研究鳞翅目昆虫的代表物种。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提`供一种棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用。
[0006]本发明提供的蛋白质，来自棉铃虫或烟夜蛾，命名为NPF蛋白，是如下(a)或(b )或
(c)或(d):
[0007](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008](b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009](c)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010](d)将(a)或(b)或(C)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。
[0011]编码所述蛋白的基因(NPF基因)也属于本发明的保护范围。
[0012]所述基因可为如下I)至10)中任一所述的DNA分子:
[0013]I)序列表的序列2自5’末端第48-293位核苷酸所示的DNA分子；
[0014]2)序列表的序列4自5’末端第48-413位核苷酸所示的DNA分子；
[0015]3)序列表的序列5自5’末端第70-315位核苷酸所不的DNA分子；
[0016]4)序列表的序列7自5’末端第70-435位核苷酸所不的DNA分子；
[0017]5)序列表的序列2所示的DNA分子；[0018]6)序列表的序列4所示的DNA分子；
[0019]7)序列表的序列5所示的DNA分子；
[0020]8)序列表的序列7所不的DNA分子；
[0021]9)在严格条件下与I)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)限定的DNA序列杂交且与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子；
[0022]10)与I)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子。
[0023]含有所述NPY基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0024]本发明还保护抑制所述NPF基因表达的物质在如下(e)或(f)中的应用:(e)培育抗虫转基因植物；(f)制备抗虫剂。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如烟草NC98。所述抗虫具体可为抗鳞翅目昆虫，更具体可为抗夜蛾科昆虫，进一步具体可为抗棉铃虫或抗烟夜蛾。
[0025]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将抑制所述NPF基因表达的物质导入出发植物，得到对昆虫抗性增强的转基因植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如烟草NC98。所述昆虫可为鳞翅目昆虫，更具体可为夜蛾科昆虫，进一步具体可为棉铃虫或烟夜蛾。
[0026]本发明还保护一种抗虫剂，它`的活性成分为抑制所述NPF基因表达的物质。所述抗虫具体可为抗鳞翅目昆虫，更具体可为抗夜蛾科昆虫，进一步具体可为抗棉铃虫或抗烟夜蛾。
[0027]所述抑制NPY基因表达的物质可为针对所述NPF基因的干扰载体或抑制所述NPF基因表达的双链RNA。
[0028]所述干扰载体中具有特异DNA片段；所述特异DNA片段为双链，包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之间的间隔序列；所述DNA片段甲的序列与所述DNA片段乙的序列反向互补；所述DNA片段乙为所述NPY基因或其片段。所述DNA片段乙具体可为序列8自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子或序列10自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子。所述干扰载体具体可为如下质粒:骨架载体为pGreen-HY104载体，在骨架载体的不同多克隆位点分别插入了所述DNA片段甲和所述DNA片段乙。所述干扰载体更具体可为如下质粒:骨架载体为pGreen-HY104载体，在所述骨架载体的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入了所述DNA片段甲，在骨架载体的SmaI和BamHI酶切位点之间插入了所述DNA片段乙。
[0029]所述双链RNA具体可为序列表的序列12所示的双链RNA分子、序列表的序列13所示的双链RNA分子、序列表的序列9所示的双链RNA分子或序列表的序列11所示的双链RNA分子。
[0030]本发明还保护序列表的序列12所示的双链RNA分子、序列表的序列13所示的双链RNA分子、序列表的序列9所不的双链RNA分子或序列表的序列11所不的双链RNA分子。
[0031]本发明还保护具有特异DNA片段的干扰载体。所述特异DNA片段为双链，包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之间的间隔序列；所述DNA片段甲的序列与所述DNA片段乙的序列反向互补；所述DNA片段乙为所述NPY基因或其片段。所述DNA片段乙具体可为序列8自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子或序列10自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子。所述干扰载体具体可为如下质粒:骨架载体为pGreen-HYKM载体，在骨架载体的不同多克隆位点分别插入了所述DNA片段甲和所述DNA片段乙。所述干扰载体更具体可为如下质粒:骨架载体为pGreen-HY104载体，在所述骨架载体的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入了所述DNA片段甲，在骨架载体的SmaI和BamHI酶切位点之间插入了所述DNA片段乙。[0032]以上任一所述的pGreen_HY104载体具体可为序列表的序列14所示的质粒，结构示意图见图6。
[0033]本发明发现，抑制NPF基因表达的物质可以用于培育转基因抗虫作物(特别是烟草、棉花、玉米等棉铃虫为害的农作物)，其作用机理是通过干扰害虫的取食作用，从而抑制害虫对植物的危害，无污染，不会将有害物质传递到害虫的天敌(通常为益虫)体内，与环境的相容性好，对于农业生产具有重大有益价值。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为pDNR-LIB载体的结构示意图。
[0035]图2为棉铃虫脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定，泳道1_20分别为随机挑取的单克隆。
[0036]图3为棉铃虫神经肽NPF基因(包括NPFl和NPF2)的全长扩增产物。
[0037]图4为烟夜蛾脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定，泳道1_15分别为随机挑取的单克隆。
[0038]图5为烟夜蛾神经肽NPF基因(包括NPFl和NPF2)的全长扩增产物。
[0039]图6为pGreen_HY104载体的结构示意图。
[0040]图7为HindIII和BamHI双酶切鉴定棉铃虫RNAi干扰载体；泳道I对应酶切后的棉铃虫RNAi载体，泳道2对应pGreen-HY104载体。
[0041]图8为HindIII和BamHI双酶切鉴定烟夜蛾RNAi干扰载体；泳道I对应pGreen-HY104载体，泳道2对应酶切后的烟夜蛾RNAi载体。
[0042]图9为棉铃虫dsRNA和烟夜蛾dsRNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道I对应棉铃虫dsRNA,泳道2对应烟夜蛾dsRNA。。
[0043]图10为实施例5中，在烟草中导入棉铃虫RNAi干扰载体后dsRNA的表达情况；泳道I对应烟草植株I的原叶，泳道2对应烟草植株2的原叶，泳道3对应烟草植株I的新叶，泳道4对应烟草植株2的原叶,泳道M对应分子量标记。
[0044]图11为实施例5中棉铃虫对转基因烟草植株的危害情况(实验l);a:实验组接种棉铃虫24小时后；b:实验组接种棉铃虫48小时后；c:实验组接种棉铃虫72小时后；d:对照组接种棉铃虫24小时后；e:对照组接种棉铃虫48小时后；f:对照组接种棉铃虫72小时后。
[0045]图12为实施例5中棉铃虫对转基因烟草的叶片的危害情况(实验2) ；a为照片，b为棉铃虫取食叶片的面积。
[0046]图13为被棉铃虫进食前的饲料的照片。
[0047]图14为被棉铃虫进食后的饲料照片。[0048]图15为实施例6中注射棉铃虫dsRNA后棉铃虫的取食量变化。
【具体实施方式】
[0049]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0050]棉铃虫(英文名称为cotton bollworm，拉丁名为 Helicoverpa armigera):提及棉铃虫的文献:A simple and reliable method for discriminating between Helicoverpaarmigera and Helicoverpa assulta(Lepidoptera:Noctuidae)，Chen，J:Wu，YC;Chen，X;.11.YT:Zhang.DX，INSECT SCIENCE)。棉铃虫在中国农业大学昆虫生理生化分子生物学实验室饲养，饲养条件为:温度26°C，光周期为每天16小时光照、8小时黑暗，相对湿度控制在55-65% ；2龄后分管单管饲养，玻璃管直径1.5cm、高10cm。
[0051]烟夜蛾(英文名称为Tobacco budworms，拉丁名为 Helicoverpa assulta):提及烟夜蛾的文献:A simple and reliable method for discriminating between Helicoverpaarmigera and Helicoverpa assulta(Lepidoptera:Noctuidae)，Chen，J:Wu，YC;Chen，X;.1
1.YT: Zhang.DX, INSECT SCIENCE)。饲养条件:温度26°C，光周期为每天16小时光照、8小时黑暗，相对湿度控制在55-65% ；2龄后分管单管饲养，玻璃管直径1.5cm、高10cm。
[0052]pGreen-HY104载体(又称pGreen-GUS-dsRNA)，结构不意图见图6，为序列表的序列 14 所不的质粒。VX pGreen 0229 (http://www.pgreen.ac.uk/JIT/JIT_fr.htm)为骨架构建得到的。在XbaI和SacI之间插入CaMV ter序列，在KpnI和XhoI之间插入35spromoter序列，在EcoRI和Ps`tI之间插入(iUS基因序列。
[0053]农杆菌C58 (Agrobacterium tumefaciens C58):参考文献:Development ofAgrobacterium tumefaciens C58-1nduced plant tumors and impact on host shootsare controlled by a cascade of jasmonic acid,auxin, cytokinin, ethylene andabscisic acid，Veselov, D;LanghansjM;HartungjW;AlonijR;Feussnerj I;GotzjC;Veselova,S;Schlomski, S;Dickler, CiBachmannjKiUllrichj Cl，PLANTA，216 (3):512-522。
[0054]烟草NC98(野生型烟草)！Distribution of solanesol in Nicotianatabacum，ZHAO Chun-jian, ZU Yuan—gang，LI Chun-ying, TIAN Cheng-yu, Journal ofForestry Research, 18(I):69 - 72(2007)。
[0055]实施例1、棉铃虫NPF蛋白及其编码基因的获得
[0056]一、cDNA文库构建
[0057]文库构建使用SMART cDNA Library Construction Kit试剂盒。构建流程如下:取 2μ L 棉铃虫幼虫脑总 RNA (约 2μ g)，依次加入 1μ L SMART IV Oligoncleotide (5’_AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGG-3)，I μ L CDS/3’PCR primer (ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-lN)，然后加入2μ L无RNase去离子水。轻轻混匀后离心，72°C孵育2min，冰上冷却2min后离心，每管中加入2 μ L 5χ第一链合成Buffer，I μ L DTT (20mM),I μ L dNTP混合物(IOmM)，I μ L丽LV反转录酶，至总体积为10 μ L0同时做一个阳性对照。轻轻混匀后离心后在PCR仪中42°C孵育lh，在冰上终止第一链的合成，至此第一链合成完成。
[0058]在合成第二链的反应中选用LD-PCR法，加入第一链cDNA 2 μ L，去离子水 80 μ L，IOX Advantage 2 PCR Buffer 10 μ L,50X dNTP Mix 2 μ L，5，PCR 引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)2 μ L, CDS 111/3，PCR 引物 2 μ L,50X Advantage〗Polymerase Mix 2 μ L,总体积100 μ L。轻轻混匀后离心，使用以下程序进行反应:950C Imin ；95°C 15sec、68°C 6min，20 个循环。
[0059]反应结束后，取5 μ L在1.1%含有EtBr的胶上进行电泳检测。第二链产物合成后需用蛋白酶K进行消化。方法如下:在0.5mL的离心管中加入50 μ L ds cDNA和2 μ L蛋白酶Κ(20 μ g/ μ L)，混匀后离心,45°C孵育20min，反应结束后加入50 μ L去离子水,然后加入IOOyL酹:氯仿:异戍醇(25:24:1,体积比)进行抽提，14000rpm离心5min后取上清。在上清中加入 10 μ L NaAC (醋酸钠，3Μ，ΡΗ4.8)，L 3 μ L Glycogen (糖原，20 μ g/μ L)和260 μ L 95%ΕΤ0Η (乙醇)，室温下迅速14000rpm离心20min,小心弃去上清，加100 μ L含80%的乙醇洗涤沉淀，沉淀干燥约IOmin以除去残留的乙醇。加入79 μ L的去离子水，充分溶解沉淀。
[0060]在上述79yL ds cDNA 溶液中加入 10 μ L IOX Sfi Buffer, 10 μ L SfiI 内切酶和IyLlOOX BSA，混匀后50°C孵育2hr进行酶切。反应结束后加入2 μ L 1%二甲苯青染色，然后准备进行ds cDNA片段分离。ds cDNA片段分离使用CHROMA SPIN-400柱子进行，步骤如下:1)在离心管铁架台上放置16个1.5mL离心管；2)将CHROMA SPIN-400柱从4°C冰箱中取出，按以下步骤处理柱子:a)室温放置lh，颠倒数次彻底悬浮胶体，或者打开上盖子用微量枪头轻轻混匀；b)轻轻悬浮胶体(勿产生气泡)，拔掉底盖；c)将柱子水平固定在铁架台上，打开柱子下面封口，使贮存缓冲液自然流下，待流尽后看凝胶体积是否达到lmL，如果没有lmL，在其它柱子中取凝胶补充至ImL ；d)柱子流速大约为I滴/40_60s，I滴约为40 μ L，若流速太低(〈I滴/100s)或每滴体积太小(〈25 μ L)必须重复上述步骤进行重新悬浮；3)贮存缓冲液流完后，在柱的 中心处加入700 μ L柱缓冲液，让其流出；4)待柱缓冲液流干后，小心将约100 μ L经Sfi1-酶切的cDNA和二甲苯青混合物加到胶顶部中心部位；5)当样品充分进入胶内时，向柱内加入100 μ L的柱缓冲液，待柱内凝胶表面液体消失且没有液滴滴下时进行下一步；6)准备好17个1.5mL离心管的架子置于柱子下面，第一个管子置于柱子出口下部；加入600 μ L的柱缓冲液，立即开始收集，每管35 μ L (约I滴)，直至收集够全部17管；7)制备1.1%的琼脂糖凝胶，电泳检测17管的收集物，每管用3 μ L连续在点样孔加样，150V电泳IOmin ;收集6_11管含有cDNA的组分到一个新1.5mL的离心管中；8)依次加入 1/10 体积 NaAC (3M;pH4.8)，1.3μ L Glycogen (20mg/mL)，2.5 倍体积 959i)ET0H(-20) °C，充分混匀，_20°C过夜沉淀；9)室温14000rpm离心20min ；10)小心弃上清,轻离心,用移液器小心吸去剩余的上清，干燥约IOmin ；11)以7 μ L无离子水溶解沉淀，轻微混匀，即制备好酶切完成的PCR片段。
[0061]将酶切完成的PCR片段与经SfiI酶切的pDNR-LIB载体(结构示意图见图1)连接。连接体系如下:dscDNA 1.0μ L、pDNR-LIB 载体 1.0μ L、10X ligation buffer 0.5 μ L、ATP(IOmM)0.5 μ L、T4 DNA 连接酶 0.5 μ L、去离子水 1.5μ L。
[0062]将上述反应后的重组质粒,通过电击转化仪导入大肠杆菌DH5 α菌株感受态细胞中。取3份25 μ L感受态细胞，冰上融化，分别加入上述连接产物，混匀后加入到电转杯中进行电转转化。转化后迅速取出电转杯，加入970 μ L 37°C预热的SOC培养基，转移到IOmL离心管中，37°C震荡培养Ihr (200rpm/min)。取培养物涂布在含有30mg/mL氯霉素的平板上，37°C倒置培养过夜。根据菌落生长情况确定适合的连接体系，以此作为原始文库，4°C保存。棉铃虫脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定结果见图2。
[0063]二、5’RACE PCR 扩增
[0064]5’RACE 上游引物采用引物 SMART cDNA Library Construction Kit 中的 5’ 引物(5 ’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ’)，下游引物采用设计的简并引物(NPF: 5 ’ -TTNCCRAANCKNGGNCKIGCIGCYTG-3' NPY:5’ -CCNCKNCCRTGNCCRTGNACNSWRTARTA-3’)。
[0065]按照试剂盒说明书操作，反应体系(25L):LAPCR Buffer (Mg2+) 2.5 μ L、dNTP mix(each IOmM) 4 μ L> LA taq 0.25 μ L>Primer I (10 μ mol/L) I μ L>Primer 2 (10 μ mol/L)I μ L、质粒 cDNA 文库 0.5μ L、ddH20 11.25 μ L。
[0066]在PCR管中将其混合完毕后，放入PCR仪扩增，反应条件为:94°C 3min ；94°C 30S、65°C— 55°C (每个循环降低 1°C)、72°C 30S，10 个循环；94°C 30S、54°C 30S、72°C 30S，30 个循环；72°C 7min。
[0067]反应结束后记性2%琼脂糖凝胶电泳，回收连接克隆后转入大肠杆菌培养，挑菌送样测序。
[0068]三、3 ’ RACE快速扩增3 ’末端
[0069]1、cDNA 合成
[0070]I)将模板RNA在冰上解冻；引物、10XRT mix(其中包含RNasin和DTT)、超纯dNTP混合液、RNase-free ddH20在室温(15_25°C )解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，离心以收集残留在管壁的液体。
[0071]2)按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5s。简短离心，并置于冰上，RNA模板请于第4)步加入。
[0072]3)如果要做多个逆转录反应，可以将配制好的混合液后分装在单个反应管中，置于冰上。
[0073]4)首先取适量的RNA I μ g进行定量,冰浴条件下按照Tiangen (Quant One StepRT-PCR Kit)说明进行以下配置反转录体系:10X RT mix、dNTP混合液(2.5mM each)、dT3AP>Quant Reverse Transcriptase>RNAse-free H20、模板 RNA (在第 4 步加入)，总体积20 μ L0
[0074]5)将模板RNA (50ng_2 μ g)加入到混合液中，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5s，离心15s。
[0075]6)37°C孵育 60min，4°C保存备用。
[0076]2、3’RACE 扩增
[0077]根据cDNA反转录时候3’-dT3AP引物结构，设计3’外引物:3Ap (5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’ );根据5’ RACE扩增并测出的序列信息，设计出一条上游特异性引物SPF (NPF:5’ -ATGCTGAACAAGAACATCG-3’，NPY:5’ -TGCGTTTCCTCCTACCGGCCATG-3’)。
[0078]3’ RACE扩增采用两步PCR的方法，即第一步PCR只需在反应体系中加入上游引物，在PCR管中将其混合完毕后，放入PCR仪扩增，通过10个循环的单引物反应，增加目的基因的初始拷贝数，然后再加入下游3AP引物，进行25个左右循环的扩增。[0079]按照试剂盒说明书操作，反应体系(25 μ L):LA PCR Buffer (Mg2+) 2.5 μ L、dNTPmix(each 10mM)4 μ L>LA taq 0.25 μ L>Primer 1(SPF)(10 μ mol/L)lμ L、ddH20 11.75 μ L0
[0080]反应条件:94°C3min ；94°C 30S、56°C 30S、72°C 30S, 10 个循环；4°C温浴，加入下游接头引物 3AP -M0C 30S、56°C 30S、72°C 30S，25 个循环；72°C 7min。
[0081]反应结束后进行2%琼脂糖凝胶电泳，回收连接克隆后转入大肠杆菌培养，挑菌送样测序。
[0082]四、cDNA全长的扩增
[0083]根据NPF5’和3’ RACE测序结果设计扩增棉铃虫NPF全长基因序列，上游命名为P1F，下游命名为P1R。
[0084]按照试剂盒说明书操作，反应体系(25 μ L):LA PCR Buffer (Mg2+) 2.5 μ L、dNTPmix (each 10mM)4y L.LA taq 0.25 μ L、引物 PlF (10 μ mol/L) I μ L、引物 PlR (lOymol/L) I μ L、棉铃虫质粒 cDNA 文库 0.5 μ L、ddH20 11.25 μ L。
[0085]引物P IF: 5，-ATGCTGAACAAGAACATCG-3，；
[0086]引物PIR: 5，-CTGTTGCACTCCTCATCTCCTTCTGG-3，。
[0087]反应条件为:94°C3min ；94°C 30s、65°C— 55°C(每个循环降低 l°C)30s、72°C 30s,10 个循环；94°C 30s、54°C 30s,72°C 30s, 30 个循环；72°C 7min。
[0088]反应结束进行2%琼脂糖凝胶电泳，回收连接克隆后转入大肠杆菌培养，挑菌送样测序。棉铃虫神经肽NPF基因的全长扩增产物的电泳图见图3。
[0089]通过上述实验，发现一个来源于棉铃虫的新基因，该新基因的一种剪辑形式可以编码得到序列表的序列I所不的蛋白质(命名为棉铃虫NPFl蛋白，如序列表的序列I所不)，该新基因的另一种剪辑形式可以编码得到序列表的序列3所示的蛋白质(命名为棉铃虫NPF2蛋白，如序列表的序列3所示)。相应的发现了来源于棉铃虫的编码NPFl蛋白的基因，命名为棉铃虫NPFl基因，如序列表的序列2所示(其开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第48-293位核苷酸)。相应的发现了来源于棉铃虫的编码NPF2蛋白的基因，命名为棉铃虫NPF2基因，如序列表的序列4所示(其开放阅读框为序列表的序列4自5’末端第48-413位核苷酸)。
[0090]实施例2、烟夜蛾NPF蛋白及其编码基因的获得
[0091 ] 将烟夜蛾代替棉铃虫进行实施例1，发现一个来源于烟夜蛾的新基因，该新基因的一种剪辑形式同样可以编码得到序列表的序列I所示的蛋白质(将其命名为烟夜蛾NPFl蛋白，序列与棉铃虫NPFl蛋白完全一致)，该新基因的另一种剪辑形式可以编码得到序列表的序列6所不的蛋白质(命名为烟夜蛾NPF2蛋白，如序列表的序列6所不)。相应的发现了来源于烟夜蛾的编码NPFl蛋白的基因，命名为烟夜蛾NPFl基因，如序列表的序列5所示(其开放阅读框为序列表的序列5自5’末端第70-315位核苷酸)。相应的发现了来源于烟夜蛾的编码NPF2蛋白的基因，命名为烟夜蛾NPF2基因，如序列表的序列7所示(其开放阅读框为序列表的序列7自5’末端第70-435位核苷酸)。
[0092]烟夜蛾脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定结果见图4。
[0093]烟夜蛾神经肽NPY基因的全长扩增产物的电泳图见图5。
[0094]实施例3、RNAi干扰载体的构建
[0095]一、棉铃虫RNAi干扰载体的构建[0096]1、提取5龄棉铃虫幼虫的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用NPFFor和NPFRev为模板，采用LA taq作为DNA聚合酶，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0097]
【权利要求】
1.一种蛋白质,是如下(a)或(b)或(C)或(d): Ca)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将(a)或(b)或(C)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下I)至10)中任一所述的DNA分子: 1)序列表的序列2自5’末端第48-293位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表的序列4自5’末端第48-413位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表的序列5自5’末端第70-315位核苷酸所不的DNA分子； 4)序列表的序列7自5’末端第70-435位核苷酸所不的DNA分子； 5)序列表的序列2所示的DNA分子； 6)序列表的序列4所示的DNA分子； 7)序列表的序列5所示的DNA分子； 8)序列表的序列7所不的DNA分子； 9)在严格条件下与I)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)限定的DNA序列杂交且与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子； 10)与I)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.抑制NPF基因表达的物质在如下(e)或(f)中的应用: (e)培育抗虫转基因植物； (f )制备抗虫剂； 所述NPF基因为编码如下(a)或(b)或(C)或(d)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将(a)或(b)或(C)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。
6.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将抑制NPF基因表达的物质导入出发植物，得到对昆虫抗性增强的转基因植物； 所述NPF基因为编码如下(a)或(b)或(C)或(d)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将(a)或(b)或(C)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。
7.如权利要求5所述的应用或如权利要求6所述的方法，其特征在于:权利要求5中的所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述抗虫为抗鳞翅目昆虫；权利要求6中的所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述昆虫为鳞翅目昆虫。
8.—种抗虫剂，它的活性成分为抑制NPF基因表达的物质； 所述NPF基因为编码如下(a)或(b)或(c)或(d)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将(a)或(b)或(C)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。
9.序列表的序列12所示的双链RNA分子、序列表的序列13所示的双链RNA分子、序列表的序列9所示的双链RNA分子或序列表的序列11所示的双链RNA分子。
10.具有特异DNA片段的干扰载体，所述特异DNA片段包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之间的间隔序列；所述DNA片段甲的序列与所述DNA片段乙的序列反向互补；所述DNA片段乙为NPF基因或其片段； 所述NPF基因为编码如下(a)或(b)或(c)或(d)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示 的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (d)将(a)或(b)或(c)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。
【文档编号】C07K14/435GK103665131SQ201210336702
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2012年9月12日
【发明者】赵章武, 刘晓光, 周子敬 申请人:中国农业大学